第十八章氨基酸已課件

第十八章氨基酸已1概述氨基酸是構(gòu)成蛋白成分。第一個(gè)用發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸是谷氨酸。目前世界上可用發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸有20多種。2氨基酸的用途1.食品工業(yè)：強(qiáng)化食品(賴氨酸，蘇氨酸，色氨酸于小麥中)增鮮劑：谷氨酸單鈉和天冬氨酸苯丙氨酸與天冬氨酸可用于制造低熱量二肽甜味劑(α-天冬酰苯丙氨酸甲酯)，此產(chǎn)品1981年獲FDA批準(zhǔn)，現(xiàn)在每年產(chǎn)量已達(dá)數(shù)萬(wàn)噸。2.飼料工業(yè)：甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造動(dòng)物飼料。3必需氨基酸的木桶模式圖453.醫(yī)藥工業(yè)：多種復(fù)合氨基酸制劑可通過(guò)輸液治療營(yíng)養(yǎng)或代謝失調(diào)。苯丙氨酸與氮芥子氣合成的苯丙氨酸氮芥子氣對(duì)骨髓腫瘤治療有效，且副作用低。4.化學(xué)工業(yè)：谷氨基鈉作洗滌劑，丙氨酸制造丙氨酸纖維。6生產(chǎn)氨基酸的大國(guó)為日本和德國(guó)。日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵及德國(guó)的德固沙是世界氨基酸生產(chǎn)的三巨頭。它們能生產(chǎn)高品質(zhì)的氨基酸，可直接用于輸液制劑的生產(chǎn)。日本在美國(guó)、法國(guó)等建立了合資的氨基酸生產(chǎn)廠家，生產(chǎn)氨基酸和天冬甜精等衍生物。7國(guó)內(nèi)生產(chǎn)氨基酸的廠家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司，但目前無(wú)論生產(chǎn)規(guī)模及產(chǎn)品質(zhì)量還難于與國(guó)外抗衡。在80年代中后期，我國(guó)從日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵以技貿(mào)合作的方式引進(jìn)輸液制劑的制造技術(shù)和仿造產(chǎn)品，1991年銷(xiāo)售量為二千萬(wàn)瓶，1996年達(dá)六千萬(wàn)瓶，主要廠家有無(wú)錫華瑞，北京費(fèi)森尤斯，昆明康普萊特，但生產(chǎn)原料都依賴進(jìn)口。據(jù)專(zhuān)家估計(jì)，到2010年，世界氨基酸產(chǎn)值可達(dá)50億美元，占生物技術(shù)市場(chǎng)的8%，國(guó)內(nèi)的氨基酸產(chǎn)值可達(dá)40億元，占全國(guó)發(fā)酵產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值的12%。8第一節(jié)氨基酸的生產(chǎn)一、氨基酸的生產(chǎn)方法（一）提取法：生產(chǎn)氨基酸最早采用的生產(chǎn)方法。將蛋白質(zhì)原料酸水解，然后從水解液中抽提出氨基酸。

（二）直接發(fā)酵法：利用微生物的作用直接將糧食原料經(jīng)過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸。野生菌株發(fā)酵、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變發(fā)酵、抗氨基酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物突變株發(fā)酵、抗氨基酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物突變株的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵和營(yíng)養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株發(fā)酵。9（三）添加前體法：利用微生物轉(zhuǎn)化相應(yīng)的氨基酸的前體，成為相應(yīng)的氨基酸。如：利用嗜甘油棒桿菌將甘氨酸轉(zhuǎn)化為絲氨酸。（四）酶法：利用微生物產(chǎn)生的酶來(lái)制造氨基酸。如賴氨酸、色氨酸等可用此法。（五）合成法：用化學(xué)合成的方法制造氨基酸。

DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。10氨基酸生產(chǎn)方法的比較合成法發(fā)酵法酶法原料石油碳源和氮源底物和酶產(chǎn)物濃度高低高產(chǎn)物類(lèi)型DL-型L-型L-型副產(chǎn)物少多少11名稱制法名稱制法L-纈氨酸發(fā)酵法、合成法L-半胱氨酸抽提法L-亮氨酸抽提法、發(fā)酵法L-酪氨酸抽提法L-異亮氨酸發(fā)酵法甘氨酸合成法L-蘇氨酸發(fā)酵法DL-丙氨酸合成法DL-蛋氨酸合成法L-丙氨酸發(fā)酵法L-蛋氨酸合成法、酶法L-絲氨酸發(fā)酵法L-苯丙氨酸合成法L-谷氨酸胺發(fā)酵法L-色氨酸合成法、發(fā)酵法L-谷氨酸發(fā)酵法L-賴氨酸發(fā)酵法、酶法L-脯氨酸發(fā)酵法L-精氨酸發(fā)酵法、抽提法L-羥基脯氨酸抽提法L-組氨酸發(fā)酵法、抽提法L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵法L-天門(mén)冬氨酰發(fā)酵法L-瓜氨酸發(fā)酵法L-天門(mén)冬氨酸酶法12二、氨基酸產(chǎn)生菌的選育氨基酸是細(xì)胞組分，受到嚴(yán)格的代謝調(diào)節(jié)控制。想讓菌種積累大量的某一個(gè)氨基酸，必須打破微生物對(duì)該氨基酸的代謝調(diào)控。如選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型或氨基酸類(lèi)似物抗性突變，可以減弱或消除氨基酸終產(chǎn)物阻遏。第一節(jié)氨基酸的生產(chǎn)13（一）氨基酸產(chǎn)生菌的分離氨基酸生產(chǎn)菌的要求：代謝途徑比較清楚，代謝途徑比較簡(jiǎn)單1.產(chǎn)生菌的來(lái)源：采樣分離；一般為細(xì)菌（棒桿菌屬，短桿菌屬、節(jié)桿菌屬或小桿菌屬的棒型細(xì)菌）；分離時(shí)要抑制真菌（50μg/mL匹馬菌素）2.分離方法：平板分離二、氨基酸產(chǎn)生菌的選育143.篩選方法關(guān)鍵：①設(shè)計(jì)一種適合氨基酸產(chǎn)生的生產(chǎn)培養(yǎng)基根據(jù)其生物合成知識(shí)設(shè)計(jì)，如谷氨酸的生產(chǎn)需生物素；蛋氨酸的前體為β-甲基硫基-α-羥基丁酸等。②確定一種大規(guī)模篩選的氨基酸檢測(cè)方法二、氨基酸產(chǎn)生菌的選育15氨基酸檢測(cè)方法：A.平板培養(yǎng)+覆蓋培養(yǎng)基（含氨基酸鑒定菌）產(chǎn)生菌在氨基酸生產(chǎn)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)高強(qiáng)度紫外線照射倒入氨基酸測(cè)定培養(yǎng)基（含氨基酸鑒定菌——氨基酸缺陷型）培養(yǎng)：菌落周?chē)被徼b定菌生長(zhǎng)16B.可逆抑制測(cè)定法例：L-苯丙氨酸產(chǎn)生菌的篩選β-2噻吩丙氨酸是枯草桿菌的抑制劑，而L-苯丙氨酸專(zhuān)一解除此抑制。苯丙氨酸產(chǎn)生菌在生產(chǎn)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)倒入培養(yǎng)基（含指示菌（枯草）和抑制劑β-2噻吩丙氨酸）培養(yǎng)：菌落周?chē)甘揪L(zhǎng)苯丙氨酸測(cè)定培養(yǎng)基17C.液體培養(yǎng)基中氨基酸產(chǎn)生菌的檢測(cè)a.過(guò)濾除菌發(fā)酵液（含該菌產(chǎn)生的AA）+氨基酸測(cè)定培養(yǎng)基（含氨基酸鑒定菌——該AA缺陷）→37℃，16-23h，測(cè)定細(xì)胞密度或濁度。b.發(fā)酵培養(yǎng)基（不接種產(chǎn)生菌）+已知濃度的特定氨基酸樣品+鑒定菌→37℃，16-23h，測(cè)定細(xì)胞密度或濁度。18（二）氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的選育方案1.配制以下培養(yǎng)基2.誘變與營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的分離3.營(yíng)養(yǎng)要求的測(cè)定二、氨基酸產(chǎn)生菌的選育191.配制以下培養(yǎng)基①基本培養(yǎng)基(MM)：能滿足野生型菌株正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基；②完全培養(yǎng)基(CM)：能滿足各種營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等；③補(bǔ)充培養(yǎng)基(SM)：在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)成分，以滿足相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)的合成培養(yǎng)基。202.誘變與營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的分離誘變：物理誘變、化學(xué)誘變↓淘汰野生型：抗生素（青霉素）法↓檢出缺陷型：影印法、點(diǎn)種法、夾層法等檢出原理：利用固體培養(yǎng)基，缺陷型在CM上生長(zhǎng)良好，在MM上則不生長(zhǎng)，而野生型都能生長(zhǎng)。213.營(yíng)養(yǎng)要求的測(cè)定利用補(bǔ)充培養(yǎng)基(SM)（在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的氨基酸成分）。22（三）氨基酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性突變株的選育1.目的：解除氨基酸的反饋抑制和阻遏2.突變株形成原因：參看課本P3563.氨基酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物二、氨基酸產(chǎn)生菌的選育23對(duì)氟苯丙氨酸苯丙氨酸D-精氨酸精氨酸乙硫氨酸異亮氨酸-氨基--羥基戊酸（AHV)蘇氨酸S-（2-氨基乙基）-L-半胱氨酸(AEC)賴氨酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物目標(biāo)產(chǎn)物24（四）細(xì)胞透性改變突變株的選育1.目的：使胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物迅速滲漏出去，解除末端產(chǎn)物的反饋抑制。2.方法:①透性酶（誘發(fā)突變）②生理學(xué)手段——直接抑制膜的合成或使膜受缺損（生物素缺陷型）

③膜缺損突變株——油酸缺陷型、甘油缺陷型④添加適量的青霉素二、氨基酸產(chǎn)生菌的選育25三、氨基酸發(fā)酵的代謝控制（一）發(fā)酵條件控制（二）生產(chǎn)菌株的穩(wěn)定26（一）發(fā)酵條件控制控制因子發(fā)酵轉(zhuǎn)換氧乳酸或琥珀酸←→谷氨酸（通氣量不足）（通氣量充足）NH4+α-酮戊二酸←→谷氨酸←→谷酰胺（減少）（適量）（過(guò)量）pHN-乙酰谷酰酸←→谷氨酸（酸性）（中性或微堿性7-8

）磷酸纈氨酸←→谷氨酸（高濃度磷酸）生物素乳酸或琥珀酸←→谷氨酸（飽和）（限量--亞適量）表谷氨酸產(chǎn)生菌因培養(yǎng)條件的代謝變化33～35℃；34-37℃27谷氨酸發(fā)酵罐的培養(yǎng)基裝量比為0.7，接種量為0.5%～1%，前期溫度為33～35℃，后期為36～38℃，通氣1∶0.11～0.13(V/V)，發(fā)酵12h后開(kāi)始流加尿素。維持發(fā)酵液pH在7.0以上，pH下降后再次流加尿素，需要流加3～5次。提?。喊l(fā)酵液用鹽酸調(diào)到pH4.0～4.5，初結(jié)晶，2h后調(diào)pH3.0～3.2，降溫結(jié)晶，虹吸去上層，下層經(jīng)離心處理的粗谷氨酸，收率可達(dá)到80%。精制：粗谷氨酸溶于適量水，用活性炭脫色，加入碳酸鈉，中和成鹽，再進(jìn)一步精制得到谷氨酸成品。28谷氨酸的生物合成途徑大致是：葡萄糖經(jīng)糖酵解(EMP途徑)和己糖磷酸支路(HMP途徑)生成丙酮酸，再氧化成乙酰輔酶A(乙酰COA)，然后進(jìn)入三羧酸循環(huán)，生成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的催化及有NH4+存在的條件下，生成谷氨酸。當(dāng)生物素缺乏時(shí)，菌種生長(zhǎng)十分緩慢；當(dāng)生物素過(guò)量時(shí)，則轉(zhuǎn)為乳酸發(fā)酵。因此，一般將生物素控制在亞適量條件下，才能得到高產(chǎn)量的谷氨酸。29（二）生產(chǎn)菌株的穩(wěn)定防止回復(fù)突變（以賴氨酸發(fā)酵為例）：1.增加遺傳標(biāo)記——如雙缺陷型(hom-+met-)2.除定期純化外，盡可能用遺傳標(biāo)記明顯、回復(fù)率低的菌株3.營(yíng)養(yǎng)充分(AA)，防止回復(fù)突變株占優(yōu)勢(shì)4.添加藥劑——防止回復(fù)突變株生長(zhǎng)（如賴氨酸產(chǎn)生菌比回復(fù)突變株對(duì)紅霉素的敏感性低，）30優(yōu)先合成反饋抑制阻遏④①O-琥珀酸高絲氨酸天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸-β-半醛高絲氨酸二氫吡啶-2，6-二羧酸賴氨酸高絲氨酸磷酸蘇氨酸蛋氨酸異亮氨酸②③⑤高絲氨酸脫氫酶hom天冬氨酸激酶31一、賴氨酸的生物合成途徑微生物的賴氨酸生物合成存在兩條不同的途徑，即二氨基庚二酸途徑與α-氨基已二酸途徑。前者存在于細(xì)菌、綠藻和高等植物之中，后者存在于酵母霉菌之中。生產(chǎn)上用谷氨酸棒桿菌、北京棒桿菌、黃色短桿菌等細(xì)菌。理想的產(chǎn)生菌應(yīng)為hom–+AECr+AHVr高絲氨酸脫氫酶（hom）S-（2-氨基乙基）-L-半胱氨酸(AEC)——賴氨酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物-氨基--羥基戊酸(AHV)——蘇氨酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物第二節(jié)賴氨酸發(fā)酵3233二、賴氨酸發(fā)酵的研究1.防止回復(fù)突變（第一節(jié)已述及）2.發(fā)酵控制（菌種、工藝不同而異）碳源：糖蜜、葡萄糖、蔗糖等。氮源：硫酸銨、尿素、氨水、玉米漿、麩皮水解液、豆餅水解液等。發(fā)酵前期：菌體生長(zhǎng)期，很少產(chǎn)酸（0-20h）。產(chǎn)酸期：至放罐工藝控制：溫度32℃

、補(bǔ)氨控制pH6.5-7.5、種齡和種量、供氧、維生素B1、生物素、營(yíng)養(yǎng)鹽等。34控制氧的重要性：供氧不足，將導(dǎo)致乳酸積累，并可能導(dǎo)致賴氨酸生產(chǎn)受到不可逆抑制。（與細(xì)胞膜透性有關(guān)）pH控制：補(bǔ)氨添加某些物質(zhì)→培養(yǎng)基→菌種生長(zhǎng)代謝狀態(tài)優(yōu)→可以提高賴氨酸合成量。第三節(jié)蘇氨酸發(fā)酵（自學(xué)）第四節(jié)異亮氨酸、亮氨酸發(fā)酵（自學(xué)）35思考題：1.氨基酸的生產(chǎn)方法2.氨基酸產(chǎn)生菌的選育篩選的關(guān)鍵。3.篩選氨基酸產(chǎn)生菌的檢測(cè)方法？請(qǐng)?jiān)敿?xì)敘述。4.工業(yè)生產(chǎn)中某氨基酸高產(chǎn)菌株的篩選，經(jīng)常選育其它代謝相關(guān)氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。其選育原理是什么（高產(chǎn)原因）？請(qǐng)?jiān)敿?xì)敘述篩選方案。5.細(xì)胞透性改變突變株的選育的目的是什么？如何使產(chǎn)生菌的細(xì)胞透性增加？6.在氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)中，一般情況下均使用營(yíng)養(yǎng)缺陷型的生產(chǎn)菌株。為了菌株在發(fā)酵過(guò)程中的穩(wěn)定性，如何防止產(chǎn)生菌發(fā)生回復(fù)突變？36谷氨酸棒狀桿菌合成谷氨酸的途徑葡萄糖中間代謝產(chǎn)物α—酮戊二酸谷氨酸抑制過(guò)多切斷減少谷氨酸脫氫酶NH4+原因：生物素是脂肪酸生物合成中酶的輔基，此酶可催化物質(zhì)反應(yīng)，最終與合成細(xì)胞膜磷脂的主要成分—脂肪酸有關(guān)。---把生物素的濃度控制在亞適量的情況下，才能分泌大量的谷氨酸。改變細(xì)胞膜的透性37黃色短桿菌合成賴氨酸的途徑高絲氨酸脫氫酶天冬氨酸激酶天冬氨酸高絲氨酸甲硫氨酸中間產(chǎn)物Ⅰ中間產(chǎn)物Ⅱ蘇氨酸賴氨酸？改變微生物的遺傳特性---應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株解除反饋調(diào)節(jié)

高絲氨酸缺陷型菌株不能合成高絲氨酸酶，故不能合成高絲氨酸，也不能合成蘇氨酸和甲硫氨酸。在補(bǔ)給適量的高絲氨酸的條件下,就可產(chǎn)生大量的賴氨酸。？抑制過(guò)量蘇氨酸賴氨酸38影印法完全培養(yǎng)基影印接種基本培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)缺陷型39菌絲過(guò)濾法篩選營(yíng)養(yǎng)突變株基本培養(yǎng)基

接入微生物孢子（含營(yíng)養(yǎng)突變株）涂布均勻后培養(yǎng)長(zhǎng)出菌絲體（野生型）菌絲過(guò)濾得營(yíng)養(yǎng)突變株40限量補(bǔ)充培養(yǎng)法

微量蛋白質(zhì)的完全培養(yǎng)基上小菌落是營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株41夾層培養(yǎng)法及結(jié)果小菌落是第二次長(zhǎng)起來(lái)的（營(yíng)養(yǎng)缺陷型）42

逐個(gè)檢出法涂布