第六講分子雜交

第六講分子雜交第一頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一1分子雜交概念及應(yīng)用分子雜交：在分子克隆中的一類核酸和蛋白質(zhì)分析方法，用于檢測(cè)混合樣品中特定核酸分子或蛋白質(zhì)分子是否存在，以及其相對(duì)分子質(zhì)量的大小。第二頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一

分子雜交實(shí)質(zhì)上是DNA或RNA單鏈之間退火形成DNA/RNA或DNA/DNA雜合分子。

應(yīng)用范圍：重組子鑒別基因分離

DNA片段分析基因表達(dá)研究。。。。。。第三頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一

當(dāng)用一個(gè)標(biāo)記核酸分子與核酸樣品雜交，便可以查明該樣品中是否存在與該標(biāo)記核酸分子具有同源性的分子。第四頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一2探針的概念及其標(biāo)記技術(shù)2.1

探針(probe):

用于檢測(cè)特定基因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在或表達(dá)的DNA、RNA或寡核苷酸。

第五頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.2探針的標(biāo)記技術(shù)

2.2.1均勻標(biāo)記

2.2.2末端標(biāo)記第六頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.2.1均勻標(biāo)記

⑴切口平移法標(biāo)記

DNaseIHOP5’3’5’3’5’3’DNaseI與PolI的切口移位PolI第七頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一⑵隨機(jī)引物標(biāo)記⑶PCR擴(kuò)增標(biāo)記

要求：

[a-32P]dNTP第八頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一5’3’5’3’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’熱變性隨機(jī)引物退火

-32PdNTPKlenow酶~~5’5’~~5’~~~~5’~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~第九頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.2.2末端標(biāo)記

⑴DNA片段的末端標(biāo)記

Klenow酶

3’-末端補(bǔ)平(3’-末端標(biāo)記)

5’-ACGTTGCAAACTG-3’3’-TGCAACGTTTGAC-5’第十頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一四種不同的補(bǔ)平反應(yīng)5’-GGATCC-3’BamHI5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’3’-CCTAGG-5’

dNTPdGTPdGTP/dATPdGTP/dATP/dTTP5’-GGATC5’-GG5’-GGA5’-GGAT

3’-CCTAG3’-CCTAG3’-CCTAG3’-CCTAG

GATCC-3’GATCC-3’GATCC-3’GATCC-3’

CTAGG-5’GG-5’AGG-5’TAGG-5’

I

S1S1S15’-GG

CC-3’5’-GGA

TCC-3’5’-GGAT

ATCC-3’3’-CC

GG-5’3’-CCT

AGG-5’3’-CCTA

TAGG-5’

II

III

Ⅳ

第十一頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一T4DNApolymerase

T7DNApolymerase

T4多核苷酸激酶(T4polynucleotidekinase)

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)第十二頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一⑵合成寡核苷酸的標(biāo)記

T4多核苷酸激酶(T4polynucleotidekinase)

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)

第十三頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一3分子雜交技術(shù)根據(jù)檢測(cè)對(duì)象的不同：

Southern雜交

Northern雜交

Western雜交斑點(diǎn)雜交狹線雜交菌落雜交第十四頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一

1975年,Southern印跡雜交（Southernblot）由英國(guó)人埃德溫·邁勒·薩瑟恩（EdwinMellorSouthern）創(chuàng)建。

3.1Southern雜交埃德溫·邁勒·薩瑟恩第十五頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一Southern雜交操作步驟：⑴印跡轉(zhuǎn)移(blotting)

將DNA片段從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到濾膜的方式。第十六頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一帶有DNA片段的凝膠DNA分子酶切片段

限制性酶切瓊脂糖電泳

通過(guò)毛細(xì)管滲吸或電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移方式80℃或紫外線處理將DNA固定在濾膜上雜交、顯影凝膠濾膜0.4MNaOH溶液中DNA變性在1.5MNacl+1MTris中和，保存單鏈狀態(tài)。吸附有ssDNA的膜Southern印跡雜交的技術(shù)流程第十七頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一

印跡轉(zhuǎn)移方式(1)

——毛細(xì)管滲吸法第十八頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一白瓷盤玻璃板濾紙凝膠尼龍膜濾紙吸水紙玻璃板重物毛細(xì)管滲吸法第十九頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一真空轉(zhuǎn)膜槽濾紙尼龍膜凝膠蓋子印跡轉(zhuǎn)移方式(2)—真空轉(zhuǎn)膜第二十頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一第二十一頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一印跡轉(zhuǎn)移方式(3)——電轉(zhuǎn)移第二十二頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一⑵分子雜交①預(yù)雜交

目的：將濾膜的空白處用魚精DNA或牛奶蛋白封閉起來(lái)，防止在雜交過(guò)程中濾膜本身對(duì)探針的吸附。

預(yù)雜交液實(shí)際上就是不含探針的雜交液，其中主要含有魚精DNA、牛血清等，這些大分子可以封閉膜上所有非特異性吸附位點(diǎn)。

第二十三頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一②

雜交在一定的溶液和溫度下，將標(biāo)記的探針與濾膜混合；⑶洗滌

25℃1×SSC/0.1%SDS

雜交溫度0.25×SSC/0.1%SDS⑷放射性自顯影或生化檢測(cè)。

第二十四頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一Southern雜交EdwardSouthern（1）提取總DNA（2）酶解（3）電泳（4）轉(zhuǎn)移到濾膜（5）變性解鏈（6）DNA探針及雜交（7）洗脫（8）放射自顯影（9）比較分析第二十五頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一Southern雜交的主要應(yīng)用：判斷某一生物樣品中是否存在某一基因，以及該基因所在的限制性酶切片段的大小。第二十六頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.2Northern雜交

印跡轉(zhuǎn)移的是總RNA或mRNA。

應(yīng)用：在轉(zhuǎn)錄水平上某基因是否表達(dá)，在有合適對(duì)照的情況下，通過(guò)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱可比較基因表達(dá)的強(qiáng)弱。第二十七頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.3Western雜交

印跡轉(zhuǎn)移的是蛋白質(zhì)。

將待檢測(cè)蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)PAGE電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體-抗原”免疫反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。

探針:針對(duì)某一蛋白質(zhì)制備的特異性抗體。第二十八頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一

以上分子雜交可以獲得精確的結(jié)果，但操作繁雜。當(dāng)樣品量比較大時(shí)，難以滿足試驗(yàn)需求。當(dāng)樣品量比較大時(shí)，可以采用簡(jiǎn)化的方式做初步的檢測(cè)，然后再對(duì)陽(yáng)性樣品作精確的檢測(cè)。第二十九頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一

3.4菌落雜交

基本操作步驟：⑴將細(xì)菌菌落影印到濾膜上；⑵對(duì)濾膜上的菌體做原位裂解使DNA釋放處來(lái)，并固定在濾膜上；⑶分子雜交。