BD流式細(xì)胞儀全面介紹課件

流式細(xì)胞術(shù)簡介王苗苗流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,簡稱FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時(shí)檢測單個(gè)微粒（通常是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性的技術(shù)，同時(shí)可以對特定群體加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、染色體、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量流式細(xì)胞儀的工作原理待測細(xì)胞以單個(gè)細(xì)胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色，放入樣品管，吸入流動(dòng)室。

流動(dòng)室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。細(xì)胞排成單列由噴嘴中心噴出，形成細(xì)胞液柱。

流式細(xì)胞儀的工作原理

液柱與激光束相交，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光。熒光信號(hào)變成電信號(hào)輸出到計(jì)算機(jī)，軟件分析。流式細(xì)胞儀可檢測到的細(xì)胞參數(shù)非熒光信號(hào)顆粒度細(xì)胞大小前向角散射光（FSC）細(xì)胞相對大小及其表面積側(cè)向角散射光（SSC）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對復(fù)雜性前向角散射光——FSCFALSSensorLaser側(cè)向角散射光——SSCFALSSensor90LSSensorLaser散射光能被用來區(qū)分不同細(xì)胞群體的基本形態(tài)上的差異

- 通常使用“散點(diǎn)圖”來看散射光信號(hào)

- 散點(diǎn)圖上的一個(gè)點(diǎn)就代表一個(gè)細(xì)胞顆粒的數(shù)據(jù)熒光強(qiáng)度（FL）：細(xì)胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無熒光標(biāo)記的區(qū)分開來（陰陽）高FL細(xì)胞與低FL細(xì)胞區(qū)分開來（強(qiáng)弱）一般的流式細(xì)胞儀只裝有一個(gè)激光光源（488nm），可測出三個(gè)FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細(xì)胞儀裝有兩個(gè)或三個(gè)激光光源（488nm、633nm和325nm），可測出6個(gè)FL。熒光信號(hào)熒光檢測器FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector

定量染色熒光信號(hào)大小

被標(biāo)記組分含量的定量多熒光標(biāo)記胞內(nèi)多種組分，實(shí)現(xiàn)多參數(shù)測量熒光信號(hào)與細(xì)胞特性光電倍增管（PMT），用來檢測從細(xì)胞發(fā)出的不同顏色的熒光信號(hào)雙色反光鏡，通過反射一定范圍的光，透過其余光來實(shí)現(xiàn)分離作用濾光片，能透過一定波長的光，但是沒有反射功能，放著角度是與光束成90度。參與信號(hào)處理的光學(xué)元件460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50

Longpass

Shortpass

Bandpass濾光片F(xiàn)ACSCalibur光路圖LaserFluorochromesDetectorParameterFilterFITCGFPFL1530/30PEPIFL2585/42PerCPPerCP-CY5.5FL3670LPAPCFL4661/16488nm635nmFCM測量數(shù)據(jù)的顯示與分析幾個(gè)概念：%Gated：陽性細(xì)胞百分比。反映細(xì)胞群體中陽性細(xì)胞的數(shù)量。脈沖寬度（pulsewidth）表示細(xì)胞的粘連情況脈沖面積（pulsearea）主要用于DNA的含量測定FL1、…..、FL13等表示細(xì)胞在各檢測波長的熒光信號(hào)Time

VoltsPulseAreaPulseHeightPulseWidth0FL2-A表示在FL2通道上以熒光強(qiáng)度對細(xì)胞數(shù)作積分，用面積來計(jì)算處于不同時(shí)相的細(xì)胞的總數(shù)。數(shù)據(jù)顯示:

直方圖、二維點(diǎn)圖、等高線圖、密度圖、三維圖等,

最常用的為散點(diǎn)圖和直方圖。圖報(bào)告中常見的幾種流式細(xì)胞圖散點(diǎn)圖密度圖二維等高圖直方圖圖AnnexinV/PI雙標(biāo)記分析細(xì)胞凋亡和壞死單參數(shù)直方圖每一個(gè)細(xì)胞單參數(shù)的測量數(shù)據(jù)可整理成分布統(tǒng)計(jì)，以分布直方圖(distributionhistogram)來顯示。在圖中，橫坐標(biāo)表示熒光信號(hào)或散射光信號(hào)相對強(qiáng)度的值，橫坐標(biāo)可以是線性的，也可以是對數(shù)的，縱坐標(biāo)一般是細(xì)胞數(shù)。直方圖分析雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示是用于表達(dá)來自同一細(xì)胞兩個(gè)參數(shù)與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系，常用的表達(dá)方法有二維點(diǎn)圖(dotplot)、等高線圖(contourplot)、二維密度圖(densityplot)。在二維圖中，x坐標(biāo)為某細(xì)胞一個(gè)參數(shù)的數(shù)值，而Y坐標(biāo)為該細(xì)胞另一參數(shù)的數(shù)值。從雙參數(shù)圖形中可以將各細(xì)胞亞群區(qū)分開，同時(shí)可獲得細(xì)胞相關(guān)的重要信息。外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖等高圖和密度圖分析三維圖分析細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞粒度細(xì)胞表面面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量染色體分析細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子酶活性激素結(jié)合位點(diǎn)細(xì)胞受體細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀的細(xì)胞學(xué)應(yīng)用流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用HIV免疫分型，CD4絕對計(jì)數(shù)白血病和淋巴瘤的免疫分型腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測干細(xì)胞計(jì)數(shù)殘量白血病細(xì)胞檢查HLA-B27檢查血小板功能及相關(guān)疾病細(xì)胞DNA,RNA含量的測定染色體倍體分析染色體分離基因表達(dá)產(chǎn)物的生物活性研究基因轉(zhuǎn)染表達(dá)的生物效應(yīng)基因表達(dá)調(diào)控研究細(xì)胞內(nèi)基因定位酵母轉(zhuǎn)基因株的篩選報(bào)告基因的定性定量檢測植物遺傳學(xué)研究??????流式細(xì)胞儀的遺傳學(xué)應(yīng)用Flowcytometryofapoptoticcelldeath細(xì)胞散射光在細(xì)胞調(diào)亡中，細(xì)胞收縮，從而FSC下降，SSC上升或是沒有明顯變化Flowcytometryofapoptoticcelldeath熒光吸收細(xì)胞的胞膜對于DNA染料的通透性和細(xì)胞的活性、死亡和凋亡相關(guān)，像PI、EB、Hoechst-33342等，可以用來區(qū)分活細(xì)胞、死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞Viabilitywasmeasuredasimpermeabilitytopropidiumiodide.Flowcytometryofapoptoticcelldeath細(xì)胞DNA含量

在凋亡細(xì)胞中，用PI染色，通過流式檢測DNA含量，可以發(fā)現(xiàn)一種亞群的細(xì)胞，其染色熒光強(qiáng)度下降。這是由于隨著調(diào)亡的進(jìn)行，核酸內(nèi)切酶活化，隨后一部分DNA泄漏出去，造成細(xì)胞內(nèi)DNA含量下降造成的。DNA細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期G2MG0G1s

200

400

600

8001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細(xì)胞數(shù)量2N4N

Flowcytometryofapoptoticcelldeath線粒體功能的變化使用有膜穿透性的親脂性陽離子熒光染料，如Rho123,DiOC6,JC-1等，可作為流式