第四章補充沉淀分離與結晶

第四章補充沉淀分離與結晶第一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一通過改變溶液條件，使溶質的溶解度降低而以固體形式從溶液中分離出的一種操作技術。鹽析法有機溶劑沉淀法等電點沉淀法結晶法2第二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)鹽析法

(saltprecipitation)定義：鹽析法是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過向溶液中引入一定數量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達到純化目的的方法。優(yōu)點：簡單、經濟、較少變性缺點：分辨率不高，要除鹽3第三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一兩種現象：鹽溶：低鹽情況，鹽離子強度的增高，蛋白質溶解度增大鹽析：高鹽，鹽離子強度增加，蛋白質溶解度減小4第四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一蛋白質鹽析向蛋白質溶液中加入一定濃度的無機鹽[(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后，可以使蛋白質凝聚而從溶液中析出，這種作用就叫做鹽析。這樣析出的蛋白質仍可以溶解在水中，而不影響原來蛋白質的性質。因此，鹽析是一個可逆的過程。利用這個性質，可以采用多次鹽析的方法來分離、提純蛋白質。第五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一蛋白質在水溶液中的溶解度取決于蛋白質分子表面離子周圍的水分子數目，亦即主要是由蛋白質分子外周親水基團與水形成水化膜的程度以及蛋白質分子帶有電荷的情況決定的。蛋白質溶液中加入中性鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質，致使蛋白質分子周圍的水化層減弱乃至消失。同時，中性鹽加入蛋白質溶液后由于離子強度發(fā)生改變，蛋白質表面的電荷大量被中和，更加導致蛋白質溶解度降低，蛋白質分子之間聚集而沉淀。第六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一由于各種蛋白質在不同鹽濃度中的溶解度不同，不同飽和度的鹽溶液沉淀的蛋白質不同，從而使之從其他蛋白中分離出來。簡單的說就是將硫酸銨、硫化鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質在水溶液中的穩(wěn)定性因素去除而沉淀。鹽析法簡單方便，可用于蛋白質抗原的粗提、丙種球蛋白的提取、蛋白質的濃縮等。鹽析法提純的抗原濃度不高，只用于抗原的初步純化。第七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一一、基本原理8第八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一原理1.形成離子對，部分中和了蛋白質的電性，排斥作用減弱而能相互靠攏，聚集起來。2.中性鹽的親水性比蛋白質大，使蛋白質脫去了水化膜，使其沉淀。9第九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一蛋白質溶解度與離子強度關系logS=-Ks

S——蛋白質溶解度，g/L；—鹽離子強度,Ci——i離子濃度，mol/L；Zi——i離子化合價；——常數,為縱坐標上的截距;Ks——鹽析常數。10第十頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一、KS為縱坐標上的截距，是外推截距，與無機鹽種類無關。KS是鹽析常數，與蛋白質和鹽的種類有關，但與溫度和pH無關。兩種類型：（1）在一定的pH和溫度下改變離子強度（鹽濃度）進行鹽析，稱作Ks鹽析法。（2）在一定離子強度下僅改變pH和溫度進行鹽析，稱作β鹽析法。11第十一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一（一）、無機鹽的種類鹽析能力：半徑小的高價離子在鹽析時的作用較強，陰離子的鹽析效果比陽離子好，尤其以高價陰離子更為明顯。

PO43-＞SO42―＞CH3COO―＞Cl―＞NO3―＞I―

NH4+＞K+＞Na+＞Li+

鹽析用鹽要考慮幾個因素：常用硫酸銨12二、影響鹽析的因素第十二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一(二）溶質（蛋白質等）種類的影響13第十三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一（三）蛋白質濃度的影響蛋白質濃度提高，鹽用量減少。14第十四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一（四）溫度的影響溫度的變化會影響值。在無鹽或稀鹽溶液中，大多數蛋白質溶解度是隨溫度升高而增大的，但在高鹽溶液中常相反。

15第十五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一（五）pH的影響當溶液的pH在蛋白質等電點附近時，值最小。利用值最低點時pH的不同，可以分級沉淀蛋白質.16第十六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一(六)鹽的飽和度不同蛋白質的鹽析要求的鹽的飽和度不一樣；分段鹽析法。第十七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一三、鹽析基本操作

1.中性鹽的選擇；2.pH的選擇；3.溫度與時間的控制；4.飽和度。18第十八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一（二）鹽析方法和注意事項

1、分步鹽析法2、重復鹽析法3、反抽提法一定的鹽濃度下將目的蛋白夾帶一定量的雜蛋白一同沉淀。將沉淀用較低濃度鹽溶液平衡，溶出其中的雜蛋白。19第十九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一分部鹽析法20第二十頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一反抽提法(RNA聚合酶)21第二十一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一注意事項“局部過濃”

：少量多次加入；

溫度（室溫）加入方法：1.固體法：攪拌下，少量多次加入；2.飽和溶液法:在蛋白質溶液中加入預先調好pH的（NH4)2SO4溶液；3.透析法:將盛蛋白質溶液的透析袋放入一定濃度的（NH4)2SO4溶液中，通過透析作用改變蛋白質溶液中的鹽濃度。使用于小體積樣品。

22第二十二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一第二節(jié)有機溶劑沉淀

(OrganicSolventPrecipitation)

定義：向水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑，降低溶質的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。23第二十三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一1、降低了介質的介電常數，使溶質分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。

2、水溶性有機溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了親水溶質分子表面原有水化層的厚度，降低了它的親水性，導致脫水凝集。24一、基本原理第二十四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一一些溶劑的介電常數

25第二十五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一優(yōu)點：乙醇等有機溶劑易除去，產品更純凈；密度差較大，可通過離心收集。缺點：容易使蛋白質變性，操作常需低溫，成本高，需防火防爆。26第二十六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一二、影響沉淀效果的因素（一）有機溶劑種類及用量常用的溶劑有乙醇、丙酮、甲醇等。

（二）pH的影響許多蛋白質在等電點附近時溶解度最低，溶液pH應在等電點附近，還須考慮蛋白質的穩(wěn)定性。

27第二十七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一（三）溫度（低溫沉淀）有機溶劑存在下，大多數蛋白質的溶解度隨溫度降低而顯著地減小。（四）無機鹽的含量低鹽：有利于沉淀，還有保護蛋白質，防止變性。

高鹽：增大蛋白質在有機溶劑―水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夾帶鹽。

28第二十八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一

多價陽離子，如Ca2+、Zn2+能與蛋白質結合形成復合物，使蛋白質溶解度降低。

胰島素精制：

29（五）某些金屬離子的助沉淀作用第二十九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一（六）樣品濃度

濃度小時，增加溶劑投入量和損耗。濃度大時，增加共沉作用，降低分辨率。蛋白質濃度0.5%～2%；粘多糖濃度1%～2%。30第三十頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一第三節(jié)其它沉淀方法

一、等電點沉淀法對于兩性物質，等電點時凈電荷為零，分子間排斥電位降低，吸引力增大，能相互聚集起來，發(fā)生沉淀。

31第三十一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一胰島素純化：胰島素

pH8

除去堿性雜蛋白

pH3

除去酸性雜蛋白32第三十二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一蛋白質等電點沉淀在等電點時，蛋白質分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零(即正負電荷相等)，此時蛋白質分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產生沉淀，所以蛋白質在等電點時，其溶解度最小，最易形成沉淀物。等電點時的許多物理性質如黏度、膨脹性、滲透壓等都變小，從而有利于懸浮液的過濾。第三十三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一金屬離子沉淀：與生物分子的酸性功能團作用的金屬復合鹽法；有機酸沉淀:與生物分子的堿性功能團作用的有機酸復合鹽法（如苦味酸鹽、苦酮酸鹽、單寧酸鹽等）。34二、成鹽沉淀法第三十四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一

1．金屬離子沉淀：

Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等；

2．生成有機酸類復合鹽沉淀（1）單寧即鞣酸（2）雷凡諾（3）三氯乙酸（TCA）35第三十五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一

雷凡諾

36第三十六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一豬心提取液洗脫液上清液上清細胞色素C

沉淀（去除）37吸附人造沸石鹽析45%飽和硫酸銨沉淀TCA透析第三十七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一三、親和沉淀

利用親和反應原理，將配基與可溶性的載體偶聯(lián)后形成載體-配基復合物（親和沉淀劑），該復合物可選擇性地與蛋白質結合，在一定條件下沉淀出來。

中性可溶，酸性沉淀。38第三十八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一

39第三十九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一四、高分子聚合物沉淀水溶性非離子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使蛋白質水合作用減弱而發(fā)生沉淀。五、表面活性劑沉淀十六烷基三甲基季胺溴化物（CTAB）十六烷基氯化吡啶（CPC）40}酸性多糖第四十頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一41第四十一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一六、選擇性變性沉淀法熱變性沉淀法酸堿變性沉淀法利用試劑（氯仿）42第四十二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一第四節(jié)結晶(crystallization)

定義：溶液中的溶質在一定條件下因分子有規(guī)則的排列而結合成晶體。

通過結晶，溶液中的大部分雜質會留在母液中，經過濾、洗滌可得到純度高的晶體。

43第四十三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一結晶的方法一般有2種：一種是蒸發(fā)溶劑法，它適用于溫度對溶解度影響不大的物質。沿海地區(qū)“曬鹽”就是利用的這種方法。另一種是冷卻熱飽和溶液法。此法適用于溫度升高，溶解度也增加的物質。如北方地區(qū)的鹽湖，夏天溫度高，湖面上無晶體出現；每到冬季，氣溫降低，石堿(Na2CO3·10H2O)、芒硝(Na2SO4·10H2O)等物質就從鹽湖里析出來。在實驗室里為獲得較大的完整晶體，常使用緩慢降低溫度，減慢結晶速率的方法。第四十四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一晶體在一定條件下所形成的特定晶形，稱為晶習。向溶液添加或自溶液中除去某種物質(稱為晶習改變劑)可以改變晶習，使所得晶體具有另一種形狀。這對工業(yè)結晶有一定的意義。晶習改變劑通常是一些表面活性物質以及金屬或非金屬離子。第四十五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一一、結晶過程指溶質自動從過飽和溶液中析出形成新相的過程。C2

—

小晶體的溶解度；C1

—

普通晶體的溶解度；ρ

—

晶體密度；M

—

晶體質量；σ—

晶體與溶液間的界面張力；

γ2

—

小晶體的半徑；

γ1

—

普通晶體的半徑；46第四十六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一結晶包括三個過程：(1)形成過飽和溶液;(2)晶核形成;(3)晶體生長。47第四十七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一晶核生成（成核）和晶體生長兩個階段，兩個階段的推動力都是溶液的過飽和度（溶液中溶質的濃度超過其飽和溶解度之值）。晶核的生成有三種形式：即初級均相成核、初級非均相成核及二次成核。在高過飽和度下，溶液自發(fā)地生成晶核的過程，稱為初級均相成核；溶液在外來物（如大氣中的微塵）的誘導下生成晶核的過程，稱為初級非均相成核；而在含有溶質晶體的溶液中的成核過程，稱為二次成核。二次成核也屬于非均相成核過程，它是在晶體之間或晶體與其他固體（器壁、攪拌器等）碰撞時所產生的微小晶粒的誘導下發(fā)生的。第四十八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一濃度溫度圖49第四十九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期一二、過飽和溶液的形成(結晶方法)（一）、蒸發(fā)法、冷卻法（二）、溫度誘導法（三）、鹽析結晶法（四）、透析結晶法（五）、有機溶劑結晶法50第