流式細(xì)胞儀的原理介紹

流式細(xì)胞儀的原理及應(yīng)用馬黎明生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院當(dāng)前第1頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)的基本概念流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是以流式細(xì)胞儀為檢測手段的一項(xiàng)能快速、精確的對單個(gè)細(xì)胞理化特性（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。當(dāng)前第2頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)最大的特點(diǎn)是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號對細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選。細(xì)胞不被破壞，測量快速、大量、準(zhǔn)確、靈敏、定量當(dāng)前第3頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)流式細(xì)胞儀的基本概念

流式細(xì)胞儀是測量染色細(xì)胞標(biāo)記物熒光強(qiáng)度的細(xì)胞分析儀，是集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。當(dāng)前第4頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)BDFACSCanto流式細(xì)胞分析儀

當(dāng)前第5頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)流式細(xì)胞儀的檢測范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量……細(xì)胞功能?細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原?細(xì)胞活性?細(xì)胞內(nèi)/外的細(xì)胞因子?激素結(jié)合位點(diǎn)?細(xì)胞受體?鈣離子濃度?線粒體膜電位?

……當(dāng)前第6頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)一、流式細(xì)胞儀的工作原理采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，保證檢測的靈敏度和特異性；用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對流動的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)信號進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測速度與統(tǒng)計(jì)分析精確性。當(dāng)前第7頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)1.流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)（1）液流系統(tǒng)（2）光學(xué)系統(tǒng)（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)當(dāng)前第8頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)（1）液流系統(tǒng)由樣本和鞘液組成待測細(xì)胞 單個(gè)細(xì)胞的懸液 熒光染料標(biāo)記的單抗對其染色受清潔氣體壓力 從樣品管進(jìn)入流動室形成樣本流鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細(xì)胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。

當(dāng)前第9頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)液流系統(tǒng)示意圖當(dāng)前第10頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)液流速度：低速、中速、高速低速：10ul/min;中速：60ul/min;高速：120ul/min.當(dāng)前第11頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)（2）光學(xué)系統(tǒng)由激光光源、分色反光鏡、光束成形器、透鏡組、濾片和光電倍增管組成。FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector當(dāng)前第12頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

主要由計(jì)算機(jī)和及其軟件（BDFASCDiva和BDModFitLTTM）組成。當(dāng)前第13頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)流式細(xì)胞儀與顯微鏡的區(qū)別區(qū)別流式細(xì)胞儀光學(xué)顯微鏡光源激光自然光、燈光對象細(xì)胞、生物粒子細(xì)胞、組織等承載工具鞘液及流動室載玻片檢測信號光學(xué)信號形態(tài)及染色放大方式PMT、放大電路目鏡×物鏡、光學(xué)放大統(tǒng)計(jì)計(jì)算機(jī)人工結(jié)果多參數(shù)，綜合分析簡單，單參數(shù)當(dāng)前第14頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)二、散射光的測量細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周圍360°立體角方向散射的光線信號，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。當(dāng)前第15頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)前向散射光（FS）

前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號用于檢測細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比。

通常在FCM應(yīng)用中，選取FS作閾值，來排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對被測細(xì)胞的干擾。當(dāng)前第16頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)前向散射光示意圖FALSSensorLaser當(dāng)前第17頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)側(cè)向散射光（SS）

側(cè)向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以90°角散射的訊號，用于檢測細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。當(dāng)前第18頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)側(cè)向散射光示意圖FALSSensor90LSSensorLaser當(dāng)前第19頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)

光散射測量的用途

測得的FS與SS信號通過計(jì)算機(jī)處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。此為血細(xì)胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群

當(dāng)前第20頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)三、熒光的測量熒光信號由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。每種熒光染料會產(chǎn)生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時(shí)測定一個(gè)細(xì)胞上的多個(gè)不同特征。當(dāng)前第21頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)熒光染料的特性激發(fā)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION)當(dāng)前第22頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)熒光信號的檢測使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量當(dāng)前第23頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)四、細(xì)胞分選原理

通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選主要是在對具有某種特征的細(xì)胞需進(jìn)一步培養(yǎng)和研究時(shí)進(jìn)行的。當(dāng)前第24頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)細(xì)胞分選示意圖細(xì)胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含細(xì)胞的液滴棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體產(chǎn)生機(jī)械振動不充電充電當(dāng)前第25頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)五、數(shù)據(jù)的顯示與分析參數(shù)：FS,SS,FL數(shù)據(jù)顯示方式（單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點(diǎn)圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數(shù)散點(diǎn)圖）設(shè)門分析技術(shù)當(dāng)前第26頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)（一）參數(shù)說明FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少當(dāng)前第27頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)（二）數(shù)據(jù)顯示方式直分析方圖單參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖:點(diǎn)圖二維等高圖假三維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析當(dāng)前第28頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)1.單參數(shù)直方圖

由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計(jì)數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。當(dāng)前第29頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)單參數(shù)直方圖細(xì)胞相對數(shù)量信道(channel)當(dāng)前第30頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)2.雙參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細(xì)胞的兩個(gè)測量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。雙參數(shù)信號通常采用對數(shù)信號，最常用的是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。當(dāng)前第31頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖綠色熒光強(qiáng)度紅色熒光強(qiáng)度當(dāng)前第32頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)（三）設(shè)門分析技術(shù)1.Gate設(shè)置：指根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。當(dāng)前第33頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)A淋巴細(xì)胞B單核細(xì)胞C中性粒細(xì)胞A、B、C均為任意門當(dāng)前第34頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)線性門當(dāng)前第35頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)

2.

區(qū)閾（Region設(shè)置）:

如十字門分析時(shí)，由四個(gè)區(qū)閾構(gòu)成，即G=D1+D2+D3+D4。

D1：CD4+/CD3-D2：CD4+/CD3+D3：CD4-/CD3-D4：CD4-/CD3+當(dāng)前第36頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)六、流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求

樣本制備標(biāo)記染色質(zhì)量控制當(dāng)前第37頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)（一）免疫樣品的制備培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備蛋白酶消化機(jī)械吹打使貼壁細(xì)胞脫落 洗滌尼龍網(wǎng)過濾單細(xì)胞懸液當(dāng)前第38頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)單細(xì)胞懸液的制備與保存新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備機(jī)械法酶處理法化學(xué)試劑處理法表面活性劑處理法單細(xì)胞懸液的保存深低溫保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）當(dāng)前第39頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)（二）常見的熒光染料名稱染料激發(fā)波長熒光顏色溶解性對PH敏感性特點(diǎn)異硫氰酸熒光素FITC488綠525易敏感易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性得州紅Texasred568紅615不易不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發(fā)光基團(tuán)，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復(fù)合染料PEcy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高當(dāng)前第40頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)（三）免疫熒光標(biāo)記熒光染料與細(xì)胞成分的四種結(jié)合方式

結(jié)構(gòu)親和式 嵌入結(jié)合 共價(jià)鍵結(jié)合 熒光標(biāo)記抗體特異性結(jié)合免疫熒光標(biāo)記方法

直標(biāo):干擾少,但需購買多種單抗 間標(biāo):步驟多,干擾多,不需標(biāo)記多種抗體

當(dāng)前第41頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)（三）流式細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)的質(zhì)量控制1.單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)控適當(dāng)?shù)闹苽浞绞綄?shí)體組織來源標(biāo)本用機(jī)械法溫度25-37℃，pH7.0-7.2當(dāng)前第42頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)2.免疫熒光染色的質(zhì)控溫度pH染料濃度固定劑當(dāng)前第43頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)3.儀器操作的質(zhì)控光路與流路校正:確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，減少變異（CV）。PMT（光電倍增管）校準(zhǔn):保證樣品檢測時(shí)儀器處于最佳靈敏度工作狀態(tài)。絕對計(jì)數(shù)校準(zhǔn):保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。當(dāng)前第44頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)4.免疫檢測的質(zhì)控同型對照：即免疫熒光標(biāo)記中的陰性對照，選用相同源性的未標(biāo)記單抗作為對照調(diào)整和設(shè)置電壓，以保證特異性。（通常采用未染色細(xì)胞作為陰性對照）全程質(zhì)量控制：同型對照與待測標(biāo)本一起標(biāo)記和檢測，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。當(dāng)前第45頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)七、流式細(xì)胞儀的科研應(yīng)用樹突細(xì)胞研究干細(xì)胞研究癌癥病人的多藥耐藥性細(xì)胞動力學(xué)功能研究環(huán)境微生物分析流式細(xì)胞術(shù)與分子生物學(xué)研究流式細(xì)胞術(shù)在免疫檢驗(yàn)中的應(yīng)用當(dāng)前第46頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)FCM在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用當(dāng)前第47頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)DNA細(xì)胞周期分析ScelldivisionG1(DNAsynthesis)G2M(mitosis)當(dāng)前第48頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)

細(xì)胞周期（cellcycle）G1期(DNA合成前期)從有絲分裂到DNA復(fù)制前的一段時(shí)期，此期主要合成RNA和核糖體。

S期(DNA合成期)除了合成DNA外，同時(shí)還要合成組蛋白。DNA復(fù)制所需要的酶都在這一時(shí)期合成。

G2期(DNA合成后期)大量合成RNA及蛋白質(zhì)，包括微管蛋白和促成熟因子等。M期（細(xì)胞分裂期）由一個(gè)母細(xì)胞分裂成為兩個(gè)子細(xì)胞。G0期（細(xì)胞休眠期）暫時(shí)離開細(xì)胞周期，停止細(xì)胞分裂，去執(zhí)行一定生物學(xué)功能的細(xì)胞所處的時(shí)期。

當(dāng)前第49頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)當(dāng)前第50頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)PI染色檢測細(xì)胞周期Protocol

離心收集細(xì)胞，棄上清，用PBS洗細(xì)胞兩次。加入預(yù)冷的70%乙醇，于40C固定過夜，或-200C長期固定。細(xì)胞染色：離心收集細(xì)胞，用1mlPBS洗細(xì)胞一次，加入500ulPBS（含50ug/ml溴化乙錠（PI），100ug/mlRNaseA,0.2%TritonX-100)40C避光孵育30分鐘。流式細(xì)胞儀檢測：一般細(xì)胞計(jì)數(shù)2-3萬個(gè)。結(jié)果用軟件Modfit分析。當(dāng)前第51頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)

ModfitLT分析細(xì)胞周期當(dāng)前第52頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)當(dāng)前第53頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)

細(xì)胞周期結(jié)果分析CV值：又稱為變異系數(shù)，一般CV值越小，峰型越好，越尖銳。能控制在5%左右是比較好的結(jié)果，一般小于10%就可以認(rèn)可了。G2/G1為1.82.（即G2期是四倍體細(xì)胞，而G1期是二倍體細(xì)胞，比值應(yīng)為1.8-2.0之間。若小于1.8，則細(xì)胞染色不充分。當(dāng)前第54頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)Pengzhang;FreeRadicalResearch,2009,43(3):224-233.當(dāng)前第55頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)細(xì)胞凋亡的檢測細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞膜通透性的變化(Hoechest33342和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）Caspases激活(Caspase-3)

線粒體跨膜電位降低(Rhodamine123）膜磷脂酰絲氨酸外化(AnnexinV-FITC/PI)Ca2+濃度升高(Fluo-3）DNA斷裂及含量的變化(TUNEL和PI）當(dāng)前第56頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)

FCM檢測細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)

FCM能鑒別及定量分析凋亡細(xì)胞，揭示凋亡相關(guān)的分子及其功能機(jī)制，測定凋亡細(xì)胞功能特征的變化，并能對細(xì)胞的多個(gè)特征同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)測量，還具有簡便、快速、檢測所需細(xì)胞量少等優(yōu)點(diǎn).當(dāng)前第57頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)

Annexin-V和PI雙染protocol

細(xì)胞用冷PBS洗滌二次并在恰當(dāng)?shù)娜旧彌_液（bindingbuffer）中以1x106細(xì)胞/mL的濃度重懸吸取100ul的細(xì)胞(1x105)至試管中。加進(jìn)適量的熒光標(biāo)記的annexin-V試劑和PI。混勻后避光室溫下孵育15分鐘。（必須在室溫下進(jìn)行）孵育后加進(jìn)400ul染色緩沖液，立即上流式細(xì)胞儀分析。當(dāng)前第58頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)

Annexin-V和PI雙染的特點(diǎn)和注意事項(xiàng)檢測特點(diǎn)：簡便，快速，準(zhǔn)確區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。注意事項(xiàng)：1.細(xì)胞制備（如貼壁細(xì)胞）和儲存時(shí)細(xì)胞膜的破損會導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸(PS)跨膜分布的改變，造成假陽性。2.染色后立即上機(jī)檢測。當(dāng)前第59頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)EffectofPQQonMeHg-induceddistributivechangeofearlyandlateapoptoticcells.(A)control.(B)PC12cellsweretreatedwithMeHgfor4h.(C)Cellswerepre-treatedwithPQQfor30minandthenwereexposedtoMeHgfor4h當(dāng)前第60頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)Q3:正常細(xì)胞；Q4：早期凋亡細(xì)胞；Q2：晚期凋亡細(xì)胞；Q1：壞死細(xì)胞。當(dāng)前第61頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)熒光補(bǔ)償當(dāng)前第62頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)當(dāng)前第63頁\共有71頁\編于星期五\10點(diǎn)