酶聯(lián)免疫吸附技術在食品安全檢測中的應用

酶聯(lián)免疫吸附技術在食品安全檢測中的應用侯瑾;李迎秋【摘要】Enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)isasimplemethodwithadvantagesoflowdetectioncostandlargeanalysiscapacity,etc..Itissuitablefortraceanalysisofcomponentsincomplexmatricesanditattractsmoreandmorepeople.OutlinetheELISAtechnologybriefly.Theapplicationofthistechnologyinfoodsafetytestingisintroduceddetailedlyfromaspectsofpesticideresidues,veterinarydrugresidues,illegaladditives,pathogenicmicroorganisms,biologicaltoxinsaswellasthesafetyofgeneticallymodifiedfoodandotheraspects.Furthermore,mentionthetechnicalproblemsandcorrespondingsolutionsofELISA,andprospectthetechnologyinthefuture.%酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)具有方法簡捷、檢測成本低、分析容量大等優(yōu)點，適合于復雜基質中的微量成分分析，受到越來越多人的青睞.簡單概述了ELISA技術,并從農藥殘留、獸藥殘留、違禁添加物、病原微生物和生物毒素以及轉基因食品安全性等方面，對該技術在食品安全檢測中的應用進行詳細的介紹，提出了ELISA技術存在的問題和相應的解決方法，并對該技術進行了展望.【期刊名稱】《中國調味品》【年(卷)，期】2017(042)006【總頁數(shù)】5頁(P165-169)【關鍵詞】酶聯(lián)免疫吸附;原理;食品安全檢測;應用【作者】侯瑾;李迎秋【作者單位】齊魯工業(yè)大學食品科學與工程學院，濟南250353濟魯工業(yè)大學食品科學與工程學院，濟南250353【正文語種】中文【中圖分類】TS207.3酶聯(lián)免疫吸附法（簡稱ELISA）是將現(xiàn)代檢測手段與免疫技術相結合建立的具有高敏感性和特異性的一種超微量的實驗檢測技術，它是一種以免疫酶為核心且用特殊試劑分析的免疫檢測方法。最初，ELISA主要用于檢測病毒和細菌，20世紀70年代末，ELISA用于抗原和抗體的檢測。由于研制出各種類型的抗原、抗體復合物及高純度抗體，使單克隆抗體技術得到了廣泛應用并推進了免疫分析法的發(fā)展和應用［1］，ELISA技術隨著自動化免疫技術的發(fā)展大大提高了定量分析能力和準確性，彌補了儀器法和化學法方面的局限性，在眾多的學科領域有著較高的應用價值，ELISA技術對食品中殘留物、污染物的分析已成為世界各國學術研究的新熱點。1.1基本原理酶聯(lián)免疫吸附法（簡稱ELISA）以免疫學為基礎將酶與抗原抗體結合成仍有免疫活性的免疫復合物，免疫復合物再與抗原和抗體進行結合反應［2］，結合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結合位點之間，使這種反應具有高度的特異性。酶結合在免疫復合物上，可催化相應的底物生成發(fā)光或熒光呈色的產物，可以將免疫效果放大到極致，選擇合適的方法和配套的自動化酶標儀進行定性、定量的測定。ELISA法檢測結果的精確性是以試劑符合要求和標準化操作為前提。由于酶有著很高的催化頻率，可以使反應效率很明顯，因此這種測定方法的靈敏度很高。根據不同的分析原理可分為均相（或異相）免疫分析和非均相分析，均相免疫分析是指抗原抗體在同一介質中進行的免疫反應，不需要磁性微球等固相載體，它分為間接法、競爭法、雙抗夾心法和捕獲法。間接法是常用的抗體檢測方法，該方法是將其轉化的抗原用于同一酶標抗體的檢測，以檢測各種抗體，所以不針對每一種抗原或抗體的特異性進行標記抗體，大大簡化了實驗；競爭法能夠測定抗原和抗體，是利用待測抗原和酶標抗原與特異性抗體（或抗原）競爭結合而進行測定的一種方法；雙抗體夾心法不需要直接標記特異性抗體，但制備酶標記物和純化免疫球蛋白需要較強的技術能力，成本高，操作步驟復雜；捕獲法主要用于測定IgM類抗體的量。此外，還有多種模式的方法如抗原直接包被法、雙夾心法、競爭性抑制法和抗酶標法等，采用哪種方式依檢測目的而定。酶聯(lián)免疫吸附分析的形式有三種：固相酶聯(lián)免疫吸附分析方式，是基于固相載體進行的抗原抗體反應，固相載體的形狀主要為磁珠、試管和微孔板三種；而板式酶聯(lián)免疫吸附分析法是較常用的形式；試紙條免疫吸附分析法，屬于定性檢測技術，與試劑盒相比具有更易于攜帶、檢測等優(yōu)點；管式酶聯(lián)免疫吸附法，可增加反應的體積，提高實驗靈敏度，并可作為一種比色杯，直接放在分光光度計中檢測。2.1農藥殘留的檢測農藥殘留是在動物、植物或其相關環(huán)境中使用或曾經使用農藥而儲存、蓄積在細胞、組織或動物體內的農藥原型、代謝產物和相關的雜質。近年來，大量使用農藥，導致糧食作物中農藥殘留量過大，呈上升趨勢，農藥殘留已成為我國食品安全的重要問題之一，農藥殘留傳統(tǒng)檢測法成本高，對實驗要求相當高，且費時費力，而ELISA法操作簡便，能快速檢測大批樣品，已成為許多國家檢測農藥殘留的首要方法。發(fā)達國家從20世紀90年代初期就已開始進行殘留控制，建立起國家殘留檢測體系，并已研發(fā)出快速檢測分析農殘量的商品試劑盒，同樣我國也加快了研究酶聯(lián)免疫法快速檢測農藥殘留的步伐，檢測范圍可精確到ng和pg水平。ELISA技術廣泛應用在氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、有機氯、有機磷類等農藥殘留檢測上。a.氨基甲酸酯類農藥使用較多，KatsoudasE等［3］用ELISA法檢測出新鮮水果中胺甲萘和蟲螨威的檢測限為2.0x10-6和8.0x10-6。b.擬除蟲菊酯類農藥屬于人工合成的神經毒劑，文孟棠［4］以間苯氧基苯甲酸(PBA)為半抗原，用三種方法制備了三種包被抗原，采用ELISA法對大白菜里的PBA半定量檢測抑制中濃度(IC50)為208.93ng/mL,最低檢測限為21.23ng/mL。c.有機氯農藥，在自然界中可穩(wěn)定存在，Skerritt等［5］用ELISA法測定不同基質對植物性食物中有機氯農藥殘留的影響。Lisa等［6］采用ELISA法檢測了用納米金標記DDT抗體范圍為0.7~1000ng/mL，且研發(fā)出浸蘸式競爭酶聯(lián)免疫快速檢測技術。d.有機磷(OPs)屬第二代農藥。華修德［7］合成了硫代磷酸酯半抗原做單克隆抗體，用ELISA方法檢測8種有機磷農藥殘留IC50值范圍為1.4~92.1ng/L。酶聯(lián)免疫吸附技術已成為一種不可或缺的農藥殘留檢測的常規(guī)手段，可準確地檢測農藥殘留量，以確保我們的食品安全。2.2動物中獸藥殘留的檢測獸藥殘留是指在動物及其產品中，如肉類、牛奶、雞蛋等藥物積累或保留的原型藥物或其代謝物，包括獸藥殘留的相關雜質。獸藥殘留問題日益嚴重，當人體食用量蓄積到一定程度后會引起中毒反應。隨著酶聯(lián)免疫吸附技術的發(fā)展，在獸藥殘留檢測中的應用較普遍，尤其是畜肉類、水產品、家禽類殘留的檢測，包括抗生素、呋喃類、激素類藥物、驅蟲藥類；張弛等［8］采用活化酯法，合成具有2-甲基-5-硝基咪唑通用結構的半抗原制備相應通用結構抗體，采用ELISA法檢測出不同動物源性食品里的加標回收率范圍為85.65%~108.65%，檢測限達1.9x10-4mg/L。崔廷婷等［9］用間接競爭ELISA法檢測出動物源性食品里紅霉素殘留樣品回收率范圍為69.0%~107.5%。ELISA法檢測結果快捷方便，精確高效。2.3食品中違禁添加物的檢測鹽酸克侖特羅，俗稱“瘦肉精”，是一種人工合成的B-興奮劑?！笆萑饩录逼毓夂?，這個名詞才被大家所熟知，瘦肉精能被家畜和人體很好地吸收，提高家畜的瘦肉率，生物利用度較高，但對人體的危害較大，會使人出現(xiàn)頭暈、肌肉震顫、心悸和四肢麻木等中毒現(xiàn)象，最終會引起畸變和癌變［10］。孫明君等［11］用間接競爭ELISA法檢測進出口動物中“瘦肉精”最低檢測限達0.05ng/mL，與其他激素存在交叉反應。三聚氰胺［C3N3（NH2）3］，分子式含氮量比蛋白質高出30%，在食品中摻入少量便能大大提高用凱氏定氮法測定的蛋白質含量［12］，王旻子等［13］制備抗三聚氰胺單克隆抗體得到兩種雜交瘤細胞，采用間接競爭ELISA法檢測這兩種細胞的IC50值分別為8.0，8.3ng/mL，無交叉反應。因此ELISA法檢測三聚氰胺準確、敏感、快速，適合三聚氰胺快速檢測的推廣應用。罌粟堿（1-［（3,4-二甲氧基苯基）甲基］-6,7-二甲氧基異喹啉）是罌粟中存在的一種重要的生物堿［14］，可治療疾病，但長期服用使人對其產生依賴性。危害人體健康。Pictet和Gams在1909年提出了罌粟堿的人工合成方法［15］。宋家銓等［16］根據固相酶聯(lián)免疫吸附原理，采用競爭ELISA法檢測食品中罌粟堿，準確度高（可檢出0.1pg/kg）o目前，酶聯(lián)免疫法是檢測食品中非法添加罌粟殼的主要方法。2.4食物中病原微生物的應用病原微生物污染引起的食品安全問題也日益嚴重，常規(guī)的培養(yǎng)法有很多的不足，試劑多，周期較長，而酶聯(lián)免疫法能夠彌補這些缺陷。ELISA可快速、方便地檢測食品中含有的大腸桿菌157、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等致病微生物。大多是通過制備單克隆抗體及ELISA法對食品中的病原微生物進行分析、檢測，結果可靠且準確。其中沙門氏菌的研究較多，它是細菌性食物中毒的重要致病菌，且作為致病菌檢測的一項重要指標［17］。伍燕華等［18］用雙抗夾心ELISA方法快速檢測出多種典型沙門氏菌培養(yǎng)液中最低檢測量為1x104cfu/mL，與其他雜菌無交叉反應。Yazdankhah［19］采用酶聯(lián)免疫吸附和免疫磁性分離兩種結合方法檢測出在3h內牛奶里金黃色葡萄球菌的最低檢測限為105cfu/mL。用ELISA法檢測病原微生物省時省力且效果精準。2.5在生物毒素中的測定生物毒素是由生物(植物、動物、微生物和海洋生物)產生且對其他生物產生毒害作用的不可復制的生物源化學物質［20］。生物毒素通過食物鏈進入人體，危害人體健康，由生物毒素導致的食品安全問題不容忽視?，F(xiàn)在，對幾乎所有的真菌毒素均建立了ELISA檢測法。管笛等［21］用ELISA法檢測玉米中的黃曲霉毒素B1過程中用磁微粒代替酶標板作為固定相，以單克隆抗體為基礎建立了兩類方法，分別是引入2.8pm磁微粒的間接競爭法以及引入2.8pm粒徑羧基磁微粒的直接競爭法，較常規(guī)ELISA法檢測限低4.3~5倍。歐小蕾［22］以制備麻痹性貝類毒素膝溝藻毒素2,3(GTX2,3)單克隆抗體，用間接競爭ELISA快速檢測出GTX2,3的效價達到1:51200,檢測結果快速、精準。近年來，我國研究了多種用于分析毒素的ELISA診斷試劑盒，李平等［23］用ELISA試劑盒檢測出四類乳制品里黃曲霉毒素M1最低檢測限分別為0.039,0.192,0.306,0.199pg/kg(L)，回收率都超過93%。蒙君麗等［24］用3個不同廠家的ELISA試劑盒檢測生鮮乳中黃曲霉毒素M1殘留量，得出試劑盒的回收率在93.5%~103.5%。通過分析對比可知，不同廠家的試劑盒測定結果精確度、準確性都較好。ELISA技術在生物毒素檢測方面雖取得了一定的進展，但由于缺乏毒素標準，抗體大多只是針對某種毒素建立，對其他毒素常表現(xiàn)出較低的交叉反應，要實現(xiàn)ELISA技術在生物毒素上的深入研究仍需要一定的努力。2.6轉基因食品的檢測轉基因食品現(xiàn)已成為當今發(fā)展最快的新型食品，轉基因食品的安全是伴隨著轉基因食品產業(yè)的發(fā)展而興起的一門新興學科，公眾對轉基因食品安全性和風險性的關注正越來越大。有些發(fā)達國家已實行強制性轉基因食品標識，賦予消費者知情權［25］。轉基因食品的食用安全性從過敏原、毒性、營養(yǎng)成分、標記基因方面來進行評價，目前，ELISA法是檢測轉基因目的蛋白的較常用的方法，主要用于原料和半成品的快速定性分析［26］，成功解決了檢測轉基因食品中核酸制備難的問題。張留圈［27］以磁珠液相及雙抗夾心ELISA法檢測出Bt中Cry1Ac蛋白毒素的檢出限為0.91ng/mL。劉志浩等［28］用雙抗體夾心ELISA法檢測出轉基因玉米中麟絲菌素乙酰轉移酶(PAT)最低檢測限為2.68ng/mL,檢測范圍為3.125-50ng/mL,ELISA法的再現(xiàn)性和準確性較好。目前市場上有許多常見的轉基因蛋白安全的ELISA試劑盒。我國現(xiàn)已研制出Bt9玉米粉中tarlinkCry9C蛋白的ELISA檢測試劑盒。顧煒煒等［29］成功研制出用直接競爭ELISA試劑盒檢測出轉基因食品中Btcry2Ab/2Ac殺蟲蛋白的線性檢測范圍為40~2000ng/mL,最低檢測限是40ng/mL,ELISA試劑盒大大簡化了整個操作流程。ELISA法實現(xiàn)了生產中大批樣品的快速檢測。但轉基因食品中可能將基因供體轉移到植物或者動物受體中［30］,會引發(fā)一些人體的過敏反應。目前已研究出了雞蛋過敏蛋白、花生過敏原蛋白和P-乳球蛋白過敏原的夾心ELISA方法。2.7食品中其他成分的檢測ELISA還可檢測食品中其他成分的含量變化。a.重金屬［31］、抗生素殘留［32］及營養(yǎng)因子的測定［33］。b.食品加工過程中酶(如轉谷氨酰胺酶和B-內酰胺酶)含量變化的測定［34］。c.測定保健食品中透明質酸［35］及乳制品中乳酸鏈球菌素的含量［36］。d.食品中各種蛋白質如IL2-HSA融合蛋白和燕窩中唾液酸糖蛋白的含量測定［37］。8采用ELISA技術檢測植物中微量的雌激素，需先合成不同的異黃酮的羥酸半抗原。ELISA技術具有簡便易操作，沒有同位素及放射性污染，試劑可長時間保存等優(yōu)點，同時也有一定的局限性，ELISA法檢測結果會受到一些其他不明因子的干擾，不可避免地出現(xiàn)定性假陽性與假陰性。ELISA法難于分析檢測不穩(wěn)定的化合物和分子量較小的化合物，并且不能進行多殘留檢測，使用ELISA技術同時分析檢測多種成分時較困難。隨著用于檢測食品安全的ELISA試劑盒不斷涌現(xiàn)，加快了ELISA試劑盒商業(yè)化和標準化進程，使ELISA技術有更明顯的優(yōu)勢，使越來越多的學者研究改良和完善這種技術的方法，可加快ELISA檢測中多項標記快速測定及高度免疫原性重組抗原的研究進程。要實現(xiàn)酶聯(lián)免疫吸附技術完全替代傳統(tǒng)技術，我們需準備大量的工作，可以與其他傳統(tǒng)檢測方法結合使用(如HPLC，GC/MS，PCR)，能彌補一些局限性，提高檢測結果的重現(xiàn)性和精準性。相信在不久的將來能夠實現(xiàn)在實驗室用ELISA法分析檢測近百種食品成分?？梢源_定，ELISA法在食品安全檢測領域具有廣闊的應用前景?！鞠嚓P文獻】陳棟.酶聯(lián)免疫檢測方法及其對食品安全檢查的重要作用[J].食品安全導刊，2016(9):17-18.張也，劉以祥.酶聯(lián)免疫技術與食品安全快速檢測[J].食品科學，2003，24(8):201-204.KatsoudasE,AbdelmessehHH.Enzymeinhibitionandenyme-linkedimmunosorbentassaymethodsforcarbamatepesticideresidueanalysisinfreshproduce[J].JFoodProt,2000，63(12):1758-1760.文孟棠.抗擬除蟲菊酯類農藥抗體的制備、鑒定及初步應用[D].咸陽：西北農林科技大學，2014:40-49.SkerrittJH,HillAS,RaoR,etal.Samplematrixinterferenceinimmunoassaysfororganochlorineresiduesinplant-derivedfoodsandsomestrategiesfortheirremoval[J].FoodandAgriculturalImmunology,2003,15(1):17-34.LisaM,ChouhanRS，VinayakaAC,etal.Goldnanoparticlesbaseddipstickimmunoassyfortherapiddetectionofdichlorodiphenyltrichloroethane:anorganochlorinepesticide[J].BiosensorsandBioelectronics,2009(25):224-227.華修德.有機磷農藥單殘留以及多殘留免疫分析方法的建立與應用[D].南京：南京農業(yè)大學，2009:140-145.張弛，潘家榮，帥瑞琪，等.動物性食品中硝基咪唑類獸藥多殘留酶聯(lián)免疫檢測方法的建立[J].核農學報，2016,30(2):323-331.崔廷婷，鐘建三，張瑜，等.動物源性食品中紅霉素殘留的ELISA檢測[J].四川畜牧獸醫(yī)，2015(1):29-31.董昕，王娟.鹽酸克倫特羅的殘留與食品安全[J].肉類研究，2006(12):37-38.[11]孫明君，鄭小龍，孫濤，等.進出口食用動物、飼料中鹽酸克倫特羅ELISA檢測方法的建立[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016(11):278-281.尤敏霞.酶聯(lián)免疫吸附法在食品檢驗中的應用[J].河南預防醫(yī)學雜志，2009，20(3):237-240.王旻子，應永飛，龔云飛，等.三聚氰胺單克隆抗體制備與鑒定[J].安徽農業(yè)科學，2012，40(5):2574-2576.閆瑾，趙美萍，李元宗，等.罌粟堿檢測方法研究進展[J].化學進展，2005，17(5):504-898.EladD,GinsburgD.Bulletinonnarcotics[J].CanadianMedicalAssociationJournal,1952(3):27-34.宋家銓，王新華，舒黎曄，等.酶聯(lián)免疫法快速檢測食品中罌粟堿[J].上海預防醫(yī)學雜志，2002，14(6):270-271.付麗紅，王曉聞.酶聯(lián)免疫吸附法在沙門氏菌檢測中的研究進展[J].中國釀造，2009(1):1-3.伍燕華，牛瑞江，賴衛(wèi)華，等.雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測沙門氏菌[J].食品工業(yè)科技，2014，35(10):62-65.SiamakPY，LivS，SigridS，etal.Developmentandevaluationofanimmunomagneticseparation-ELISAforthedetectionofstaphylococcusaureusthermostablenucleaseincompositemilk[J].VeterinaryMicrobiology,1999(67):113-125.暴銥，郭磊，陳佳，等.生物毒素檢測技術研究進展[J].分析化學評述與進展，2009，37(5):764-771.管笛，亢子佳，賈迪，等.磁性酶聯(lián)免疫吸附法檢測玉米中黃曲霉毒素B1[J].食品研究與開發(fā)，2016，37(5):101-105.歐小蕾.膝溝藻毒素GTX2，3單克隆抗體的制備及酶聯(lián)免疫快速檢測法的建立[D].湛江：廣東海洋大學，2015:61-68.[23悸平，謝體波，易重任，等.黃曲霉毒素M1ELISA試劑盒的檢測效果研究[J].食品安全質量檢測學報，2015(6):2298-2302.蒙君麗，宋蓀陽，鄭百芹，等.酶聯(lián)免疫法對生鮮乳中黃曲霉毒素的快速檢測[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40:39-41.徐茂軍.轉基因植物食品的檢測策略[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27(12):69-72.HolzhauserT,ViethsS.IndirectcompetitiveELISAfordeterminationoftracesofpeanut(ArachishypogaeaL.)proteinincomplexfoodmatrices[J].JAgricFoodChem，1999,47(2):603-611.張留圈.基于磁珠和雙抗夾心免疫分析的BtCry1Ac毒素單鏈抗體篩選、鑒定及應用[D].咸陽：西北農林科技大學，2014:41-44.[28]劉志浩，高麗麗，王新桐，等.轉基因玉米中麟絲菌素乙酰轉移酶雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立[J].西北農林科技大學學報，2013,41(11):46-50.顧煒煒，潘家榮.轉基因食品中Btcry2Ab/2Ac殺蟲蛋白直接競爭ELISA試劑盒的研制[J].食品科技，2007(6):203-206.劉靜，陳慶森.食品過敏原研究進展及其在食品安全重要性方面的探討[J].食品科技，2006(4):1-4.YWang,HYang,MPschenitza,etal.Highlysensitiveandspecificdeterminationofmercury(II)ioninwater,foodandcosmeticsampleswithanELISAbasedonanovelmonoclonalantibody[J].Analyti