蛋白質(zhì)的分離、純化和表征

蛋白質(zhì)的分離、純化和表征第一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二

蛋白質(zhì)的等電點：當溶液在某一定pH值時，使某特定蛋白質(zhì)分子上所帶正負電荷相等，成為兩性離子，在電場中即不向陽極移動也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點（pI）。在等電點時，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場中不移動。在外液pH低于等電點的溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場中向負極移動；在外液pH高于等電點的溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負電荷，在電場中向正極移動。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳—帶電粒子在電場中移動的現(xiàn)象。一、蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點第二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二

蛋白質(zhì)含有酸/堿AA殘基具有兩性堿/酸越大——pI越大pI通常在6.0左右一、蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點第三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀（一）膠體性質(zhì)（colloidalsystem）膠體溶液的特點：分子直徑在1-100nm內(nèi)溶于水不易聚集沉淀大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液第四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：1.同種蛋白帶同種電荷，相互排斥2.水膜彈性蛋白質(zhì)溶液具有丁達爾效應、布朗運動以及不能通過半透膜等性質(zhì)第五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二（二）蛋白質(zhì)的沉淀

Pr從膠體溶液中析出

Ⅰ可逆沉淀：溫和條件，改變?nèi)芤簆H或Pr所帶電荷Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒有變化適當條件下可重新溶解

——非變性沉淀pI沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等

第六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二不可逆沉淀強烈沉淀條件破壞Pr膠體溶液穩(wěn)定性也破壞Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沉淀不能再重新溶解——變性沉淀如加熱沉淀、強酸/堿沉淀、重金屬鹽和生物堿沉淀等Ⅱ第七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二1.鹽析法加入中性鹽脫去蛋白質(zhì)的水化層，鹽析一般不引起變性第八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二等電點沉淀的蛋白質(zhì)溶液中加入NaCl后沉淀溶解—鹽溶原因？鹽溶—鹽析分子在等電點時，相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中鹽溶第九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二鹽析向蛋白質(zhì)溶液中加入大量硫酸銨后蛋白質(zhì)會沉淀析出原因？蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀鹽析（（NH4）2SO4）第十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二2.有機溶劑沉淀脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點間的相互作用3.等電點沉淀第十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二4.重金屬鹽沉淀與帶負電荷蛋白質(zhì)結(jié)成不溶性鹽5.生物堿試劑和某些酸類沉淀與帶正電荷蛋白質(zhì)生成不溶性鹽6.加熱變性沉淀天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，破壞水化層及帶電狀態(tài)第十二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二一.

分離純化蛋白質(zhì)的意義1.研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能：

要求純度高，不變性；2.提取活性的酶或蛋白質(zhì)：

必須保持天然活性狀態(tài)；3.作為藥物或食品添加劑：

純度要求一般。二、蛋白質(zhì)提純的總目標：

增加制品純度或比活力，設法除去變性的蛋白質(zhì)和其他雜蛋白，且希望所得的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量達到最高值。三、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則第十三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二三、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標：增加制品純度或比活1.前處理：因動/植物/細菌而異2.粗分級分離：采用鹽析/等電點沉淀/有機溶劑分級分離等方法3.細分級分離：采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等4.結(jié)晶第十四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二2、根據(jù)溶解度分等電點沉淀鹽析（常用硫酸銨）有機溶劑沉淀3、根據(jù)電離性質(zhì)分電泳離子交換層析1、根據(jù)分子大小分透析或超濾離心沉淀凝膠過濾層析4、特異親和力：親和層析沉降平衡離心法沉降速度離心法四、蛋白質(zhì)的分離純化方法第十五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二五、蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法

1、透析和超過濾利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜將其與小分子物質(zhì)分開半透膜為玻璃紙或纖維素材料第十六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第十七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二血液透析小分子溶出小分子被帶出透析機透析液加壓血液第十八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二凝膠過濾第十九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二凝膠過濾所用介質(zhì)為凝膠珠，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)一定型號的凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應大小的分子進入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外洗脫時大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積小；小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來穿去，歷程長，后洗脫下來，洗脫體積大.測定蛋白質(zhì)分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex第二十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二（二）利用溶解度差別的純化方法

1.等電點沉淀調(diào)整溶液pH

不同蛋白在各自pI處依次沉淀

2.鹽溶和鹽析第二十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二2.

鹽析

在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量高濃度的強電解質(zhì)鹽如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，可破壞蛋質(zhì)分子表面的水化層，中和它們的電荷，因而使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。而低濃度的鹽溶液加入蛋白質(zhì)溶液中，會導致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶。鹽析的機理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷。鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法，該方法不會使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。第二十二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二3.有機溶劑分級分離法降低介電常數(shù)爭奪水化膜第二十三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二電泳原理蛋白質(zhì)在非等電點時所帶總電荷不為0分子大小不同，電場中移動速度也不同蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點。在等電點時(IsoelectricpointpI)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場中不移動。在不同的pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學性質(zhì)不同。在等電點偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負電荷，在電場中向正極移動；在等電點偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場中向負極移動。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳(Electrophoresis)。第二十四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二電泳遷移率(泳動度)電場力F=q×E=q×U/d摩擦力Ff=f×VV/E=q/f蛋白質(zhì)的泳動度反映了一種蛋白質(zhì)的特性電泳遷移率(泳動度)m=V/E

第二十五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二水平式平板凝膠電泳垂直式平板凝膠電泳第二十六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二等電聚焦電泳第二十七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二雙向電泳蛋白質(zhì)雙向電泳第二十八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二離子交換層析六離子交換層析第二十九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二（七）利用蛋白質(zhì)選擇性吸附的性質(zhì)羥磷石灰層析疏水作用層析第三十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二利用選擇性吸附的純化方法1．羥基磷灰石層析：羥基磷灰石即結(jié)晶磷酸鈣（Ca10(PO4)6(OH)2），它能吸附蛋白質(zhì)，加大離子強度可將蛋白質(zhì)洗脫下來。2．疏水作用層析：疏水層析介質(zhì)有苯基瓊脂糖、辛基瓊脂糖等，蛋白質(zhì)分子通過疏水作用與層析介質(zhì)結(jié)合，通過能減弱疏水作用的洗脫液將不同蛋白質(zhì)分別洗脫下來。

第三十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二（八）利用對配體的特異生物學

親和力的純化方法親和色譜顆粒具有極強的專一性第三十二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第三十三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二六、蛋白質(zhì)含量測定和純度鑒定第三十四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二蛋白質(zhì)的分子量一般在一萬至一百萬道爾頓之間

1道爾頓＝1×C12絕對質(zhì)量/12≈1.66×10-27千克一、蛋白質(zhì)分子的大小第三十五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二（一）根據(jù)化學組成測定最小分子量1、測定蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量2、假設蛋白質(zhì)中僅含一個鐵原子最低相對分子質(zhì)量=100*55.8/鐵的百分含量第三十六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二（二）凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量第三十七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二蛋白質(zhì)混合樣凝凝膠法只適于球狀蛋白分子測量第三十八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二（三）SDS－PAGE測定相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)顆粒電泳時遷移率取決于：所帶電荷分子量分子形狀第三十九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第四十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二十二烷基磺酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)變性？磺酸基極性親水烷基親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）遷移率與電荷和形狀無關(guān)，僅取決于相對分子質(zhì)量巰基乙醇破壞二硫鍵第四十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第四十二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第四十三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第四十四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二沉降速度法測定相對分子量直接測定蛋白質(zhì)Mr的方法：滲透壓法、光散射法、沉降速度法、沉降平衡法、黏度法。其中沉降速度法是經(jīng)典的常用方法。沉降系數(shù)S見書P40蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)S與相對分子量Mr的關(guān)系斯維得貝格方程第四十五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二蛋白質(zhì)的含量測定與純度測定（一）蛋白質(zhì)的含量測定1．雙縮脲法雙縮脲試劑：稱取1.5gCuSO4·

5H2O和6g酒石酸鉀鈉溶于500ml水中，在不斷攪拌下，加入300ml10%NaOH，稀釋至1000ml。

3ml蛋白質(zhì)溶液加2ml雙縮脲試劑，540nm比色。2．紫外吸收法

280nm比色，測定后蛋白質(zhì)溶液還能回收，操作簡便，但精確度不高。第四十六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二蛋白質(zhì)含量測定Ⅱ3．Folin-酚法（Lowry法）蛋白質(zhì)中的酪氨酸或半胱氨酸，能與Folin-酚試劑起氧化還原反應，生成藍色化合物，500nm比色測定。

Folin-酚試劑的配制比較復雜。4．BCA法蛋白質(zhì)還原Cu2

+成Cu+，與4,4’-二羧基-2,2’-二喹啉（BCA）形成配合物，顯紫色，比色測定。

第四十七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二蛋白質(zhì)含量測定Ⅲ5．染料結(jié)合法（Bradfo