花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)

花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)第一頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一主要內(nèi)容花粉和花藥培養(yǎng)技術(shù)花粉和花藥培養(yǎng)應(yīng)用第二頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一(1)掌握花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)的區(qū)別(2)了解花藥最佳接種時(shí)期(3)掌握花藥培養(yǎng)的大致過(guò)程(4)掌握花粉發(fā)育的四種途徑(5)掌握花粉培養(yǎng)的大致過(guò)程教學(xué)目的與要求第三頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一胚珠第四頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一第五頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一花的結(jié)構(gòu)第六頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一第七頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一花藥是花的雄性器官，花藥培養(yǎng)屬器官培養(yǎng)；花粉是單倍體細(xì)胞，花粉培養(yǎng)與單細(xì)胞培養(yǎng)相似花藥和花粉都可以在培養(yǎng)過(guò)程中誘導(dǎo)單倍體細(xì)胞系和單倍體植株。單倍體植株經(jīng)過(guò)染色體加倍就成為純合二倍體植株，這樣可縮短育種周期，獲得純系?；ㄅ嘁殉蔀橹参镉N的一種重要手段。

一、概述第八頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一植物的花粉是花粉母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂形成的，其染色體數(shù)目只有體細(xì)胞的一半，叫做單倍體細(xì)胞(haploidcell)?；ǚ酆突ㄋ幍呐囵B(yǎng)(pollenandantherculture)是指花粉在培養(yǎng)基上改變其正常發(fā)育和機(jī)能，不經(jīng)受精而發(fā)生細(xì)胞分裂，由單個(gè)花粉粒發(fā)育成完整植株的技術(shù)。用離體培養(yǎng)花藥的方法使花粉發(fā)育成一個(gè)完整的植株，叫做單倍體植物(haplobiont)。一、概述第九頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一花藥培養(yǎng)是將花粉發(fā)育至一定階段的花藥接種到人工培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，以形成花粉胚或愈傷組織進(jìn)而分化成植株的技術(shù)。第十頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一

花粉和花藥培養(yǎng)的研究意義誘導(dǎo)形成單倍體，快速獲得純系，縮短育種周期有利于篩選隱性突變體，提高選擇效率獲得無(wú)病毒個(gè)體有利于隱性基因控制性狀的選擇快速獲得自交系的超雄株單倍體植株育種第十一頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一

花藥培養(yǎng)簡(jiǎn)史1964年：印度學(xué)者古哈(Guha)和馬斯瓦瑞（Maheswari）將南洋金花花藥培養(yǎng)發(fā)育成胚1967年：包金(Bourgin)和尼奇(Nitsch)花藥培養(yǎng)獲得煙草植株1973年：我國(guó)首次報(bào)道了小麥花藥培養(yǎng)獲得再生植株目前：許多農(nóng)作物及經(jīng)濟(jì)植物通過(guò)花粉培養(yǎng)都能誘導(dǎo)成植株第十二頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一花藥培養(yǎng)的主要目的，是培育花粉粒的單倍體植株，并使單倍體加倍，作為育種材料的來(lái)源。利用雜種花藥離體培養(yǎng)獲得的再生植株，由不同基因型的配子發(fā)育而來(lái)，具有豐富的變異類型，選擇出有利的變異類型，經(jīng)過(guò)經(jīng)濟(jì)性狀鑒定后，選出優(yōu)良者直接用于生產(chǎn)或配制雜交組合，獲得優(yōu)良雜交種子。構(gòu)建永久性分離群體－雙單倍體系（Doubledhaploid)，用于基因定位。雙單倍體：是指單倍體細(xì)胞（花粉或卵細(xì)胞）經(jīng)過(guò)人工或自發(fā)加倍后得到雙單倍體細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化可發(fā)育為單雙倍體植株。

花藥培養(yǎng)與單倍體育種第十三頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一大大縮短育種周期通過(guò)多次自交或近交獲得的幾乎是同質(zhì)結(jié)合的品系單倍體植株再通過(guò)某種手段使染色體組加倍（如秋水仙素處理）從而使植物恢復(fù)正常染色體數(shù)第十四頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一確定取材時(shí)間選擇大致處于所需要時(shí)期的花蕾。由于花粉發(fā)育時(shí)期和植株的某些外部形態(tài)特征之間的大致相關(guān)性，因此利用這些外部標(biāo)志，選擇符合條件的花蕾，經(jīng)鏡檢確定花粉發(fā)育的準(zhǔn)確時(shí)期。在水稻中，以單核靠邊期的花粉對(duì)誘導(dǎo)單倍體植株較為適宜，在外部形態(tài)上可根據(jù)葉枕距為5～15cm，穎片（禾本科植物小穗基部，由苞片轉(zhuǎn)變而成）淡黃綠色、雄蕊長(zhǎng)度接近穎片長(zhǎng)度的1/2這些條件來(lái)判斷。二、花藥培養(yǎng)技術(shù)第十五頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一水稻花藥培養(yǎng)旗葉鞘用70％酒精擦洗一遍剝?nèi)テ烊~鞘，取出稻穗左手持穗，右手用鑷子取出花藥，無(wú)菌培養(yǎng)皿中70％酒精，洗2遍用接種環(huán)接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天后，花藥變黑褐色，20天花藥裂開，長(zhǎng)出淡黃色的花粉愈傷組織，先形成芽，后長(zhǎng)出根，形成幼苗。第十六頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一選取主穗（一級(jí)側(cè)枝）的花蕾，因?yàn)橐患?jí)側(cè)枝的花蕾發(fā)育良好，數(shù)量大，發(fā)育同步。操作過(guò)程中不應(yīng)使花藥受到損傷，若受損傷，則應(yīng)淘汰，因?yàn)閾p傷常常會(huì)刺激花粉壁形成二倍體的愈傷組織。注意事項(xiàng)第十七頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一光照(12~18h，5,000~10,000lx，28℃)黑暗(12-16h，22℃)周期交替進(jìn)行?；ㄋ幣囵B(yǎng)的條件第十八頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一①花粉發(fā)育時(shí)期是影響培養(yǎng)效果的重要因素在誘導(dǎo)花粉進(jìn)行雄性發(fā)育(指小孢子沿孢子體途徑發(fā)育成花粉植株)過(guò)程中，不同物種花粉最適的發(fā)育時(shí)期不同，對(duì)多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，單核中期或晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈傷組織。如南洋金花、煙草和芍藥中的最適時(shí)期是第一次有絲分裂時(shí)期或稍前后，禾本科植物在單核早期(大麥)或單核中期(玉米、小麥)反應(yīng)最好，番茄在減數(shù)分裂中期時(shí)更適宜。1、影響花藥誘導(dǎo)頻率的因素第十九頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一②花藥供體植株的生長(zhǎng)條件對(duì)花藥培養(yǎng)反應(yīng)的影響很大例如：水稻、小麥、大麥等禾本科植物，主莖穗比分蘗穗花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率明顯地提高，同步化程度高。第二十頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一③培養(yǎng)基是花藥培養(yǎng)中影響花粉啟動(dòng)和再分化的重要條件我國(guó)科學(xué)工作者對(duì)水稻、小麥的花藥培養(yǎng)基做了改進(jìn)，研制出N6培養(yǎng)基。在N6培養(yǎng)基上，水稻花粉的出愈率大幅度提高。N6培養(yǎng)基的特點(diǎn)是銨離子濃度較低。隨后，進(jìn)一步降低銨鹽和硝酸鹽濃度，同時(shí)附加生物素，研制出C17和W14培養(yǎng)基，它們可以大幅度提高小麥的花藥出愈率。以馬鈴薯提取液為基本成分的馬鈴薯培養(yǎng)液，現(xiàn)在被廣泛地應(yīng)用于小麥花藥培養(yǎng)，效果良好。

第二十一頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一培養(yǎng)基中的植物生長(zhǎng)物質(zhì)的種類會(huì)影響花粉發(fā)育的途徑一般在禾本科植物中，常用1～5mg/L2,4-D或NAA誘導(dǎo)花粉愈傷組織形成，再將愈傷組織轉(zhuǎn)移至降低或去除生長(zhǎng)素或補(bǔ)加細(xì)胞分裂素類物質(zhì)的分化培養(yǎng)基上，以誘導(dǎo)器官分化和再生植株形成。第二十二頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一培養(yǎng)基中糖的種類對(duì)花粉胚的誘導(dǎo)和分化有顯著影響朱至清等(1990)報(bào)道在過(guò)濾滅菌的條件下，若以0.21mg/L葡萄糖取代液體培養(yǎng)基中同等濃度的蔗糖，小麥花粉胚的誘導(dǎo)頻率可增加2～10倍。一般說(shuō)來(lái)，高蔗糖濃度可以抑制體細(xì)胞的生長(zhǎng)而對(duì)花粉的生長(zhǎng)無(wú)妨礙。最適蔗糖濃度：煙草的為3％水稻為3％～6％玉米則為12％～15％第二十三頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一在培養(yǎng)基中加入活性炭能促進(jìn)花藥培養(yǎng)水稻的柱頭-花藥第二十四頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一以1～5℃預(yù)低溫處理小麥幼穗，能提高花粉愈傷組織的產(chǎn)量。例如，在4℃下冷凍石刁柏花蕾，預(yù)處理4天、8天和12天，愈傷組織誘導(dǎo)率比室溫對(duì)照分別提高2.4倍、1.9和1.5倍。各種植物要求預(yù)處理的溫度和時(shí)間不同。2、低溫預(yù)處理可以提高花粉胚的誘導(dǎo)頻率第二十五頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一小麥要求先高溫培養(yǎng)64天之后，再轉(zhuǎn)入28～30℃下培養(yǎng)。一直高溫培養(yǎng)效果并不好。較高的溫度雖能誘導(dǎo)較高頻率的花粉愈傷組織，但愈傷組織分化白化苗的頻率也高?？刂婆囵B(yǎng)溫度仍是減少白化苗的一個(gè)有效措施。培養(yǎng)溫度是影響花藥反應(yīng)的一個(gè)重要因素第二十六頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一3、花藥培養(yǎng)過(guò)程花藥材料的選取關(guān)鍵選取處于合適發(fā)育期的花藥，離體培養(yǎng)后才能啟動(dòng)花粉發(fā)育。實(shí)踐表明，從減數(shù)分裂期至雙核期的花藥，均有可能誘導(dǎo)離體孤雄發(fā)育。大多數(shù)園藝植物的花藥培養(yǎng)，成功率最高的時(shí)期為單核期，或單核中晚期。第二十七頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一黃心烏花藥培養(yǎng)甜椒花藥培養(yǎng)第二十八頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一草莓花藥愈傷組織再生植株花藥植株第二十九頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一杜蘭小麥的花藥培養(yǎng)A花藥在BAD-3誘導(dǎo)下，3周后形成胚狀體和愈傷組織B另一個(gè)花藥在BAC-1培養(yǎng)基中已愈傷組織中長(zhǎng)出葉片C

更多的花藥在BAD-3培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織與子葉D

從BAC-1轉(zhuǎn)移到BAD-1分化培養(yǎng)基中形成的愈傷組織E

在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-6周，愈傷組織開始分化根和綠色的新芽F

在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-8周，可形成大量的根和幼莖G在MS再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)8周后，可由最初的花藥形成小植株H由花藥形成的健壯小植株I

花藥形成的植株在同樣的MS再生培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，可因培養(yǎng)條件改變而形成不正常的植株第三十頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一花粉植株染色體可自發(fā)加倍人工措施染色體加倍傳統(tǒng)方法是用秋水仙素處理。較大濃度的秋水仙素溶液處理單倍體植株，時(shí)間為24～96h。浸泡試管苗方法處理芽方法浸根方法單倍體植株的二倍化第三十一頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一花藥培養(yǎng)脫毒1974年日本：花藥培養(yǎng)可以脫除草莓病毒；花藥采取時(shí)期單核期：花蕾4-6mm，花藥1mm花藥誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+瓊脂7g/L增殖培養(yǎng)基MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+瓊脂7g/L生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+瓊脂7g/L第三十二頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一毛曼陀羅花藥培養(yǎng)，并誘發(fā)再生植株第三十三頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一三、花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)成苗途徑與花藥培養(yǎng)比較:

相同點(diǎn)：胚狀體成苗途徑、愈傷組織再分化成苗途徑

不同點(diǎn)：花粉培養(yǎng)：需進(jìn)行花粉的分離特殊的花粉誘導(dǎo)培養(yǎng)第三十四頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一一、花粉培養(yǎng)的操作過(guò)程選幼年玉蘭樹花蕾取下花蕾（鏡檢）預(yù)培養(yǎng)數(shù)天取花藥接種分離花粉藥壁向花粉提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)藥壁吸收、貯存和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的外源物質(zhì)過(guò)濾離心再生低溫預(yù)處理消毒第三十五頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、培養(yǎng)基1.基本培養(yǎng)基2.激素種類和濃度3.蔗糖濃度第三十六頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一1、基本培養(yǎng)基MS和H培養(yǎng)基：適合雙子葉植物花藥培養(yǎng)B5培養(yǎng)基：適合豆科和十字花科花藥培養(yǎng)N6培養(yǎng)基：適合禾谷類作物的花藥培養(yǎng)第三十七頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一

細(xì)胞分裂素可促進(jìn)胚狀體形成

生長(zhǎng)素可誘導(dǎo)愈傷組織形成細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比值高時(shí)可誘導(dǎo)愈傷組織分化苗2、激素種類和濃度第三十八頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一較高濃度蔗糖可誘導(dǎo)花粉形成愈傷組織較低濃度蔗糖可使愈傷組織分化成苗3、蔗糖濃度第三十九頁(yè)，共四十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一三、單倍體植株染色體加倍的方法單倍體植物天然發(fā)生的途徑：孤雌生殖無(wú)配子生殖孤雄生殖也稱單性生殖，即卵不