HPLC中常用的檢測(cè)器課件

HPLC中常用的檢測(cè)器1:紫外-可見光（UV-VIS）檢測(cè)器工作原理：基于Lambert-Beer定律，即被測(cè)組分對(duì)紫外光或可見光具有吸收，且吸收強(qiáng)度與組分濃度成正比A=lgIo/I=εbc

其中A為吸光度（消光值）,Io為入射光強(qiáng)，I為透射光強(qiáng)，ε為樣品的吸光度（消光系數(shù)）b為光程長(zhǎng)，c為樣品濃度。

通用型檢測(cè)器約有80％的分析樣品具有紫外吸收,可以使用這種檢測(cè)器檢測(cè)。2優(yōu)點(diǎn):a:靈敏度高，檢測(cè)下限約為10-6g／mlb:線性范圍廣

C:對(duì)溫度和流速不敏感，適于進(jìn)行梯度洗脫3限制:a:沒有紫外吸收的物質(zhì)不能檢測(cè)b:應(yīng)盡可能選擇在檢測(cè)波長(zhǎng)下沒有背景吸收的流動(dòng)相(限制了一些一些截止波長(zhǎng)在200~300nm之間的良好溶劑的使用)42:熒光檢測(cè)器原理:物質(zhì)的分子或原子經(jīng)光照射后，有些電子被激發(fā)至較高的能級(jí)，這些電子從高能級(jí)躍至低能級(jí)時(shí)，物質(zhì)會(huì)發(fā)出比入射光波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光，這種光稱為熒光。熒光檢測(cè)器就是在樣品的激發(fā)波長(zhǎng)處檢測(cè)發(fā)射光的強(qiáng)弱.在樣品濃度足夠低時(shí),下，熒光強(qiáng)度與如射光強(qiáng)度,量子效率及樣品濃度成線形關(guān)系。熒光強(qiáng)度:F=I0εφ

LC

熒光檢測(cè)器是一種選擇性檢測(cè)器不到20%的物質(zhì)使用這種檢測(cè)手段,許多藥物如喹諾酮類藥物采用這種檢測(cè)方法.5在垂直的方向上進(jìn)行檢測(cè)6優(yōu)點(diǎn):a:靈敏度非常高(靈敏度在目前常用的HPLC檢測(cè)器中最高

)，其檢出限可達(dá)10-9g/ml，(比紫外檢測(cè)器高2—3個(gè)數(shù)量級(jí)，適合于痕量分析)b:可以用于梯度洗脫c:對(duì)儀器的穩(wěn)定性（如溫度和壓力的穩(wěn)定性）依賴較小d:選擇性好，優(yōu)于紫外例子：花生醬提取物中衡量黃曲霉素的熒光檢測(cè)法7缺點(diǎn):

a:適用范圍有一定的局限性

–只適用于有熒光基團(tuán)＆衍生化之后有熒光基團(tuán)的化合物

b:定量分析時(shí)線性范圍較窄

它適合于稠環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素、蛋白質(zhì)等熒光物質(zhì)的測(cè)定83:二極管陣列檢測(cè)器（diode-arraydetector,DAD）原理:光電二極管陣列（或CCD陣列，硅靶攝像管等）作為檢測(cè)元件的UV-VIS檢測(cè)器。它可構(gòu)成多通道并行工作，同時(shí)檢測(cè)由光柵分光，再入射到陣列式接受器上的全部波長(zhǎng)的信號(hào)，然后，對(duì)二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到的是時(shí)間、光強(qiáng)度和波長(zhǎng)的三維譜圖。１９７６年Ｎilano等人首先報(bào)道這種檢測(cè)器，它不必停留就可獲得“在流”色譜的全部光譜信息，可跟隨色譜峰掃描，用來(lái)觀察色譜柱流出組分的每個(gè)瞬間的動(dòng)態(tài)光譜吸收?qǐng)D．由于比其他快速掃描檢測(cè)器具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，工作可靠，性能好的優(yōu)點(diǎn)，自一問世，就得到迅速發(fā)展．9結(jié)構(gòu)：核心是二極管陣列元件，它由一系列光敏二極管蝕刻在硅片上組成．一般，每個(gè)陣列又２００～１０２４個(gè)光電二極管組成，他們的光敏范圍是２００～６００nm，每只二極管的分辨率是１～２nm，光電二極管越多，分辨率越高．陣列的每一單元有一只光敏二極管和一只與之并聯(lián)的電容器．光電二極管紫外檢測(cè)器n個(gè)單元同時(shí)檢測(cè)，從而使采樣時(shí)間減少到普通的１／Ｎ．使用２１１個(gè)二極管的陣列元件，最快時(shí)，每１０ms可完成一次測(cè)量．每秒中可以收集２００００～１０００００個(gè)數(shù)據(jù)．1011與普通UV-VIS檢測(cè)器不同之處:a:普通UV-VIS檢測(cè)器是先用單色器分光，只讓特定波長(zhǎng)的光進(jìn)入流動(dòng)池。而二極管陣列UV-VIS檢測(cè)器是先讓所有波長(zhǎng)的光都通過(guò)流動(dòng)池，然后通過(guò)一系列分光技術(shù)，使所有波長(zhǎng)的光在接受器上被檢測(cè).b:普通UV-VIS檢測(cè)器只能得到二維的譜圖,而DAD可以得到三維圖譜.1213應(yīng)用a:色譜峰純度檢查比較光譜法吸收比法雙波長(zhǎng)法b:色譜峰鑒定與標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)光譜比較正常紫外光譜的比較三維色譜能提供更多全面的信息。144:電化學(xué)檢測(cè)器理論基礎(chǔ)

a:法拉第第一定律

在電介過(guò)程中，電極上起反應(yīng)的物質(zhì)量（W）與通過(guò)電介池的電量（Q）成正比。

b:法拉第第二定律

各種不同的電介質(zhì)溶液中，通過(guò)相同的電量時(shí)，電極上析出的電極產(chǎn)物的當(dāng)量數(shù)相同。（96487庫(kù)侖）15優(yōu)點(diǎn):

a:專用型檢測(cè)器,具很強(qiáng)的專屬性。

b:線性范圍可達(dá)106，寬廣

c:高靈敏度10-12g/l，可與熒光相比，16缺點(diǎn):

a:只能測(cè)定具有電解活性（電氧化一還原性）物質(zhì)

b:要求洗脫液具有導(dǎo)電性（可向洗脫液中加入少量電解質(zhì)，或在柱后補(bǔ)加適量電解質(zhì)溶液，這并不影響分離效率）現(xiàn)在在藥物分析領(lǐng)域里面已經(jīng)沒有其他方法常用了.175:示差折光檢測(cè)器(RID)原理:化合物的折光率不同,光會(huì)偏轉(zhuǎn)。光偏轉(zhuǎn)的程度與樣品的濃度成正比。根據(jù)不同濃度的物質(zhì)具有不同折射率來(lái)進(jìn)行組分檢測(cè)的。溶液的折射率是溶劑（流動(dòng)相）和溶質(zhì)（樣品）各自的折射率乘以各自的摩爾濃度之和．溶有樣品的流動(dòng)相與流動(dòng)相本身之間折射率之差就表示樣品在流動(dòng)相中的濃度．原則上，凡是與流動(dòng)相折射指數(shù)有差別的樣品都可以測(cè)定它的濃度．

通用型檢測(cè)器(濃度檢測(cè)器)檢測(cè)限可達(dá)１０－６～１０－７g/ml18優(yōu)點(diǎn):通用性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便19缺點(diǎn):

a:靈敏度低

b:過(guò)于嬌貴---室溫的變化會(huì)影響基線的穩(wěn)定性,大的溶劑前沿峰可能會(huì)掩蓋前期脫洗的色譜峰20注意事項(xiàng):a:洗脫液的組成一定要恒定，不能使用梯度洗脫。

b:不能使檢測(cè)池帶壓工作，在與其它檢測(cè)器串聯(lián)使用時(shí)應(yīng)放在最后。

c:流速要恒定，泵的流速波動(dòng)要小于0.5％，使用往復(fù)泵時(shí)要用阻尼裝置。

d:溫度要恒定，恒溫控制要達(dá)±10-4℃,在使用時(shí)預(yù)熱時(shí)間要充足，否則基線漂移十分嚴(yán)重。216:蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)原理:色譜柱流出液進(jìn)入霧化器形成微小液滴，與通入的氣體(通常是氮?dú)?，有時(shí)也用空氣)混合均勻，經(jīng)過(guò)加熱的漂移管，蒸發(fā)除去流動(dòng)相，樣品組分形成氣溶膠，用強(qiáng)光或激光照射氣溶膠，產(chǎn)生光散射，用光電二極管檢測(cè)散射光。散射光的強(qiáng)度(I)與組分的質(zhì)量(m)有下述關(guān)系：I=km或lgI=blgm+lgk其中k和b為與蒸發(fā)室(漂移管)溫度、霧化氣體壓力及流動(dòng)相性質(zhì)等實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)的常數(shù)。22ELSD最大的優(yōu)越性在于能檢測(cè)不含發(fā)色團(tuán)的化合物:如：碳水化合物、脂類、聚合物、未衍生脂肪酸和氨基酸、表面活性劑、藥物，并在沒有標(biāo)準(zhǔn)品和化合物結(jié)構(gòu)參數(shù)未知的情況下檢測(cè)未知化合物。響應(yīng)不依賴與樣品的光學(xué)特性，任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品均能被檢測(cè)，不受其官能團(tuán)的影響。ELSD的響應(yīng)值與樣品的質(zhì)量成正比，因而能用于測(cè)定樣品的純度或者檢測(cè)未知物。23發(fā)展歷程:第一臺(tái)ELSD是由澳大利亞的UnionCarbide研究實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家研制開發(fā)的，并在八十年代初轉(zhuǎn)化為商品.八十年代以激光為光源的第二代ELSD面世.現(xiàn)在ELSD越來(lái)越多的作為通用型檢測(cè)器用于高效液相色譜，超臨界色譜（SFC）和逆流色譜中.目前主要有4種商品化的ELSD，即：Sedex，Eurosep，PL-ELS和Alltech。24PL-ELS2100組分進(jìn)入檢測(cè)器的入口25結(jié)構(gòu):商品化的ELSD都是三部分組成，即霧化器、加熱漂移管和光散射池。

a:霧化器與分析柱出口直接相連，柱洗脫液進(jìn)入霧化器針管，在針的末端，脫洗液和充入的氣體（通常為氮?dú)猓┗旌闲纬删鶆虻奈⑿∫旱危赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)氣體和流動(dòng)相的流速來(lái)調(diào)節(jié)霧化器產(chǎn)生的液滴的大小。

b:漂移管的作用在于使氣溶膠中的易揮發(fā)組分揮發(fā)，流動(dòng)相中的不揮發(fā)成分經(jīng)過(guò)漂移管進(jìn)入光散射池。

c:在光散射池中，樣品顆粒散射光源發(fā)出的光經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)產(chǎn)生光電信號(hào)。ELSD采用的光源一般為鹵素?zé)?/p>

2627ELSD檢測(cè)只要分為三個(gè)步驟：（1）用惰性氣體(一般是用N2)霧化脫洗液:（2）流動(dòng)相在加熱管（漂移管）中蒸發(fā):（3）樣品顆粒散射光后得到檢測(cè):28重要參數(shù)與影響ＥＬＳＤ的因素:

a:霧化室溫度:影響不大

b:氮?dú)饬魉?氣體流速增大，使響應(yīng)值減小，故最佳氣體流速是在可以接受的噪聲基礎(chǔ)上所產(chǎn)生的最大檢測(cè)響應(yīng)值的最低氣體流速。

c:漂移管溫度:溫度過(guò)低則流動(dòng)相得不到充分揮發(fā)，使基線水平較高；溫度過(guò)高則可能帶來(lái)更大的噪聲。最佳溫度是在流動(dòng)相基本揮發(fā)的基礎(chǔ)上產(chǎn)生可接受噪音的最低溫度．

d:流動(dòng)相流速:

鹽對(duì)基線噪音的影響：對(duì)于高濃度的鹽，鹽的不完全揮發(fā)會(huì)造成基線增高，使樣品響應(yīng)值受氣體流速的影響相對(duì)變?。粚?duì)于低濃度的鹽，鹽的完全揮發(fā)使響應(yīng)值受其影響較大．所以，對(duì)用做緩沖液的鹽，既要容易揮發(fā)，又要具有好的純度．一般鹽的揮發(fā)性越大，所需的氣體流速和漂移管溫度越低！29特點(diǎn):因?yàn)镋LSD在檢測(cè)前將流動(dòng)相蒸發(fā)，所以基線的噪聲和漂移都很小，因此基線穩(wěn)定和樣品檢測(cè)的靈敏度高。流動(dòng)相的蒸發(fā)使得ELSD和梯度脫洗相容，因而可提高色譜分離的分辨率和縮短分離時(shí)間。不像紫外檢測(cè)器，ELSD的激光源無(wú)需更換，大大降低了運(yùn)行成本。

要求更低的氣體壓力和氣體流速(1L/min)，可以使用氣瓶，空壓機(jī)或氣體發(fā)生器。30ELSD與UV-D比較:a:UV檢測(cè)的主要缺點(diǎn)在于紫外不吸收的化合物靈敏度很低。ELSD可以檢測(cè)任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品。b:ELSD的通用性響應(yīng)值使得ELSD響應(yīng)值比UV響應(yīng)值更能代表樣品的質(zhì)量

c:不同于紫外檢測(cè)只能使用不吸收紫外的流動(dòng)相，ELSD能與任何的揮發(fā)性流動(dòng)相相容，不論其光學(xué)特性。用紫外檢測(cè)器定量未知物是困難的，因?yàn)闃悠返淖贤馕罩低痛順悠返馁|(zhì)量的色譜峰的大小無(wú)關(guān)。ELSD對(duì)幾乎所有的樣品給出一致的響應(yīng)因子。因此可以通過(guò)和內(nèi)標(biāo)比較定量未知化合物，在因缺乏標(biāo)準(zhǔn)品而無(wú)法校正曲線的情況下，利用ELSD可以近似的提供不純物的定量測(cè)定。31ELSD可以檢測(cè)出UV圖譜檢測(cè)不出的峰:32ELSD與示差折光檢測(cè)器比較:ELSD優(yōu)點(diǎn):

a:靈敏度大大提高，S/N高5-10倍,檢測(cè)限可達(dá)ng級(jí)

b:能進(jìn)行梯度脫洗–是多成分分析中強(qiáng)有力的檢測(cè)手段

c:對(duì)環(huán)境溫度變化不敏感,

d:基線穩(wěn)定,不會(huì)產(chǎn)生漂移缺點(diǎn):a:RID上使用的流動(dòng)相不受特殊的制約，但是，ELSD由于以流動(dòng)相揮發(fā)為大前提，限定為揮發(fā)性物質(zhì)(不能使用磷酸緩沖液等)b:RID可在寬廣的范圍內(nèi)取得直線性，而ELSD由于原理上物質(zhì)量與散射強(qiáng)度成為指數(shù)關(guān)系，必需采用雙對(duì)計(jì)算使工作曲線線性化。33ELSD的基線更加平穩(wěn):34ELSD與HPLC-MS的關(guān)系:ELSD與HPLC—MS的色譜要求一致，二者可通用。

在脫機(jī)的情況下，使用HPLC/ELSD不僅可以為L(zhǎng)C/MS摸索色譜條件下，節(jié)省昂貴的LC/MS系統(tǒng)的操作成本，而且可以方便的用LC/MS來(lái)分析檢測(cè)出的不純物，進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。35同一個(gè)樣品分別用ELSD＆LC-MS得出的洗脫曲線:367:各種檢測(cè)器比較:

紫外示差熒光安培ELSD類型選擇性通用型選擇性選擇性通用型線性2.4×104

104103104104最小檢出量（g/ml）10-６10-６10-９10-１２10-８能否梯度能不能能不能能對(duì)流速不敏感不敏感不敏感敏感不敏感對(duì)溫度不敏感敏感不敏感敏感不敏感37二:ELSD的應(yīng)用:1:大多數(shù)的脂類分子都缺乏適當(dāng)?shù)陌l(fā)色團(tuán)，因此脂類除非通過(guò)衍生化，否則不能用紫外檢測(cè)。一般一個(gè)品種含有的各種脂類其極性差異很大，要各個(gè)組分的最佳分離和分辨率需要使用梯度脫洗，因而限制了示差檢測(cè)器的使用。不同于UV和RI的局限性，ELSD是脂類檢測(cè)的有用工具。2:碳水化合物不帶有發(fā)色團(tuán)，因而不能用UV來(lái)檢測(cè)。他們通常用氨基柱或者陽(yáng)離子交換樹脂分離。但是示差檢測(cè)器不是很靈敏，而且需要控制溫度來(lái)維持基線穩(wěn)定，不能與梯度脫洗相容。ELSD靈敏度高，基線穩(wěn)定，與梯度脫洗相容。如中藥多糖類和苷類(人參,黃芪,三七中的有效成分)的分析＆質(zhì)量控制中,ELSD是首選的手段.38例子:高效凝膠色譜法測(cè)定芪參多糖分子量及其分布

色譜柱：Polysep-GFC-P4000,300×7.80mm,Phenomenex.流動(dòng)相：純化水流速：0.50mL/minELSD檢測(cè)器漂移管溫度：60℃ELSD檢測(cè)器霧化室溫度：40℃ELSD檢測(cè)器氣泵流速：1.60l/minELS