生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)習(xí)課件：dna重組和重組dna技術(shù) 1

DNA重組和重組DNA技術(shù)DNARecombinationandRecombinantDNAtechnology第二十一章DNA重組（DNArecombination）是指不同DNA分子斷裂和連接而產(chǎn)生DNA片段的交換并重新組合形成新DNA分子的過程。重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnology）是指在體外將兩個或兩個以上DNA分子重新組合并在適當(dāng)細(xì)胞中增殖形成新DNA分子的過程。第一節(jié)

自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移

DNARecombinationandGeneTransferinNatureDNA重組同源重組(homologousrecombination)位點(diǎn)特異的重組(site-specificrecombination)轉(zhuǎn)座重組(transpositionrecombination)接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組（generalrecombination）。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的Holliday模型一、同源重組是最基本的DNA重組方式Holliday模型的4個關(guān)鍵步驟：兩個同源染色體DNA排列整齊；片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體；通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA；Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體（見模型圖左邊產(chǎn)物）：

切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體（見模型圖右邊產(chǎn)物）：

切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。

參與細(xì)菌DNA同源重組的酶有數(shù)十種，其中最關(guān)鍵的是RecA蛋白、RecBCD復(fù)合物和RuvC蛋白。RecBCD復(fù)合物具有三種酶活性，即依賴于ATP的核酸外切酶活性、可被ATP增強(qiáng)的核酸內(nèi)切酶活性以及需要ATP的解螺旋酶活性。RecA蛋白可結(jié)合單鏈DNA（ssDNA），形成RecA-ssDNA復(fù)合物。RuvC有內(nèi)切酶活性，能專一性識別Holliday連接點(diǎn)，并有選擇地切開同源重組體的中間體。

內(nèi)切酶

(recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移

(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holliday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′Holliday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體EMofaHollidayJunctionw/afewmeltedbasepairsaroundjunction二、位點(diǎn)特異重組是發(fā)生在特異位點(diǎn)間的DNA整合位點(diǎn)特異重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合。λ噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長末端重復(fù)序列(longterminalrepeat,LTR)。

（一）λ噬菌體DNA的整合（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組(倒位)。H片段上有兩個啟動子P，其一驅(qū)動hin基因表達(dá)，另一正向時驅(qū)動H2和rH1基因表達(dá)，反向(倒位)時H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白基因。H2鞭毛素

阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA啟動序列H1啟動序列沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個獨(dú)立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈(和)，一個編碼重鏈。

輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：LVJCLV

D

JC免疫球蛋白基因重排過程Ig基因可變區(qū)重排發(fā)生的分子機(jī)制

-重組信號序列（RSS）在各基因片段兩側(cè)存在。

-B細(xì)胞發(fā)育早期重組活化基因（RAG1/2）產(chǎn)物的出現(xiàn)。重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重組酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重組信號序列基因片段1.H基因庫（重鏈基因連鎖群）--第14號染色體2.κ

基因庫（κ鏈基因連鎖群）--第2號染色體3.λ基因庫（λ鏈連鎖群）--第22號染色體免疫球蛋白基因庫1.H鏈V基因（約95個）D基因（27個）J基因（6個）C基因（9個）2.κ

鏈Vκ

基因（100個）Jκ

基因（5個）Cκ

基因（1個）3.λ基因Vλ

基因（30個）Jλ-Cλ

基因（4個）免疫球蛋白基因結(jié)構(gòu)每條肽鏈的編碼基因可分為V區(qū)和C區(qū)兩大部分。其中V區(qū)的基因是由不同的基因片段拼接而成的。重鏈V區(qū)由V、D、J片段拼接；輕鏈由V、J拼接。免疫球蛋白多樣性發(fā)生的機(jī)制-組合造成的多樣性-連接造成的多樣性，堿基的缺失或加入-D基因形成的多樣性-體細(xì)胞突變形成的多樣性三、轉(zhuǎn)座重組可使基因移位由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個位置移動到另一位置。這些可移動的DNA序列包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。

插入序列(insertionsequences,IS)組成：IRTransposaseGeneIR（一）插入序列轉(zhuǎn)座二個分離的反向重復(fù)(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重復(fù)序列一個轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservativetransposition)復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicativetransposition)Somegeneticelementsmovetonewchromosomallocationsbytransposition插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一個染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子組成：

反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因

細(xì)菌的可流動性元件A插入序列：轉(zhuǎn)座酶編碼基因兩側(cè)連接反向末端重復(fù)序列(箭頭所示)B轉(zhuǎn)座子Tn3：含有轉(zhuǎn)座酶、β-內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉(zhuǎn)座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個相同的插入序列IS10L由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1983"forherdiscoveryofmobilegeneticelements"BarbaraMcClintockUSAColdSpringHarborLaboratory

ColdSpringHarbor,NY,USAb.1902

d.1992四、原核細(xì)胞可通過接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移或重組（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒DNA從一個細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)?？山雍腺|(zhì)粒如F因子(Ffactor)細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。質(zhì)粒（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用

(transformation)。例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（供體）細(xì)胞時，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)溶源菌生長途徑(lysogenicpathway)第二節(jié)

重組DNA技術(shù)RecombinantDNATechnology重組DNA技術(shù)的發(fā)展史1865年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗。1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗。1973年美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個重組DNA分子。1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉。重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。DNA克隆技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)

（即DNA克?。?/p>

細(xì)胞克隆個體克隆（動物或植物）

其主要過程包括：在體外將目的DNA片段與能自主復(fù)制的遺傳元件（又叫載體）連接，形成重組DNA分子，進(jìn)而在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增，從而獲得單一DNA分子的大量拷貝。重組DNA技術(shù)，又稱分子克?。╩olecularcloning）或DNA克?。―NAcloning）或基因工程（geneticengineering）技術(shù)

目的：①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）一、重組DNA技術(shù)中常用的工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉(zhuǎn)錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ①合成雙鏈cDNA分子或片段連接；②缺口平移制作高比活探針；③

DNA序列分析；④填補(bǔ)3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶①合成cDNA；②替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是一類核酸內(nèi)切酶，能識別雙鏈DNA分子內(nèi)部的特異序列,并裂解磷酸二酯鍵。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定義：

TypeIIcanrecognize

palindromesequences.

RestrictionendonucleaseGGATCCCCTAGGPalindromePalindromeisalsocalledinvertedrepeatsequence,whichmeansthenucleotidesequencein5′to3′directionisthesameinbothstrands.Palindrome（回文序列）客上天然居，居然天上客。僧游云隱寺，寺隱云游僧。Madam,I'mAdam.WasitacaroracatIsaw?與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）分類：作用：第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類酶識別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口黏端切口有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍末端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA

同尾酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同裂酶或同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同裂酶：名稱識別序列及切割位點(diǎn)名稱識別序列及切割點(diǎn)切割后產(chǎn)生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’

HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’

MboⅠ

5’…▼GATC...3’

NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后產(chǎn)生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后產(chǎn)生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’

限制性內(nèi)切核酸酶DNAligasesTheseenzymesareusedtojoin,or,annealtwostrandsodDNA.TheligasecatalysetheformationofphosphodiesterbondsbetweenthepemtosesandphosphategroupsoftwoadjacentDNAchains.AlkalinephosphataseRemove5’phosphategroupsfromDNAmolecules;BAPismorestalebutlessactivethanCIP.ReversetranscriptaseAnenzymefirstisolatedfromviruses:itwillformDNAfromanRNAtemplte,allowingcomplementary,orcopy,DNA(cDNA)tobeformedfrommRNA.ThisallowsdoublestrandedcDNAsequencestobeinsertedintosuitableplasmidvector,whichcanthenbeusedtotransformbacterialcells.TerminaltransferaseCatalysestheadditionofnucleotidestothe3'terminusofaDNAmolecule.Itdoesnotrequireatemplate.Thepreferredsubstrateofthisenzymeisa3'-overhang,butitcanalsoaddnucleotidestobluntorrecessed3'ends.DNApolymeraseⅠDNAPolymeraseI:prokaryoticDNApolymeraseinDNAreplication.PolIpossessesthreeenzymaticactivities:A5’->3’(forward)DNApolymeraseactivity.A3'->5'(reverse)exonucleaseactivitythatmediatesprofreading.A5'->3'(forward)exonucleaseactivitymediatingnicktranslationduringDNArepair.KlenowfragmentTheKlenowfragmentisalargeproteinfragmentproducedwhenDNApolymeraseIfromE.coliisenzymaticallycleavedbytheproteasesubtilisin.Itretainsthe5'-3'polymeraseactivityandthe3’→5’exonucleaseactivityforremovalofprecodingnucleotidesandproofreading,butlosesits5'→3'exonucleaseactivity.TaqDNApolymeraseHeatstaleDNApolymeraseformThermusaquaticus,abacteriumthatlivesinhotspringsItisabletowithstandtheprotein-denaturingconditions(hightemperature)requiredduringPCROneofTaq'sdrawbacksisitsrelativelylowreplicationfidelity.Itlacksa3’to5’exonucleaseproofreadingactivity,andhasanerrorratemeasuredatabout1in9,000nucleotidesT4polynucleotidekinase

CatalyzedthetransferofTerminal(γ)phosphatefromanucleotide5’triphosphatetoa5’hydroxylgroupofapolynucleotide.

二、重組DNA技術(shù)中常用的載體

定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。

載體按功能分為

克隆載體(cloningvector)

表達(dá)載體(expressionvector)

克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計的載體