演示文稿免疫組化技術(shù)

演示文稿免疫組化技術(shù)當(dāng)前第1頁\共有32頁\編于星期四\8點（優(yōu)選）免疫組化技術(shù)當(dāng)前第2頁\共有32頁\編于星期四\8點組織化學(xué)的基本概念：

組織化學(xué)：組織水平，對組織內(nèi)存在的各種物質(zhì)進(jìn)行定性、定量以及其局部的和移動的部位分析的方法

免疫組織化學(xué)：基于抗原抗體反應(yīng)酶組織化學(xué)當(dāng)前第3頁\共有32頁\編于星期四\8點疾病的病理學(xué)研究概括起來主要在基因和蛋白水平上進(jìn)行的研究。

免疫組織化學(xué)方法主要用于基因蛋白質(zhì)水平表達(dá)的研究。蛋白表達(dá)=>分布，定位，定量；蛋白表達(dá)與與腫瘤生物學(xué)行為及預(yù)后關(guān)系等當(dāng)前第4頁\共有32頁\編于星期四\8點材料：抗體：多克隆抗體：為針對多個抗原決定簇的抗體，為產(chǎn)生抗體的動物血清或免疫球蛋白。單克隆抗體：為一個B淋巴細(xì)胞分化增殖產(chǎn)生的抗體，可識別有限的抗原決定簇，特異性強(qiáng)。當(dāng)前第5頁\共有32頁\編于星期四\8點顯示物：酶標(biāo)反應(yīng)：①堿性磷酸酶（Alkatinephasphotase,AP）AP與不同的底物（萘酚As-Mx、快藍(lán)、快紅）作用，可形成不同顏色的終產(chǎn)物。用新品紅（Newfuchsine）顯色，可形成不溶于有機(jī)溶劑的紅色沉淀，不褪色。②辣根過氧化酶(Horseradiseperoaidase,)HRP：底物為DAB－四鹽酸二氨基聯(lián)苯胺，產(chǎn)生棕色沉淀，不溶于有機(jī)溶劑，不褪色。當(dāng)前第6頁\共有32頁\編于星期四\8點熒光標(biāo)記：熒光素標(biāo)記抗體異硫氰酸熒光素（Fluorescienisothioyarale,FITC）520－530nm四甲基異硫氰酸羅達(dá)明（Teramethylerhodamineisothiecyanata,TRITC）620nm四乙基羅達(dá)明（TeraethylerhodamineB200,RB200）590－600nm當(dāng)前第7頁\共有32頁\編于星期四\8點膠體金：指金的水溶膠（以微小粒子分散在水溶液中，免疫電鏡觀察當(dāng)前第8頁\共有32頁\編于星期四\8點主要方法：直接法：間接法：經(jīng)過了第二抗體放大效應(yīng)當(dāng)前第9頁\共有32頁\編于星期四\8點PAP法：以過氧化物酶和抗過氧化酶抗體形成復(fù)合物，通過第二抗體的橋接與第一抗體結(jié)合，然后以酶底物反應(yīng)檢出。當(dāng)前第10頁\共有32頁\編于星期四\8點ABC法：生物素（Biotin）和卵白素（Avidin）為具有高度親合性的物質(zhì)，一個卵白素分子可結(jié)合4個生物素。當(dāng)生物素標(biāo)上特定的標(biāo)記物質(zhì)后or與抗體結(jié)合后仍能與卵白素結(jié)合，因此，將抗體結(jié)合上生物素，然后與卵白素和帶有特殊標(biāo)記物的生物素的結(jié)合反應(yīng)，而以適當(dāng)方式顯示。當(dāng)前第11頁\共有32頁\編于星期四\8點S-P法（LSAB）：采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉素生物素蛋白連接的過氧化物酶及基質(zhì)素（底物）混合液來測定細(xì)胞和組織中的抗原。當(dāng)前第12頁\共有32頁\編于星期四\8點Envision：原理：第二抗體上標(biāo)記有多聚物酶（HRPorAP）復(fù)合物與第一抗體結(jié)合。二抗上的多聚物可結(jié)合許多的HRP分子，使信號有顯著提高，敏感性較PAP法，ABC法高出幾十倍，背景因多聚物葡聚糖是人體內(nèi)不存在，無非特異性干擾，尤其是多聚物酶分子結(jié)合的第二抗體孵育時間短，該方法更省時，簡便。當(dāng)前第13頁\共有32頁\編于星期四\8點以LSAB法為例簡單介紹染色步驟：①石蠟切片脫蠟－水；②3%H202抑制內(nèi)源性過氧化物酶15min；③每張切片加10-20ul非免疫性動物血清，室溫孵育5min；④加特異性一抗，370C孵育30－60min，or40C過夜；⑤加20ul生物素標(biāo)記的第二抗體，370C

，30min；當(dāng)前第14頁\共有32頁\編于星期四\8點⑥加過氧化物酶標(biāo)定的鏈菌素親生物素，370C，30min；⑦以上每步后均用PBS液洗3×3min；⑧用過氧化物酶基質(zhì)液（DAB基質(zhì)液）顯色5－15min。在光鏡下觀察。⑨自來水沖洗，蘇木素淺染，自來水沖洗還藍(lán)，梯度酒精脫水，干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。當(dāng)前第15頁\共有32頁\編于星期四\8點免疫組化常見問題的處理：組織材料的處理：固定液為：10%中性福爾馬林液；4%多聚甲醛磷酸緩沖液（PH7.4）；固定時間：8-24hr組織大?。?*1.5*0.3cm當(dāng)前第16頁\共有32頁\編于星期四\8點防脫片處理：多聚-L-賴氨酸；硫酸鉻鉀明膠液。當(dāng)前第17頁\共有32頁\編于星期四\8點增強(qiáng)特異性染色的措施和方法：

1）蛋白酶消化：a、胰蛋白酶消化（0.05-0.1%）；b、胃蛋白酶消化（0.4%）。2）熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)：方法：微波960C,10min；直接加溫方法1000C,10min；高壓鍋1200C,10min；熱處理液：0.01mol/LPH6.0檸檬酸緩沖液當(dāng)前第18頁\共有32頁\編于星期四\8點合適的抗體稀釋度：

過高，過低均會導(dǎo)致陰性結(jié)果。即用型抗體；濃縮型。當(dāng)前第19頁\共有32頁\編于星期四\8點減少或消除非特異性染色的方法：非特異性染色：原因：方法：當(dāng)前第20頁\共有32頁\編于星期四\8點對照：

陽性對照：用一直抗原陽性的切片與待測標(biāo)本同時進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，陽性對照應(yīng)呈陽性結(jié)果，即為陽性對照。陰性對照：用不含一直抗原的標(biāo)本作對照，實驗結(jié)果為陰性，即為陰性對照。陰性對照中還包括空白對照、替代對照、吸收和抑制對照等，用以排除假陽性結(jié)果。當(dāng)前第21頁\共有32頁\編于星期四\8點染色特異性染色非特異性染色顯色部位特定細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)均勻染色或更強(qiáng)顯色定位特定，具有結(jié)構(gòu)性無特定部位，無結(jié)構(gòu)性顯色程度同一部位呈不同程度顯色無分布規(guī)律，某一片均勻著色

免疫組織化學(xué)的結(jié)果判斷應(yīng)非常嚴(yán)謹(jǐn)，陽性細(xì)胞的染色分布有三種類型：胞漿型、細(xì)胞核型和細(xì)胞膜表面型。陽性細(xì)胞顯色深淺可反映出抗原的濃度，并以此作為定性、定量和定位的依據(jù)。陽性細(xì)胞的染色常定位于細(xì)胞，并于陰性細(xì)胞間有明顯間隔，而非特異性染色常不限于單個細(xì)胞，而是累及一片細(xì)胞，兩者可顯著區(qū)別。當(dāng)前第22頁\共有32頁\編于星期四\8點陽性細(xì)胞的染色特征：

①陽性細(xì)胞的染色分布有三種：

胞漿；細(xì)胞核；細(xì)胞膜表面②陽性細(xì)胞分布：灶性；彌漫性③染色強(qiáng)度不一④切片邊緣，刀痕or組織折疊，壞死，擠壓區(qū)，膠原結(jié)締組織等常表現(xiàn)為相同的陽性染色強(qiáng)度。對于陽性結(jié)果的定量判斷：-，+，++，+++等分級和計數(shù)統(tǒng)計

當(dāng)前第23頁\共有32頁\編于星期四\8點淋巴細(xì)胞標(biāo)記物：白細(xì)胞共同抗原（LCA,CD45）：主要分布于T,B細(xì)胞，單核細(xì)胞，粒細(xì)胞表面。CD20：B細(xì)胞標(biāo)記物。CD45RO、CD3：T細(xì)胞標(biāo)記物。CD57：為自然殺傷細(xì)胞的標(biāo)記物。CD38：為漿細(xì)胞的標(biāo)記物。CD68：主要標(biāo)記各種組織中的巨噬細(xì)胞。當(dāng)前第24頁\共有32頁\編于星期四\8點神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)記物：嗜鉻素A（Chromogranin,CgA）：存在于神經(jīng)元，神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞及其腫瘤中。突觸素（Synaptophysin,Sy）：存在于神經(jīng)元突觸前囊泡膜上，腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中。髓磷脂鹼性蛋白（Myelinbasicprotein,MBP）：

當(dāng)前第25頁\共有32頁\編于星期四\8點激素及激素受體類標(biāo)記：雄激素受體（Androgenreceptor,AR）：雌激素受體（Estrogenreceptor,ER）孕激素受體（Progesteronereceptor,PR）：垂體激素：ACTH,GH,PRL,LH,TSH主要用于垂體腺瘤的功能分類。降鈣素（Calcitotin,CT）：甲狀腺旁細(xì)胞（C細(xì)胞）分泌。

當(dāng)前第26頁\共有32頁\編于星期四\8點以上抗體及標(biāo)記物主要用于疾病的病理診斷和鑒別診斷其聯(lián)合應(yīng)用的作用和意義：Keratin＋Vimentin－上皮性腫瘤Keratin＋滑膜腫瘤Vimentin＋間皮腫瘤上皮樣肉瘤癌肉瘤當(dāng)前第27頁\共有32頁\編于星期四\8點Des＋orActin＋肌源性腫瘤

CD34＋orFⅧ＋血管性腫瘤

Keratin－S-100＋orMBP＋神經(jīng)鞘膜瘤Vimentin＋LCA＋淋巴細(xì)胞

AACT＋骨腫瘤、纖維組織細(xì)胞腫瘤

GFAP＋膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤

Keratin－NSE＋orSy＋Vimentin－NF－／＋節(jié)細(xì)胞神經(jīng)母細(xì)胞瘤當(dāng)前第28頁\共有32頁\編于星期四\8點免疫組化用于病理診斷及鑒別診斷原則：①免疫組化用于病理診斷及鑒別診斷，必須以HE染色的形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，免疫組化只能作為輔助手段。不能把免疫組化染色作為診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。②免疫組化對良、惡性的判斷僅供