實驗四-Hb的醋酸纖維薄膜電泳與血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳

實驗四

血紅蛋白的醋酸纖維薄膜電泳

與

血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳

血紅蛋白的醋酸纖維薄膜電泳

一、實驗?zāi)康模‥xperimentalObjectives）：1.掌握醋酸纖維薄膜電泳的操作2.了解血紅蛋白的組成及分類二、實驗原理(ExperimentalPrinciples)

蛋白質(zhì)離子在電場的作用下，可向著與其電性相反的電極移動。由于各種蛋白質(zhì)pI不同，在同一pH環(huán)境中所帶電荷量也不同，同時分子大小形狀各有差異，所以在同一電場中泳動速度不同。一般來說，所帶的電荷多而顆粒小者，泳動速度快，反之則慢。據(jù)此，可用電泳法將血清中的各種蛋白質(zhì)加以分離。三、實驗材料、主要儀器和試劑（Equipments,MaterialsandAgents）（一）試劑0.9%的NaCl溶液；

四氯化碳；

TEB緩沖液（pH8.6）；硼酸-氫氧化鈉緩沖液（pH8.6）；麗春紅染液；漂洗液。（二）實驗器材醋酸纖維薄膜；培養(yǎng)皿；濾紙；鑷子；玻璃板；電泳儀。四、操作步驟（OperatingProcedure）1.取血：用2%碘酒棉球消毒手指，再用75%酒精棉球脫碘，采血針穿刺，取血約0.05ml放入1.5ml離心管中，并輕輕搖勻。2.制備Hb液：1）洗滌紅細(xì)胞：加0.9%NaCl1ml于上述離心管中，顛倒混勻5-6次，4000rpm，離心3分鐘。棄上清，再加1ml0.9%NaCl重懸，相同條件重復(fù)離心一次。2）溶血：向紅細(xì)胞沉淀中加入蒸餾水2滴，搖勻，再加入四氯化碳1滴，振蕩混勻，相同條件再離心一次，取上清即得Hb液。3.電泳1）膜條準(zhǔn)備：2）點樣：把膜條從緩沖液中取出，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余液體，然后平鋪,（毛面朝上），用小玻片沾取適量Hb液，按印于點樣線上，點樣處離膜條邊緣1.5cm左右。3）電泳：在電泳槽內(nèi)加入緩沖液，膜條點樣面向下，上樣一端靠近負(fù)極，紗布條浸潤膜條搭成濾紙條并蓋嚴(yán)電泳室。通電先預(yù)電泳5-10min。調(diào)節(jié)電壓為150V，電泳時間約為25分鐘。4）染色：電泳完畢后將膜條取下并放在染色液中染色10分鐘。4.漂洗：取出染色膜條并移至漂洗液中漂洗至蛋白底色脫凈，觀察色帶清晰的電泳圖譜并分析結(jié)果。五、結(jié)果與分析：（ResultsandAnalysis）觀察膜條上Hb條帶的位置及顏色的深淺。六、思考題：(Questions)電泳分離蛋白質(zhì)的原理是什么？出現(xiàn)異常血紅蛋白的臨床意義是什么？

血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳

一、實驗?zāi)康模‥xperimentalObjectives）：1.掌握血清脂蛋白測定的臨床意義;2.了解血清脂蛋白電泳的基本原理及操作方法。二、實驗原理(ExperimentalPrinciples)：血清中的脂類物質(zhì)以不同的比例與載脂蛋白結(jié)合成脂蛋白。在pH較大的緩沖液中，脂蛋白帶負(fù)電荷，在電場中向正極泳動。各種脂蛋白因其所帶的負(fù)電荷量及顆粒大小、形狀等不同，在電場中的泳動速度也不一樣，故可將其分離，用不同方法顯色便可進(jìn)行定性、定量分析。用瓊脂糖凝膠作支持物進(jìn)行電泳，先將血清用脂類染料（蘇丹黑B或油紅O）預(yù)染，使脂蛋白著色，經(jīng)電泳后可將血清脂蛋白分成三條清晰的區(qū)帶，可用光密度計掃描定量，亦可將各脂蛋白區(qū)帶切下，進(jìn)行比色定量。三、主要設(shè)備、實驗材料和試劑（Equipments,MaterialsandAgents）（一）試劑巴比妥緩沖液（PH8.6I=0.075）；制膠緩沖液（PH8.6I=0.05）；

0.45%瓊脂糖凝膠；蘇丹黑B染色液：制膠緩沖液（PH8.6I=0.05）（二）設(shè)備電泳儀和電泳槽；普通離心機；水浴箱；微量加樣器、載玻片等四、操作步驟（OperatingProcedure）1．預(yù)染血清：取Eppendof

管一支，加入血清0.2ml及蘇丹黑B染料液0.02ml，混勻后置于37°C水浴中預(yù)染30分鐘，2000rpm離心5分鐘，取上清液備用。(已備好）2.制備瓊脂糖膠板：將0.45%的瓊脂糖凝膠水浴煮沸溶解后，倒入電泳槽中，凝固后即可使用。3.點樣：將加樣梳輕輕拔出，用微量加樣器吸取預(yù)染血清約15μl，注入上述凹槽內(nèi)。4.電泳：將點樣的凝膠板平行放于電泳槽中，點樣端置于負(fù)極。用浸泡了電極緩沖液的紗布搭橋，使凝膠板兩端與電泳槽緩沖液相連。平衡3-5分鐘。接通電源，調(diào)電壓100V，約45分鐘，觀察到分開的電泳條帶后關(guān)閉電源，取出凝膠板觀察結(jié)果。五、結(jié)果與分析（ResultsandAnalysis）肉眼觀察各區(qū)帶的顏色深淺寬窄及其排列順序，繪圖紀(jì)錄之。正常人血清脂蛋白可