第五章DNA損傷與修復(fù)

基本情況博士，教授，博士生導(dǎo)師中國(guó)科學(xué)院“百人計(jì)劃”，遼寧省“攀登學(xué)者”主要研究方向：

腫瘤抑制因子功能與作用機(jī)制；DNA損傷應(yīng)答過(guò)程中關(guān)鍵蛋白的定位與功能；參與DNA損傷應(yīng)答的ncRNAs等

當(dāng)前第1頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)為什么要研究DNA損傷應(yīng)答？(DNADamageResponse,DDR)當(dāng)前第2頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)DNA損傷類型和數(shù)量TYPEOFDAMAGEevents/cell/day%oftotaldailydamageSingle-strandbreak120,00050.9N7-MethylGuanine84,00035.6Depurination24,00010.2OxidizedDNA2,8801.2Depyrimidation1,3200.5Cytosinedeamination3600.2Double-strandbreaks90.01當(dāng)前第3頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)DNA損傷與疾病當(dāng)前第4頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)第一節(jié)DNA損傷何謂DNA損傷？在內(nèi)源或外源因素作用下，DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生的任何改變都稱為DNA損傷DNA損傷的后果：一、DNA失去作為復(fù)制和轉(zhuǎn)錄模板的功能，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；二、DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生永久性改變當(dāng)前第5頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)一、DNA損傷的類型堿基的更替、缺失、插入、鏈的斷裂、鏈內(nèi)或鏈間的交聯(lián)、DNA重排等。天然的線性染色體末端—端粒？當(dāng)前第6頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)二、損傷因素內(nèi)源因素：染色體復(fù)制、活性氧等外源因素：紫外線、電離輻射、堿基類似物、修飾劑、烷化劑、化學(xué)誘變劑等。當(dāng)前第7頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)三、突變的類型1.點(diǎn)突變：是指DNA分子中一個(gè)堿基的改變。包括轉(zhuǎn)換（嘌呤堿基→嘌呤堿基）和顛換（嘌呤堿基→嘧啶堿基或嘧啶堿基→嘌呤堿基）2.插入突變：是指DNA分子中插入多余的堿基。3.缺失突變：是指DNA分子中堿基的丟失。插入突變和缺失突變可引起移碼突變。4.三聯(lián)體擴(kuò)增：脆性X染色體綜合征是由于FMR-1基因中CGG重復(fù)突變5.DNA片段重組當(dāng)前第8頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)四、突變的后果1.中性突變基因突變（特別是點(diǎn)突變），不一定就是有害突變。突變是生物進(jìn)化和分化的分子基礎(chǔ)；只有基因型改變的突變，即堿基組成改變，但蛋白質(zhì)分子中氨基酸未改變。如有些點(diǎn)突變發(fā)生在同義密碼子的第二或第三位堿基，或發(fā)生在基因的內(nèi)含子上。因此突變不一定就是損傷。Pointmutation---GCG------CGC------GCC------CGG---精氨酸精氨酸當(dāng)前第9頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)2.有害突變嚴(yán)重的突變或突變的長(zhǎng)期積累，導(dǎo)致DNA復(fù)制障礙或不能進(jìn)行，或基因表達(dá)異常，引起DNA損傷導(dǎo)致疾病。因此突變是某些疾病的分子基礎(chǔ)當(dāng)前第10頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)鐮狀紅細(xì)胞貧血-點(diǎn)突變當(dāng)前第11頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)第二節(jié)DNA損傷的機(jī)制一、自發(fā)性損傷1.DNA復(fù)制過(guò)程中的堿基錯(cuò)配（錯(cuò)誤率為10-9，修復(fù)后降為10-10

）當(dāng)前第12頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)2.三聯(lián)體擴(kuò)增（即三核苷酸重復(fù)）是指三個(gè)不同的堿基為一個(gè)單位重復(fù)排列而形成的DNA序列。理論上，基因組中應(yīng)該含有10類60種三核苷重復(fù)DNA序列。如CAG\CTG、GAA\TTC等三核苷酸重復(fù)序列。其中，CAG\CTG、GAA\TTC、CGG\CCG等三核苷酸重復(fù)序列序列與20種以上的神經(jīng)-肌肉系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)病有關(guān)。這些三核苷重復(fù)序列可以出現(xiàn)不明原因的擴(kuò)增，從而累及所在或周圍基因的正常表達(dá)或正常的生物活性。當(dāng)前第13頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)19q13.2~19q13.3當(dāng)前第14頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)果蠅FMRP調(diào)節(jié)DNA損傷導(dǎo)致的細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)和凋亡fmr突變導(dǎo)致DNA損傷敏感FMRP工作模式Liuetal.HumanMolecularGenetics.2012當(dāng)前第15頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第16頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)3.堿基的烯醇式-酮式或氨基-亞氨基異構(gòu)體互變引起堿基錯(cuò)配當(dāng)前第17頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)4.自發(fā)脫氨基C→U引起U→A、A→I引起I→C、G→X（無(wú)配對(duì)堿基）當(dāng)前第18頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)5.堿基丟失引起突變3′5′3′5′當(dāng)前第19頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)二、環(huán)境因素誘發(fā)DNA損傷分子機(jī)制（一）紫外線引起DNA損傷的機(jī)制當(dāng)DNA暴露與260nm的紫外線時(shí)，DNA鏈相鄰的嘧啶堿基可形成5，6雙鍵，產(chǎn)生嘧啶二聚體—TT、TC或CC，最常見為TT二聚體。人皮膚細(xì)胞受紫外線照射形成二聚體的可達(dá)5×104/細(xì)胞/小時(shí)。此外，紫外線還可引起DNA鏈間交聯(lián)、DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)、甚至斷鏈。當(dāng)前第20頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)（二）電離輻射引起DNA損傷的機(jī)制1.可導(dǎo)致DNA堿基改變電離輻射可產(chǎn)生OH自由基，引起DNA鏈上堿基氧化修飾（如T轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥甲基尿嘧啶）、堿基開環(huán)（如腺嘌呤7，8-雙鍵斷開）和脫落。嘧啶與嘌呤更敏感。2.可導(dǎo)致DNA斷鏈.OH自由基破壞脫氧核糖脫落或斷裂3′，5′-磷酸二酯鍵使DNA斷鏈3.可導(dǎo)致DNA鏈交聯(lián)電離輻射可使同一條DNA鏈內(nèi)或兩條DNA鏈之間或DNA與蛋白質(zhì)間發(fā)生交聯(lián)。當(dāng)前第21頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)三、烷化劑引起DNA損傷的機(jī)制烷化劑是親電子化合物，分子中帶有活性烷基?；钚酝榛赊D(zhuǎn)移到DNA的堿基或磷酸基上，使之烷基化。鳥嘌呤最易烷基化。烷化劑包括芥子氣、硫酸二乙酯、甲基-亞硝基胍、甲基甲烷碘酸、氮芥、硫芥、環(huán)磷酰氨、苯丁酸氮芥、絲裂霉素等1.可導(dǎo)致堿基錯(cuò)配烷基常加到堿基的N（N7烷基化鳥嘌呤G或N3烷基化腺嘌呤A）或O原子上，使烷基化的G與T配對(duì)。2.可導(dǎo)致堿基脫落烷基化鳥嘌呤的糖苷鍵不穩(wěn)定而斷裂，使DNA鏈產(chǎn)生無(wú)堿基位點(diǎn)，復(fù)制時(shí)可插入任何堿基。2.可導(dǎo)致DNA斷鏈磷酸基上O的烷基化，使3′，5′-磷酸二酯鍵斷裂4.可導(dǎo)致DNA鏈的交聯(lián)當(dāng)前第22頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)四、堿基類似物引起DNA損傷的機(jī)制堿基類似物在結(jié)構(gòu)上與堿基相似，它們進(jìn)入體內(nèi)后，在DNA復(fù)制過(guò)程中，可替代堿基摻入而干擾DNA合成，引起堿基錯(cuò)配。堿基類似物包括5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、2-氨基腺嘌呤等。當(dāng)前第23頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第24頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)五、化學(xué)修飾劑和化學(xué)誘變劑引起DNA損傷的機(jī)制化學(xué)修飾劑能專一地修飾DNA分子的堿基導(dǎo)致堿基錯(cuò)配如亞硝酸鹽（使C氧化脫氨基變成U，導(dǎo)致G-C轉(zhuǎn)變?yōu)锳-T，或使A氧化脫氨基變成I，導(dǎo)致A-T轉(zhuǎn)變?yōu)镚-C）、羥氨（使T脫甲基變?yōu)镃，導(dǎo)致A-T轉(zhuǎn)變?yōu)镃-G）致癌物黃曲霉素B也是導(dǎo)致序列的變化。丫啶類化合物、溴化乙啶等也引起DNA損傷。當(dāng)前第25頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第26頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)第三節(jié)損傷DNA的修復(fù)在一定條件下，損傷的DNA分子恢復(fù)正常的過(guò)程。修復(fù)方式有：直接修復(fù)、切除修復(fù)、重組修復(fù)、跨

損傷修復(fù)和SOS修復(fù)當(dāng)前第27頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)一）、光修復(fù)光復(fù)活酶（即光裂合酶）直接修復(fù)嘧啶二聚體（見于細(xì)菌和低等真核生物）光復(fù)活酶300~500nmUV照射一、直接修復(fù)當(dāng)前第28頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)二）、DNA連接酶直接修復(fù)DNA斷裂口當(dāng)前第29頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)三）、烷基化堿基的直接修復(fù)例如，E.Coli的Ada酶和人類的O6甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）可將烷基不可逆地轉(zhuǎn)移到自身而完成修復(fù)，本身失活（自殺修復(fù)）。當(dāng)前第30頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)四）、DNA嘌呤插入酶直接修復(fù)無(wú)嘌呤位點(diǎn)（APsite）當(dāng)前第31頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)二、切除修復(fù)—最普遍和常見的修復(fù)方式切除修復(fù)需要DNA特異內(nèi)切酶、核酸外切酶、糖苷酶、DNA聚合酶和DNA連接酶的參與。包括單個(gè)核苷酸切除和核苷酸片段切除修復(fù)。切除修復(fù)屬于復(fù)制前修復(fù)當(dāng)前第32頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)ACUTCATGGAGTACG*TCATGGAGT糖苷酶ACG*TCATGGAGTAP內(nèi)切酶和外切酶ACCTCATGGAGTDNA聚合酶DNA連接酶1.單個(gè)核苷酸切除修復(fù)當(dāng)前第33頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)2.核苷酸片段切除修復(fù)

--UvrABC修復(fù)系統(tǒng)具有ATP酶活性的UvrA

與UvrB結(jié)合，并識(shí)別

與結(jié)合DNA損傷部位。

具有內(nèi)切酶作用的UvrC

置換出UvrA，與UvrB-DNA結(jié)合。UvrD（DNA解旋酶Ⅱ）釋放

切

下的損傷片段。DNA聚合酶Ⅰ填補(bǔ)缺

口，并由DNA連接酶

連接。當(dāng)前第34頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)人類著色性干皮?。▁erodermapigmentosis,XP）常染色體隱性遺傳。皮膚對(duì)日光，尤其是對(duì)紫外線敏感。主要臨床表現(xiàn)是皮膚雀斑樣色素沉著，毛細(xì)血管擴(kuò)張，局限性萎縮，疣狀增生，淺表潰瘍，最后可癌變。這種病人的XP類基因（XPA、XPB、XPC、XPF、XPG）有缺陷，導(dǎo)致DNA損傷后的修復(fù)障礙。當(dāng)前第35頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)3.錯(cuò)配修復(fù)當(dāng)DNA復(fù)制時(shí)，摻入了錯(cuò)誤的堿基，在校讀時(shí)未被去除，可經(jīng)由該通路的酶?jìng)蓽y(cè)出來(lái)，將其中一股切出，并加以修補(bǔ)。當(dāng)前第36頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)三、重組修復(fù)--復(fù)制后修復(fù)當(dāng)前第37頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第38頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)四、跨損傷DNA合成修復(fù)跨損傷DNA合成（TranslesionDNASynthesis,TLS是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的參與DNA修復(fù)的又一機(jī)制。TLS包括無(wú)錯(cuò)損傷旁路（error-freelesionbypass）及易錯(cuò)損傷旁路（error-pronelesionbypass）；易錯(cuò)損傷旁路可導(dǎo)致DNA損傷誘導(dǎo)的突變。

跨損傷DNA合成，這是一種利用損傷核苷酸為模板，通過(guò)跨損傷DNA聚合酶使堿基摻入到復(fù)制終止處進(jìn)行DNA合成，從而延長(zhǎng)DNA的修復(fù)。

當(dāng)前第39頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)五、SOS修復(fù)—誘導(dǎo)修復(fù)SOS修復(fù)是細(xì)胞DNA受到廣泛損傷而難以復(fù)制的緊急情況下，細(xì)胞為求生存而出現(xiàn)的一種應(yīng)急反應(yīng)。此時(shí)，細(xì)胞需調(diào)動(dòng)其所有的修復(fù)系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)。20世紀(jì)50年代，Weigle首次在E.coli中發(fā)現(xiàn)SOS修復(fù)系統(tǒng)。1973年，Raelman首次稱為SOS修復(fù)。SOS反應(yīng)誘導(dǎo)的修復(fù)系統(tǒng)包括避免差錯(cuò)修復(fù)（光修復(fù)、切除修復(fù)和重組修復(fù)）和傾向差錯(cuò)修復(fù)。誘導(dǎo)產(chǎn)生缺乏校正功能的DNA聚合酶，一方面進(jìn)行修復(fù)，同時(shí)也容易造成堿基錯(cuò)配的機(jī)會(huì)而產(chǎn)生新的損傷。但總的結(jié)果是細(xì)胞可以生存下去。當(dāng)前第40頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)SOS反應(yīng)是由RecA蛋白和LexA阻遏物蛋白相互作用引起的，LexA（22kD）阻遏物蛋白是許多基因的阻遏物。RecA蛋白是SOS反應(yīng)的最初發(fā)動(dòng)因子。在ATP存在時(shí)，RecA被損傷的DNA激活而表現(xiàn)出蛋白水解酶活力，水解LexA阻遏物蛋白，使與修復(fù)有關(guān)的基因開放，表達(dá)產(chǎn)物即可對(duì)損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)。當(dāng)前第41頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第42頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)DNA損傷修復(fù)缺陷與疾病當(dāng)前第43頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第44頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)DNA損傷應(yīng)答的若干關(guān)鍵因子

與損傷的時(shí)間和空間關(guān)系當(dāng)前第45頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)Checkpoint當(dāng)前第46頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)p53:“GuardianofGenome”腫瘤抑制因子最初鑒定為癌基因獲得性功能“Gainoffunction”超過(guò)50%的腫瘤中突變或異常當(dāng)前第47頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)主要功能細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)(checkpoint)凋亡當(dāng)前第48頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)p53突變導(dǎo)致不同的轉(zhuǎn)錄譜Kollareddyetal.NATURECOMMUNICATIONS|Published12Jun2015|6:7389當(dāng)前第49頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)什么是端粒(telomere)天然的染色體末端染色體末端由DNA和蛋白質(zhì)共同構(gòu)成的結(jié)構(gòu)來(lái)源于希臘語(yǔ)telos=endmeros=part當(dāng)前第50頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)保護(hù)端粒的“T-loop”結(jié)構(gòu)當(dāng)前第51頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)端粒的功能維持染色體末端保護(hù)染色體不發(fā)生融合、降解等當(dāng)前第52頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)熒光原位雜交檢測(cè)端粒

（FluorescenceInSituHybridization,FISH)telomeresred

centromeregreen當(dāng)前第53頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)端粒長(zhǎng)度端粒隨細(xì)胞分裂縮短MitoticclockofthecellHuman:15-20kb,50-100bp/celldivision50-100divisions當(dāng)前第54頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第55頁(yè)\共有59頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)端粒與DNA損傷unprotectedtelomeretelomereDSBSharedmanyproteinsDNAdamage?當(dāng)前第56頁(yè)\共有5