蛋白質(zhì)的修飾和表達

蛋白質(zhì)的修飾和表達第一頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達一、功能基團的特異性修飾多位點取代單一的限制性取代次級取代二、基于蛋白質(zhì)片段的嵌合修飾嵌合蛋白質(zhì)—非共價締合系統(tǒng)二硫鍵與嵌合蛋白質(zhì)的形成嵌合蛋白質(zhì)—通過化學(xué)激活形成肽鍵嵌合蛋白質(zhì)—通過酶連接反應(yīng)形成肽鍵通過非肽鍵形成嵌合蛋白質(zhì)第九講蛋白質(zhì)的修飾和表達第二頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一雖然基因重組表達技術(shù)的應(yīng)用對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的研究以及蛋白質(zhì)分子的改造提供了一條非常有效的途徑，然而用化學(xué)方法直接對蛋白質(zhì)分子進行修飾有時仍然是很有用的方法，可以彌補正常生物表達體系的不足。例如，利用化學(xué)法和酶法相結(jié)合，可以從豬胰島素制備人胰島素；通過區(qū)段特異性取代制備適合于腫瘤定位的抗體；對用重組方法得到的多肽進行C末端酰化以及制備各種類型的蛋白質(zhì)嵌合體等。因此化學(xué)法和重組方法的相互補充，使蛋白質(zhì)工程的實施更有效。蛋白質(zhì)工程的化學(xué)方法通常是產(chǎn)生半合成的結(jié)構(gòu)，在此結(jié)構(gòu)中一個天然的多肽與一個人造（或化學(xué)修飾）的多肽相締合。產(chǎn)生這種締合的方法主要有4種：①非共價締合、②產(chǎn)生二硫鍵、③形成肽鍵以及④產(chǎn)生非天然型的共價鍵連接。

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑第三頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一在20種天然氨基酸的側(cè)鏈中，大約有一半可以在足夠溫和的條件下產(chǎn)生化學(xué)取代而不使肽鍵受損，其中氨基、巰基和羧基特別容易產(chǎn)生有用的取代。因為任何給定的氨基酸殘基在蛋白質(zhì)分子中可能出現(xiàn)不止一次，如果用化學(xué)的方法對氨基酸進行修飾時，正常情況下所有相關(guān)的氨基酸側(cè)鏈都要被取代。對于氨基和羧基基團，盡管處在側(cè)鏈上和末端基團的pK值有差別，但在化學(xué)上很難將肽鏈的α-氨基或α-羧基基團與側(cè)鏈上的氨基或羧基相區(qū)別。很多在臨床上重要的肽其C末端是被酰化的。但當(dāng)用重組的方法得到這些產(chǎn)物時，其C末端是自由羧基。在自然界能進行這種?；饔玫难趸阁w系很難實用化。尋找一種有效的方法，使C末端的谷氨酸和天冬氨酸酰胺化，而不作用于處在肽鏈中的谷氨酸和天冬氨酸仍是努力的方向。

■一、功能基團的特異性修飾第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑第四頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一氨基可用取代基進行修飾。常用的取代基有兩種：t-butyloxy-carbonyl(Boc)是典型的酸不穩(wěn)定取代基，而Methanesulphonylethyloxycarbonyl(Msc)是典型的堿不穩(wěn)定取代基。這兩種基團常用于對氨基進行臨時保護，以防止其他反應(yīng)試劑對氨基的作用。當(dāng)其他反應(yīng)完成后，可分別用無水三氟乙酸和強堿將Boc和Msc基團去除，很多多肽或小分子蛋白質(zhì)在這些基團去除后仍保持其活性?！鲆弧⒐δ芑鶊F的特異性修飾第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★1.多位點取代

※(1)常規(guī)的氨基保護

第五頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一絕大多數(shù)氨基取代反應(yīng)至今尚無可靠方法將α-氨基和ε-氨基區(qū)分，但亞氨代乙酰化反應(yīng)是一特例，盡管對α-氨基和ε-氨基的區(qū)分尚不完美。當(dāng)ε-氨基幾乎完全被亞氨代乙?；〈鷷r，α-氨基在很大程度上可不被修飾。被亞氨代乙?；〈陌被钥山怆x。完全亞氨代乙?；牡鞍踪|(zhì)仍保持其在水溶液中的可溶性，其性質(zhì)與修飾前一樣或相近，因此通常在修飾后這一基團可不必從蛋白質(zhì)分子上去除。只有在處于與蛋白質(zhì)活性相關(guān)的賴氨酸殘基的側(cè)鏈被修飾后，導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性喪失。然而，亞氨代乙?；磻?yīng)在較低pH值下可形成烷基亞胺，

N-烷基亞胺可進一步與賴氨酸側(cè)鏈產(chǎn)生交聯(lián)，從而影響被修飾蛋白質(zhì)的活性。因此，在對ε-氨基進行修飾時，要適當(dāng)?shù)乜刂品磻?yīng)條件，使反應(yīng)向著形成Nε-乙酰亞胺化的反應(yīng)進行。

★1.多位點取代

※(2)亞氨代乙酰基

第六頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一羧基的甲基酯化一般可以在室溫下將蛋白質(zhì)加入到含有乙酰氯的無水甲醇中來完成。由于反應(yīng)產(chǎn)生鹽酸，需將反應(yīng)物及時地稀釋到冰水中，小心地用堿中和鹽酸以使多肽或小分子蛋白質(zhì)活力得以保持。半胱氨酸出現(xiàn)在蛋白質(zhì)分子中的概率比其他氨基酸要小。相對于其他功能基團而言，巰基有著十分不同類型的化學(xué)反應(yīng)，因此半胱氨酸殘基是一個很好的靶位，利用這一靶位可以將少數(shù)的取代基團引入到蛋白質(zhì)分子的確定位置。當(dāng)一對半胱氨酸通過二硫鍵相連時，通?？杉尤攵蛱K糖醇之類的還原劑或通過磺酸氧化將其打開。用磺酸氧化的方法往往比簡單還原的方法要好，因為磺酸氧化形成的半胱氨酸的磺酸化殘基對氧化作用很穩(wěn)定，而且可以通過巰基將其還原成自由琉基?！?.多位點取代

※(3)其他的側(cè)鏈取代

第七頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一用化學(xué)方法對蛋白質(zhì)分子上單一的特定功能基團（如α-氨基）進行修飾而不對與其相類似的基團（如ε-氨基）產(chǎn)生作用是一件很困難的事。少數(shù)的化學(xué)試劑，如α-異硫氰酸苯酯在嚴格控制的條件下可對α-氨基進行相當(dāng)特異性的修飾，而不作用于ε-氨基。由于酶蛋白可以將兩個極相似的基團區(qū)分開來，所以可利用酶蛋白的這一特異性對蛋白質(zhì)分子的功能基團進行特異性修飾。在天然狀態(tài)下，蛋白水解酶是催化肽鍵的水解，其作用機制是酶的活性位點首先被一羧基酯化（此羧基來自于被切開的肽鍵），所產(chǎn)生的?；?酶中間體隨之通過水分子的親核攻擊而分解：

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2.單一的或限制性取代

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑第八頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一按照同樣的機制，上面這個水解反應(yīng)可以逆向進行，這樣在蛋白水解酶的存在下肽鍵可以重新形成，即一個肽的氨基（或其他非肽的親核物）攻擊?；?酶中間體，從而導(dǎo)致肽鍵的形成。這一逆反應(yīng)（肽連接）的成立無論在科學(xué)理論上還是在實際應(yīng)用上都具有重要的意義。因為在常規(guī)肽合成中對氨基酸側(cè)鏈進行保護的操作可以省去，以這種可逆方式進行的酶連接反應(yīng)至少可以達到每年100kg的生產(chǎn)規(guī)模。

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★

2.單一的或限制性取代

第九頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一特異性的C末端取代是另一類反應(yīng)：

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑通常在水溶液中，由蛋白水解酶所催化的反應(yīng)以壓倒的優(yōu)勢向水解方向進行。因為①在反應(yīng)基質(zhì)中水分子具有高活性；②在相當(dāng)寬的pH值范圍內(nèi)，新釋放出的氨基和羧基具有解離傾向。如果要使式(3-3)或式(3-4)的反應(yīng)逆向進行，通常要耗費大量的能量去抑制這些荷電的傾向。如果所生成的產(chǎn)物沉淀，根據(jù)質(zhì)量作用的原則將推動此反應(yīng)向著合成方向進行。但當(dāng)產(chǎn)物是大分子時，產(chǎn)物與底物之間在溶解度上的差異很小，利用某些巧妙的生物學(xué)上特異親和過程來捕捉回收產(chǎn)物的研究甚少。

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2.單一的或限制性取代

第十頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一圍繞能量問題人們提出了一個很有吸引力的方法，即向反應(yīng)混合物中加入未荷電且易與其融和的溶劑(共溶劑，cosolvent)。共溶劑不但減少了水的有效濃度，而且若加入量足夠，還可使介電常數(shù)降得很低，結(jié)果使α-氨基和羧基解離過程的pK值變得很接近，最終導(dǎo)致解離能對偶聯(lián)反應(yīng)的妨害大大降低，使反應(yīng)向著合成方向進行。常用的共溶劑有丁烷-1,4-二醇、甘油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜等。這些溶劑的變性傾向大致上依序增加。因為在加入溶劑的同時要保持水解酶的活力，所以在實踐中要找到水的最適含量。在可控的條件下，利用蛋白水解酶催化肽鍵的形成有著很高的應(yīng)用價值。第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★

2.單一的或限制性取代

第十一頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑需要指出的是：第一，對于成功的連接取代反應(yīng)，原來肽鍵的斷開和隨后的偶聯(lián)不必作為一個單一的濃縮過程。如果在肽鍵已經(jīng)切開的情況下，合成反應(yīng)要快很多倍，因而在正常水解條件下使肽鍵斷開是最簡單和最好的辦法。然后在同一個反應(yīng)管中，通過下列操作校正反應(yīng)條件，使反應(yīng)向著有利于肽鍵合成的方向進行。這些校正過程包括：①對連接反應(yīng)來說加入大大過量的氨基成分(式(3-5))；②對于C末端取代來說加入大大過量的其他親核化合物以及共溶劑，將pH值改變到所要的新pK值的中點，通常加入足夠額外的酶去補償由于pH值的變化和共溶劑的存在而導(dǎo)致的催化反應(yīng)變慢。第二，此方法并不需要肽底物沒有其他的側(cè)鏈，而這些側(cè)鏈通常在水解反應(yīng)中來滿足蛋白水解酶特異性的需要。

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2.單一的或限制性取代

第十二頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑相對于ε-氨基而言，α-異硫氰酸苯酯對α-氨基的修飾并非絕對特異，但當(dāng)試劑限制在低濃度，特別是pH值保持在足夠低而使α-氨基和ε-氨基解離的程度出現(xiàn)最大差異時，此反應(yīng)對α-氨基而言有相當(dāng)?shù)奶禺愋浴栏竦卣f，這個反應(yīng)并不對α-氨基形成一個可逆的保護，但經(jīng)酸處理時能將α-異硫氰酸苯酯和與其反應(yīng)的N末端氨基酸殘基去除。α-異硫氰酸苯酯與α-氨基反應(yīng)如下

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2.單一的或限制性取代

※(l)α-異硫氰酸苯酯對α-氨基的選擇性第十三頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★

2.單一的或限制性取代

※(2)C末端取代——蛋白質(zhì)活性親核成分的產(chǎn)生

將式(3-5)的R-NH2換成H2N-NH-CO-NH-NH2(1,1’-羰基二酰肼)。這個化合物有若干方便之處：①作為酰肼，其一NH2基的pK值比通常的α-氨基要低幾個單位，這樣，-COOH和-NH2成分的pK值已很接近羰基酰肼，使得共溶劑不再必需；②這種化合物分子對稱，意味著-NH-NH2基團的有效濃度兩倍于按mg/ml的計算值；第十四頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★

2.單一的或限制性取代

※(2)C末端取代——蛋白質(zhì)活性親核成分的產(chǎn)生

③與蛋白質(zhì)分子的羧基相互作用形成的產(chǎn)物是具有區(qū)域特異性的酰肼基團，這個強的親核物的化學(xué)反應(yīng)性與蛋白質(zhì)分子中的任何天然功能基團很不像。這種反應(yīng)性使得其可在溫和的水溶液條件下與各種試劑進行特異性反應(yīng)，而這些試劑通常不能與蛋白質(zhì)分子上的功能基團相反應(yīng)。這樣，可用酰肼對胰島素、抗體片段、完整抗體等的C末端進行特異性修飾。

第十五頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★

2.單一的或限制性取代

※(3)C末端取代——蛋白醛的產(chǎn)生

醛基是另一種符合下列兩個條件的反應(yīng)基團：①其反應(yīng)性與蛋白質(zhì)天然功能基團不同；②可在溫和的水溶液條件下進行反應(yīng)。在上述反應(yīng)中，H2NCH2-CHOH-CH2NH2作為親核化合物，高碘酸作為氧化劑。由于H2NCH2-CHOH-CH2NH2結(jié)構(gòu)對稱，因此其有效工作濃度加倍。但這種化合物與羰酰肼不同，它是一類初級胺，其具有通常的pK值并且與蛋白質(zhì)C末端進行反應(yīng)需要共溶劑存在。通過這些反應(yīng)所形成的蛋白醛可與其他試劑進行特異性反應(yīng)。

第十六頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑如果將式(3-5)中的R-NH2改成NH3，就可以得到一個特異性C末端被酰胺化的產(chǎn)物。雖然此反應(yīng)的產(chǎn)率不是很高，但仍可用。如果R-NH2是一個氨基酸酰胺，則可得到特異性地酰胺化的產(chǎn)物，且產(chǎn)率非常高。這一方法很有希望代替天然酰胺化系統(tǒng)而用于大規(guī)模生產(chǎn)中。

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2.單一的或限制性取代

※(4)通過蛋白質(zhì)水解的逆反應(yīng)產(chǎn)生蛋白和肽的α-酰胺第十七頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑此方法只適用于糖蛋白，所發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)更似在高碘酸和鄰位二醇之間的反應(yīng)。如果糖蛋白是研究主體，在蛋白質(zhì)分子上最好是只有單一的糖基元或少數(shù)幾個位點被糖基化。太多的糖基化區(qū)會使氧化反應(yīng)產(chǎn)生太多的醛基位點。所生成的蛋白醛可以進一步同其他分子產(chǎn)生特異性的反應(yīng)。絕大多數(shù)糖二醇并沒有像1-氨、2-羥基化合物那樣對高碘酸的反應(yīng)性，因此要用較高濃度的高碘酸，又不可能用二醇作為原位清除劑，所以在這樣條件下，蛋白質(zhì)分子中的一些敏感殘基如半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸可能遭到某種程度的氧化。

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2.單一的或限制性取代

※(5)蛋白醛——由糖的化學(xué)氧化產(chǎn)生

第十八頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★

3.次級取代

※(1)與蛋白醛偶聯(lián)——親核取代物

上面所說的方法是位點或區(qū)域特異性地產(chǎn)生蛋白質(zhì)活性親核物和蛋白醛，在正常反應(yīng)條件下這些衍生物可以保持其活性。因此，可以利用這些在自然界不存在的化學(xué)反應(yīng)性與具有適當(dāng)互補反應(yīng)性的分子進一步反應(yīng)，從而形成非常有用的接合體。氨基-氧化合物(羥胺衍生物)很容易同蛋白醛形成肟鍵：肟鍵在生理條件或近生理條件下相當(dāng)穩(wěn)定，因而很少需要通過還原來穩(wěn)定和蛋白之間形成的連接。另一方面腙健隨著時間慢慢地被破壞，因而與蛋白質(zhì)分子之間所形成的腙鍵在臨床上常用于需要將所連接的分子慢慢釋放的情況。為了使通過腙鍵連接的分子完全穩(wěn)定，腙鍵可通過用氫硼化腈的還原來穩(wěn)定：第十九頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★

3.次級取代

※(2)與蛋白質(zhì)活性親核物偶聯(lián)―醛取代物具有自由α-氨基的絲氨酰和蘇氨?；衔锟蓸O快地被高碘酸氧化，所產(chǎn)生的化合物易與蛋白質(zhì)親核物偶聯(lián)。這種反應(yīng)不但可用于產(chǎn)生小的，非蛋白分子的絲氨?；蛱K氨酰衍生物，也可以用于整個蛋白質(zhì)或蛋白片段，其前提條件是絲氨酰或蘇氨酰殘基必須處于蛋白質(zhì)或蛋白片段的N末端，因為對鏈內(nèi)的絲氨?；蛱K氨酰殘基不能產(chǎn)生作用。另外預(yù)先存在的氨-氧化合物能被轉(zhuǎn)化成醛基化合物。這是一個非常有用的方法，因為只要保存足夠的氨-氧化合物，就可以隨時將其轉(zhuǎn)變成醛的形式。

第二十頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一一個蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)在最大程度上依賴于側(cè)鏈間的非共價相互作用。在多肽鏈中如果出現(xiàn)一個切口并不必然使多肽鏈的兩部分分開（在少數(shù)情況下，在多肽鏈中出現(xiàn)多于一個切口，蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)仍可維待），而且經(jīng)常甚至能保持其生物活性。如果在某些變性系統(tǒng)中，這種非共價的相互作用被破壞，可導(dǎo)致兩個多肽鏈分開。如果將兩個片段再混合到一起，在非變性的基質(zhì)中仍可形成原來的構(gòu)型，活力也可以隨之恢復(fù)。這一現(xiàn)象可用來產(chǎn)生半合成的類似物。進一步發(fā)現(xiàn)充分利用非共價締合的方法研究蛋白質(zhì)功能構(gòu)象的形成和功能表達的關(guān)系，將是非常有意義的。

■二、基于蛋白質(zhì)片段的嵌合修飾

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★1.嵌合蛋白質(zhì)―非共價締合系統(tǒng)

通過非共價鍵相互作用、二硫鍵、常規(guī)肽鍵（通過化學(xué)法或酶法產(chǎn)生）或其他非肽共價鍵，可以將較小的肽段連在一起，這就是通過半合成對蛋白質(zhì)進行工程操作的原則。

第二十一頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一彼此分開的多肽鏈片段可以通過二硫鍵連接起來，這是產(chǎn)生半合成類似物的另一種方法。如果這些鍵橋用還原劑（如DTT二硫蘇糖醇）處理被打開，則多肽片段彼此分開。這些片段中的一個片段可以與適當(dāng)?shù)谋恍揎椀幕蚝铣傻牧硪浑亩蜗嗷旌?，通過重新形成二硫鍵而形成新的嵌合分子。通過這種方法使人們對胰島素和抗體的結(jié)構(gòu)功能有了很清楚的了解。

■二、基于蛋白質(zhì)片段的嵌合修飾

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★2.二硫鍵與嵌合蛋白質(zhì)的形成

第二十二頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一很多方法可以形成肽鍵，這可以在有關(guān)肽合成的有關(guān)文獻中查到。在此只介紹利用活性酯的方法將單一氨基酸殘基加到一個肽鏈的N末端的方法。其主要方式是利用活性酯實現(xiàn)化學(xué)偶聯(lián)，反應(yīng)過程如式(3-12)。在這個反應(yīng)中，對除了α-氨基以外的所有氨基首先要進行保護，當(dāng)然這種保護是可逆的。人們曾利用這一方法成功地產(chǎn)生細胞色素C的類似物。

■二、基于蛋白質(zhì)片段的嵌合修飾

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★3.嵌合蛋白質(zhì)―通過化學(xué)激活形成肽鍵

第二十三頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■二、基于蛋白質(zhì)片段的嵌合修飾

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★4.嵌合蛋白質(zhì)―通過酶連接反應(yīng)形成肽健

蛋白水解酶有能力進行與水解可逆的反應(yīng)。在此我們更加關(guān)注一些非自然界的氨基酸或肽的新的親核物?！?1)從豬胰島素生產(chǎn)人胰島素

豬胰島素與人胰島素分子在一級結(jié)構(gòu)上的惟一差異是在B鏈的C末端氨基酸殘基，豬胰島素的B30是Ala殘基，而人的是Thr殘基。豬胰島素來源豐富，如能將豬胰島素改造成人胰島素，在臨床應(yīng)用上將是非常有意義的。Thr(But)-OBut是蘇氨酸的側(cè)鏈-OH和α-COOH用叔丁基保護，與豬胰島素混合，在胰蛋白酶的催化下，使Thr(But)-OBut取代豬胰島素B30位的丙氨酸(Ala)，在Lys和Thr之間形成肽鍵，叔丁基隨后用三氟乙酸處理去除，這樣就使豬胰島素轉(zhuǎn)變成人胰島素。目前用與此相似的方法可以每年從豬胰島素生產(chǎn)100kg水平的人胰島素用于人類糖尿病的治療。

第二十四頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■二、基于蛋白質(zhì)片段的嵌合修飾

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★4.嵌合蛋白質(zhì)―通過酶連接反應(yīng)形成肽健

※(2)片段的縮合

新的親核物不必須像單個氨基酸衍生物那樣小，較大的肽也可以作為親核物與半合成的肽縮合形成嵌合蛋白質(zhì)。然而隨著肽親核物分子量的增加，其縮合效率就受很大影響。產(chǎn)生這種縮合效率下降的原因中，反應(yīng)物的濃度限制比空間障礙還要大?！?3)通過酶法與活性酯偶聯(lián)

活性酯偶聯(lián)所用的親核物是活性酯，其α-氨基不需要保護。以二氯苯酯為例，其反應(yīng)是：

羥基琥珀酰亞胺酯也可以作為活性酯通過酶進行偶聯(lián)。第二十五頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■二、基于蛋白質(zhì)片段的嵌合修飾

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★5.通過非肽鍵形成嵌合蛋白質(zhì)

利用雙功能試劑可以將不同的蛋白質(zhì)分子連到一起。常用的方法是將雙功能的接頭與兩個蛋白質(zhì)分子中的賴氨酸殘基側(cè)鏈相連接。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)分子間的連接可以更可控和具位點特異性，如可以用主鏈肟鍵產(chǎn)生尾-尾相連二聚體。這類二聚體可用于進行多方面的研究，比如，若單體是適于活化的抗體的Fab片段的話，就可以利用這種方法制備具不同功能的F(ab)2

類似物。同樣，通過將一個C末端活化的蛋白質(zhì)親核物與一個特異性N末端醛衍生物之間相連，也可以產(chǎn)生頭尾相連的蛋白質(zhì)嵌合體。第二十六頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達一、編碼基因的專一性位點和區(qū)域性定向突變編碼基因的專一性位點突變區(qū)域性定向突變二、基因融合與基因剪接利用基因融合技術(shù)表達外源基因的緣由基因融合的策略產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子嵌合體的方法蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子間的連接第九講蛋白質(zhì)的修飾和表達三、tRNA介導(dǎo)定點攙入非天然氨基酸第二十七頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一基因突變技術(shù)是通過在基因水平上對其編碼的蛋白質(zhì)分子進行改造，在其表達后用來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的一種方法。這一技術(shù)的出現(xiàn)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的研究產(chǎn)生了革命性的變化，可以使人們隨心所欲地研究特定氨基酸殘基、特定結(jié)構(gòu)元件在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)形成和功能表達中的作用。根據(jù)其特點，可將基因突變分為兩大類：位點特異性突變和隨機突變。位點特異性突變又可大體分為三種類型：一類是通過寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變；第二類是盒式突變或片段取代突變；第三類是利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，以雙鏈DNA為模板進行的基因突變。無論哪種方法都可以在為蛋白質(zhì)編碼的基因序列上產(chǎn)生插入、缺失、取代等突變。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第二十八頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、編碼基因的專一性位點和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點突變專一性位點突變又稱特異性位點突變。這類突變都是在含有突變序列的寡核苷酸引物介導(dǎo)下進行的，因此又稱為寡核苷酸介導(dǎo)的位點特異性突變。這種突變的方法從問世至今不斷更新，特別是PCR技術(shù)出現(xiàn)后變得更高效。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(l)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素

第二十九頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、編碼基因的專一性位點和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點突變第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(l)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素

①關(guān)于DNA模板的制備：根據(jù)所用的方法，用于進行位點特異性突變的DNA模板可以是單鏈DNA或雙鏈DNA。對于雙鏈DNA而言，一般制備質(zhì)粒DNA的方法都可以滿足其需要；而對于單鏈DNA而言，可以直接從M13噬菌體載體或通過噬菌粒來制備單鏈DNA，用于突變的單鏈DNA模板要足夠純凈，即使有小的RNA分子（來源于裂解細胞）污染，也可能造成隨機延伸起始。第三十頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、編碼基因的專一性位點和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點突變第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(l)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素

②關(guān)于寡核苷酸突變引物的設(shè)計和選擇：用于突變的引物必須具備如下特性：(a)它們必須與在模板鏈上的目標DNA序列有必要的互補區(qū)；(b)它們必須足夠長，以便特異地與目標DNA序列退火；(c)突變引物應(yīng)盡可能避免形成穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的回文序列、重復(fù)序列或自身互補序列；第三十一頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、編碼基因的專一性位點和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點突變第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(l)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素

②關(guān)于寡核苷酸突變引物的設(shè)計和選擇：(d)所選用的突變引物不能同目標基因其他區(qū)域和載體DNA形成穩(wěn)定的雜交體。這可以用計算機軟件同源性分析程序來確定。如果它們之間的序列有連續(xù)8個以上的堿基完全配對，就需對寡核苷酸突變引物同模板DNA的雜交特異性進行分析，以確定突變引物的可用性。

第三十二頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、編碼基因的專一性位點和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點突變第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(l)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素

突變寡核苷酸序列的設(shè)計取決于所要產(chǎn)生的突變類型：(a)對用于取代、插入、缺失單個核苷酸的寡核苷酸突變引物，一般的長度為17-19個核苷酸，其突變位點距其5端為8-10個核苷酸，距其3端為7-9個核昔酸。這種設(shè)計可保證寡核苷酸引物的5端和3端同模板形成完全穩(wěn)定的雜交體，使突變效率提高。第三十三頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、編碼基因的專一性位點和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點突變突變寡核苷酸序列的設(shè)計取決于所要產(chǎn)生的突變類型：(b)對用于產(chǎn)生多處缺失、插入或取代兩個以上毗鄰核苷酸突變引物，一般長度為25個核苷酸以上，其突變區(qū)的兩側(cè)至少要有12-15個同模板DNA完全配對的核苷酸，以確保在引物延伸的溫度下，突變寡核苷酸引物的兩邊都能穩(wěn)定地與模板DNA退火，進行堿基配對，可根據(jù)公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)，推算引物兩側(cè)冀區(qū)之一的熱穩(wěn)定性。當(dāng)錯配堿基側(cè)冀或待刪除的環(huán)圈序列側(cè)翼的雙鏈區(qū)的Tm值大約為35-40℃時，引物介導(dǎo)的突變將卓有成效。為了得到正確的突變體，在突變工作完成后，要對目標DNA的全長進行序列分析，以排除引物延伸過程中在其他位點出現(xiàn)錯誤攙入，而使目的基因產(chǎn)生不必要的新突變位點。第三十四頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、編碼基因的專一性位點和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點突變第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(l)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素

③關(guān)于寡核苷酸突變引物與模板DNA的退火和引物延伸條件：(a)對于突變引物與模板DNA的比率。在標準的雙引物方法中，兩個寡核苷酸引物與模板DNA的摩爾比為10-50。引物同模板DNA之間的退火通常將二者的混合物加熱到推算的Tm值以上20℃，以使二級結(jié)構(gòu)區(qū)變性，然后慢慢冷卻到室溫，當(dāng)反應(yīng)混合物的溫度降低到相應(yīng)Tm值以下時，即可形成突變引物與DNA模板的雜交體。(b)引物延伸。退火完成后，再加入4種脫氧核苷三磷酸、三磷酸腺苷、DNA聚合酶、DNA連接酶等，在適當(dāng)?shù)臏囟认逻M行2-15h的延伸反應(yīng)。

第三十五頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、編碼基因的專一性位點和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點突變第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(l)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素

④關(guān)于DNA聚合酶的選擇：目前一般選擇T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶。Klenow酶由于其在較低溫度下(5-10℃)表現(xiàn)出較高的聚合酶活性，有利于引物和模板DNA的退火，但Klenow酶在單引物的延伸反應(yīng)中，容易引起突變引物置換，特別是當(dāng)突變引物的5端富含A/T時產(chǎn)生引物置換的可能性更大，所以在用單突變引物的延伸反應(yīng)中要用T4或T7的DNA聚合酶。

第三十六頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、編碼基因的專一性位點和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點突變第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(l)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素

⑤關(guān)于存在于dNTP(脫氧核苷三磷酸)中的dUTP(脫氧尿苷三磷酸)對離體DNA合成反應(yīng)的影響：dCTP氧化脫氨可以產(chǎn)生微量的dUTP，當(dāng)其在DNA合成時攙入進新生DNA鏈的脫氧胸苷酸的位置。在多核苷酸鏈中攙入UMP時，受體菌中的尿嘧啶-N-糖基化酶可在U的位置切斷DNA鏈，而細胞內(nèi)的DNA聚合酶可以產(chǎn)生切口平移，從而降低突變體的產(chǎn)率。利用經(jīng)HPLC純化的高質(zhì)量的dNTP，可以減輕U堿基的錯誤攙入，提高突變體產(chǎn)生的比率。

第三十七頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、編碼基因的專一性位點和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點突變第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(l)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素

⑥受體細胞對突變體產(chǎn)率的影響：異源雙鏈DNA被轉(zhuǎn)入大腸桿菌受體細胞后，幾個因素可以影響到突變體的產(chǎn)率。(a)大腸桿菌細胞內(nèi)存在著幾個錯配修復(fù)系統(tǒng)，其中之一是被GATC位點甲基化所指導(dǎo)的錯配修復(fù)系統(tǒng)。當(dāng)含有突變的異源雙鏈DNA轉(zhuǎn)染大腸桿菌后dam甲基化酶將指導(dǎo)錯配修復(fù)反應(yīng)，使產(chǎn)生的突變被去除。(b)當(dāng)用M13作為克隆載體時，由于M13DNA可能出現(xiàn)不對稱復(fù)制，如果突變鏈復(fù)制的效率較低，則最終影響突變體的產(chǎn)率。為了提高突變體的回收率，利用在點錯配修復(fù)缺失的菌株作為受體菌可使突變產(chǎn)率提高近10倍。

第三十八頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、編碼基因的專一性位點和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點突變第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

①Kunkel突變法

②基于抗生素抗性“回復(fù)”的突變方法

③基于去除特定限制酶切位點的突變

④利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點突變

第三十九頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一(a)原理當(dāng)大腸桿菌發(fā)生dUTP酶缺陷突變時(dut-)，不能把dUTP轉(zhuǎn)變?yōu)閐UMP，細胞內(nèi)的dUTP庫大為增加，其中一些dUTP可攙入DNA正常情況下由胸腺嘧啶占據(jù)的位置。在正常的情況下，大腸桿菌可以合成一種尿嘧啶-N-糖基化酶，它可以去除攙入到DNA中去的尿嘧啶殘基。然而在尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷型的菌中(ung-)，此酶失活，故尿嘧啶不能從DNA鏈中剔除，使細菌DNA中一小部分胸腺嘧啶殘基被尿嘧啶所取代。在dut-

ing-F菌株中，這一比例有所提高，以致生長于這一菌株的M13噬菌體，其DNA中將含有20-30個尿嘧啶殘基。用這些噬菌體轉(zhuǎn)染ung+菌株，尿嘧啶將被迅速除去，并產(chǎn)生一些可阻斷DNA合成且對特定核酸酶敏感的位點。病毒(+)鏈DNA的破壞，導(dǎo)致其感染力下降約5個數(shù)量級?！?2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

①Kunkel突變法

第四十頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一Kunkel定點突變法正是利用上述機制，首先在dut-ung-的大腸桿菌菌株中培養(yǎng)適當(dāng)?shù)闹亟MM13噬菌體，制備出帶U的單鏈DNA模板；然后以含U模板的DNA為模板與突變引物退火、引物延伸，然后將延伸反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)染ung+受體菌，結(jié)果模板鏈因有U位點的存在而被破壞，野生型噬菌體的產(chǎn)生受到抑制。因此，大部分(≥80%)的后代噬菌體是由所轉(zhuǎn)染的不帶U的負鏈復(fù)制而來的。由于該鏈是由突變引物延伸而來的，因此后代噬菌體多帶有突變的目標基因。這樣，用Kunkel法所產(chǎn)生的突變體不必利用標記的寡核苷酸探針來篩選陽性噬菌斑，可直接通過序列分析來確定突變體。

※(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

①Kunkel突變法

第四十一頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一(b)利用Kunkel法以M13噬菌體DNA為載體進行寡核苷酸介導(dǎo)的位點特異性突變?！?2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

①Kunkel突變法

第四十二頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一以Promega公司AlteredSifeinvitro突變體系為例，利用pALTER-1噬菌粒為突變載體，它有如下特點：(a)多克隆位點，用以對目標基因的克隆。(b)含有四環(huán)素(Tetr)和氨芐青霉素(Amps)的抗性基因，在突變反應(yīng)中，用氨芐青霉素抗性修復(fù)寡核苷酸使Amps→Ampr，用于對陽性克隆的篩選。(c)利用輔助噬菌體超感染(Helperphage)，制備含目標基因的單鏈DNA作為突變模板DNA。突變的過程如圖3-2所示。通過這樣的操作，突變引物完成了位點特異性突變，而氨芐抗性修復(fù)寡核苷酸引物使氨芐抗性得以回復(fù)?！?2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

②基于抗生素抗性“回復(fù)”的突變方法第四十三頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一利用含四環(huán)素和氨芐青霉素培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)化體進行篩選，大約85%-90%以上的菌落含有突變的目的基因，這樣可以對陽性克隆所含的噬菌粒直接測序而最后確證是否得到突變的目標基因?！?2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

②基于抗生素抗性“回復(fù)”的突變方法第四十四頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一此方法的原理是在突變載體DNA上除了有克隆外源基因的克隆位點外，還有一個獨特的限制酶切位點，這個位點也不存在于目標基因上。在進行突變反應(yīng)時用兩個引物，一是突變引物，二是使那個獨特限制酶位點去除的選擇性引物。兩個引物通過與模板DNA退火、延伸后，首先用與獨特的限制酶位點相對應(yīng)的酶對反應(yīng)混合物進行酶解，使野生型的質(zhì)粒線性化，然后轉(zhuǎn)入如E.colimutS的受體菌。從轉(zhuǎn)化菌中制備質(zhì)粒，再用相同限制酶酶解，以使殘存的野生型質(zhì)粒線性化，然后再轉(zhuǎn)化入受體菌。具體操作見圖3-3※(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

③基于去除特定限制酶切位點的突變第四十五頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一由于線性化質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率僅為環(huán)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率的1%，所以經(jīng)過兩次酶切、轉(zhuǎn)化后所得到的質(zhì)粒DNA70％-90％以上是突變質(zhì)粒。從兩次轉(zhuǎn)化菌中提取質(zhì)粒DNA，用于測序確定正確突變體。此方法的優(yōu)點是不需制備單鏈DNA；不需輔助噬菌體超感染；不需進行亞克隆。※(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

③基于去除特定限制酶切位點的突變第四十六頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一PCR為基因序列的突變和重組提供了一個非常有用的方法，其優(yōu)點是快捷、不受限制性內(nèi)切酶識別位點的限制。(a)利用PCR方法在基因的5末端區(qū)或3末端區(qū)產(chǎn)生突變。此方法是利用在PCR反應(yīng)中，寡核苷酸引物序列被攙入到所產(chǎn)生的DNA分子的末端，這些引物的5端可以含有任何所想要的核苷酸序列，只要引物的3端核苷酸序列能足夠好地與模板序列相匹配去引發(fā)PCR反應(yīng)即可。所以可以通過改變引物5端的核苷酸(或堿基)組成，就可使基因的5末端區(qū)或3末端區(qū)通過PCR產(chǎn)生所要的突變?！?2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

④利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點突變

第四十七頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一然而對于基因的中心區(qū)段，不能用簡單地改變PCR引物有關(guān)序列的方法直接產(chǎn)生各種突變，因為如果這樣，需要用非常長的引物才能達到基因中心區(qū)。重疊延伸(overlapextension)的方法為在目標基因的中心區(qū)段產(chǎn)生突變提供了有力的手段。(b)重疊延伸和基因突變。重疊延伸的概念使得人們可以利用PCR技術(shù)在目標基因的中心區(qū)段引入位點特異性突變和產(chǎn)生重組DNA分子。當(dāng)將重疊延伸方法用于將不同的基因進行剪接和組合在一起時，人們就將這一過程稱為“geneSOEing”，即通過重疊延伸進行剪接(splicingbyoverlapextension)※(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

④利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點突變

第四十八頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一重疊延伸過程的依據(jù)是：加到PCR引物5端的核苷酸序列攙入到PCR產(chǎn)物的末端。通過加上適當(dāng)?shù)男蛄?，一個PCR的擴增片段可與另一個PCR擴增片段上的序列相重疊。這樣，在其后的反應(yīng)中，這段重疊序列可以作為引物被DNA聚合酶所延伸，由此而產(chǎn)生一個新的重組分子，其過程如圖3-4所示。

※(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

④利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點突變

第四十九頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一利用上述原理，可以通過重疊延伸PCR技術(shù)對基因的中心區(qū)段進行取代、插入、缺失的突變。※(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

④利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點突變

取代突變。如圖3-5所示，為在基因中部區(qū)段產(chǎn)生取代突變，可利用所謂雙側(cè)重疊延伸法，需要a,b,c,d四個引物，其中b,c引物序列相重疊并含有突變堿基。首先分別用a,b和c,d為一對引物進行PCR反應(yīng)，產(chǎn)生AB和CD擴增片段。然后，將制備出的AB、CD片段混合、變性、退火、通過二者之間的同源序列相重疊產(chǎn)生重疊延伸結(jié)構(gòu)E，再經(jīng)PCR進行擴增產(chǎn)生突變基因。

第五十頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一插入突變。如圖3-6所示，引物b和c的5端含有要插入的序列和重疊序列(插入序列可以等于重疊序列或大于重疊序列)?！?2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

④利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點突變

分別用a,b和c,d為一對引物進行PCR反應(yīng)，產(chǎn)生了包括插入的核苷酸序列在內(nèi)的兩組DNA片段AB和CD，最后通過AB和CD片段之間的重疊序列進行PCR延伸、擴增，得到具有插入序列的產(chǎn)物AD。

第五十一頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一缺失突變。利用雙側(cè)重疊延伸PCR同樣可以進行缺失突變。圖3-7給出了產(chǎn)生缺失突變的過程。對用于重疊延伸進行基因剪接的寡核苷酸片段，其不同部位在反應(yīng)中執(zhí)行不同的功能。

※(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

④利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點突變

寡核苷酸的3端必須含有使它在其模板上作為引物的序列，這通常被稱為引導(dǎo)區(qū)(primingregion)；在寡核昔酸的5端應(yīng)含有將兩個基因片段結(jié)合到一起的重疊序列，稱為重疊區(qū)(overlapregion)(如圖3-7所示)。在重疊區(qū)和引導(dǎo)區(qū)之間，可包括用作插入突變的插入?yún)^(qū)

第五十二頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、編碼基因的專一性位點和區(qū)域性定向突變★2.區(qū)域性定向突變

基因工程技術(shù)不但可使基因產(chǎn)生特異性位點突變，也可以產(chǎn)生區(qū)域性的突變。常用的方法如盒式突變法(cassettemutagenesis)，又稱片段取代法(DNAfragmentreplacement)。這一方法的要點是利用目標基因中所具有的適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點，用具有任何長度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段來置換或取代目標基因上的一段DNA序列。這樣，人們不僅可以通過改變幾個氨基酸序列來研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能之間的關(guān)系，也可以通過盒式突變法產(chǎn)生嵌合蛋白質(zhì)。在這個嵌合蛋白質(zhì)中，蛋白質(zhì)分子中的整個結(jié)構(gòu)域都可以用完全不同的氨基酸序列來置換。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第五十三頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、編碼基因的專一性位點和區(qū)域性定向突變★2.區(qū)域性定向突變

盒式突變最有用武之地是產(chǎn)生各種特異性的突變或突變家族，在這些突變體中各種不同的序列被集中在目標基因的一個特定區(qū)域，從而為研究蛋白質(zhì)特定結(jié)構(gòu)區(qū)段或特定結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能提供了一個切實可行的方法。

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑要進行盒式突變，需要解決兩個關(guān)鍵問題。一個是在目標基因序列中，要有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶識別位點，使得用以取代天然DNA序列的盒式突變序列可以有效地插入到目標基因中?？梢岳眠z傳密碼的簡并性，在不改變氨基酸序列的前提下，通過改變某些核苷酸的序列，產(chǎn)生合適的限制性內(nèi)切酶位點。PCR方法以及寡核苷酸的化學(xué)合成方法都可以有效地解決這一問題。第五十四頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、編碼基因的專一性位點和區(qū)域性定向突變★2.區(qū)域性定向突變

另一個是，如何得到各種合適的、用以取代目標基因中特定DNA片段的突變DNA片段。利用PCR技術(shù)產(chǎn)生具有特定限制性內(nèi)切酶位點的、具有各種突變位點的盒式突變DNA片段的技術(shù)已經(jīng)成熟。此外，利用DNA的化學(xué)合成、引物介導(dǎo)的DNA合成技術(shù)等都可以得到用于盒式突變的DNA片段。值得指出的是，為確保盒式突變序列能按正確的方向插入，突變序列的兩端必須分別具有與目標基因上相匹配的、但彼此之間不相容的限制性內(nèi)切酶識別位點。實際上對于目標基因進行區(qū)域性的定向突變，除了上述的盒式突變技術(shù)外，也完全可以通過PCR方法對給定基因序列進行融合和剪接，這樣基因內(nèi)、基因間或人工修飾基因片段之間的重組、改造就不受特定限制性內(nèi)切酶識別位點的存在與否的限制。

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第五十五頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■二、基因融合和基因剪接

★1.利用基因融合技術(shù)表達外源基因的緣由

重組DNA技術(shù)允許在體外產(chǎn)生不同基因或基因片段之間的融合，并通過融合基因產(chǎn)生融合蛋白。用基因融合表達外源蛋白有以下緣由——①外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解，有時可以通過產(chǎn)生融合蛋白避免目標基因產(chǎn)物被快速降解，從而穩(wěn)定表達產(chǎn)物的產(chǎn)率。特別是表達一些小肽基因時，這是一個好的策略。

②通過與一特異性蛋白質(zhì)或其特異的結(jié)構(gòu)域形成融合蛋白，可使表達產(chǎn)物得到快速、有效的回收、純化。如將外源蛋白基因同金葡蛋白A的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域形成融合蛋白，可利用免疫親和層析的方法，對融合蛋白進行純化。

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第五十六頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■二、基因融合和基因剪接

★1.利用基因融合技術(shù)表達外源基因的緣由

③通過與特定的肽段進行融合表達，可以將表達的外源蛋白質(zhì)定向地定位在宿主細胞的不同區(qū)位。如通過與分泌信號肽的融合，使外源蛋白分泌到細胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中。④通過同特定蛋白先形成融合蛋白，然后再通過體外切割去除融合部分，是獲得天然蛋白的可靠和可重復(fù)性的方法。如在大腸桿菌中表達的真核蛋白，其N末端往往帶有甲硫氨酸殘基，如果與特定蛋白序列通過某種特定的連接形成融合蛋白，表達后通過特異性切割，可以獲得具有完全天然序列的外源蛋白質(zhì)分子。

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第五十七頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■二、基因融合和基因剪接

★1.利用基因融合技術(shù)表達外源基因的緣由

⑤通過與特定的蛋白質(zhì)形成融合蛋白，如與硫氧化還原蛋白形成融合蛋白，可使外源蛋白改變在細胞內(nèi)的溶解性，防止包涵體的產(chǎn)生。⑥基因融合也是對基因進行改造的手段，廣泛用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的研究。

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第五十八頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■二、基因融合和基因剪接

★2.基因融合的策略

基因融合可以采取以下幾種方式：①最簡單的融合方式是將重組基因直接剪接于適當(dāng)?shù)男盘栯闹?。這種設(shè)計的優(yōu)點在于，如果在轉(zhuǎn)運過程中信號肽被正確地加工，那么產(chǎn)生的重組蛋白就可具有天然的N末端。如用大腸桿菌生產(chǎn)人生長激素和人表皮生長因子時，就是將外源基因接到phoA信號肽的后面進行分泌表達的。應(yīng)該指出，并非任何外源基因加上信號肽都可以分泌表達。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第五十九頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■二、基因融合和基因剪接

★2.基因融合的策略

②將外源基因本身按閱讀框架自我融合。這種方式對一些小肽的穩(wěn)定表達尤其重要。如將由DSDGK五肽組成的抗IgE形成的活性肽基因，首尾相連成28聚體，再同二氫葉酸還原酶基因融合，可以得到高效表達的五肽產(chǎn)物。③目標蛋白在與其融合的蛋白伙伴序列的C端或N端融合。C端融合的優(yōu)點是，啟動子和翻譯起始信號都處于基因的5端，因此在3端所進行的不同基因片段的融合并不改變原來啟動子和翻譯起始信號的原設(shè)計，因而目標基因的表達水平相對來說可預(yù)測。N端融合的缺點是，目標基因產(chǎn)物特異性的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始元件必須在目標基因的5端設(shè)計好。

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第六十頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■二、基因融合和基因剪接

★2.基因融合的策略

④分泌親和融合。此種設(shè)計是將分泌和親和純化的優(yōu)點結(jié)合起來，即N端為信號肽，然后是融合蛋白伙伴(用于親和分離)，再接目標基因。

⑤雙親和融合法。即將目標基因X，同兩個分別對兩個不同配基有特異性親和的異源結(jié)構(gòu)域A、B，以A-X-B的形式進行融合。顯而易見，這種設(shè)計為以后的親和純化提供方便。

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第六十一頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■二、基因融合和基因剪接

★2.基因融合的策略

⑥分泌-插入融合法。此方法是將目標基因插入到信號肽序列和一插入序列之間，此插入序列是一種可插入到細胞膜或細胞壁的蛋白編碼。這種設(shè)計的目的是用以將受體或抗原定位于細胞的外表面或裝配成融合蛋白進入類病毒顆粒。這樣的系統(tǒng)對于開發(fā)疫苗，或產(chǎn)生具免疫原的復(fù)合物是有意義的。

上述這些基因融合策略，主要是有利于外源基因的表達、表達產(chǎn)物的分離、純化以及細胞定位。作為蛋白質(zhì)分子改造可以借用這些策略對蛋白質(zhì)分子中的特定序列、結(jié)構(gòu)元件乃至結(jié)構(gòu)域通過基因剪接來進行操作。

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第六十二頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■二、基因融合和基因剪接

★3.產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子嵌合體的方法

將不同來源的蛋白質(zhì)分子、蛋白質(zhì)分子中的不同結(jié)構(gòu)域進行剪接，是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的一種方法?；蛉诤虾图艚拥募夹g(shù)為實現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的融合和剪接提供了有效的手段。

①如果兩個蛋白質(zhì)基因序列間有合適的、相容的限制性內(nèi)切酶位點，那就通過將不同的編碼序列經(jīng)酶切后再用連接酶相連，形成一個首尾閱讀框正確的重組蛋白質(zhì)基因，然后通過基因工程手段進行表達。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第六十三頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■二、基因融合和基因剪接

★3.產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子嵌合體的方法

②如果相連的蛋白質(zhì)分子編碼序列間存在額外的堿基序列，可以通過產(chǎn)生缺失突變的方法去除。

③利用前面所述的PCR雙側(cè)重疊延伸法，可以在不需要分子間具有相容的限制性內(nèi)切酶位點的情況下，將兩個編碼不同蛋白的DNA分子重組到一起，形成DNA分子嵌合體。其原理如圖3-8所示。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第六十四頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■二、基因融合和基因剪接

★3.產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子嵌合體的方法

根據(jù)相同的原理，可以利用單側(cè)重疊延伸法，將兩個DNA分子拼接到一起：首先按圖3-8中的PCR反應(yīng)I以第一個基因為模板產(chǎn)生AB產(chǎn)物，這產(chǎn)物中其中一條鏈的5端含有第一個基因的序列，而其3端含有與第二基因匹配的序列。這樣，此序列就形成了一個所謂的巨大引物。然后以此為引物，以第二個基因為模板進行延伸反應(yīng)，形成含有這兩個基因的一條鏈；最后，以一對分別與第一基因和第二基因特定序列匹配的一對旁側(cè)引物進行PCR擴增，即得到一個包含有兩個基因特定序列的嵌合分子。利用單側(cè)重疊法，可以節(jié)約一個引物。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第六十五頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■二、基因融合和基因剪接

★3.產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子嵌合體的方法

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第六十六頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■二、基因融合和基因剪接

★3.產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子嵌合體的方法

需要指出的是，在利用重疊延伸方法產(chǎn)生突變體或重組分子時，PCRI和PCRII的產(chǎn)物要分別用瓊脂糖凝膠電泳分離后，經(jīng)電泳洗脫或凍壓法進行制備，然后將兩種產(chǎn)物混合、變性、退火，利用PCR進行延伸、擴增，這樣，可以提高特異性DNA片段的產(chǎn)率，減少非特異性DNA片段的生成。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第六十七頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■二、基因融合和基因剪接

★4.蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子間的連接

蛋白質(zhì)的剪接(proteinsplicing)現(xiàn)象自1990年發(fā)現(xiàn)以來，以蛋白內(nèi)含子(intein)為基礎(chǔ)組建的基因工程表達載體在目標蛋白質(zhì)的表達純化、特定結(jié)構(gòu)域的同位素選擇性標記、蛋白質(zhì)或多肽的環(huán)化等方面發(fā)揮著越來越大的作用。蛋白內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子間的連接已發(fā)展成為蛋白質(zhì)工程研究中的一個通用方法，利用這一方法可以將兩個目標肽段在生理條件下相連接，形成功能蛋白分子。這個方法的原理如圖3-10所示。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第六十八頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一第六十九頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■二、基因融合和基因剪接

★4.蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子間的連接

目標蛋白質(zhì)或蛋白片段用pCYB(BioLabs)作為表達載體進行表達，結(jié)果產(chǎn)生目標蛋白―蛋白內(nèi)含子-甲殼素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。此融合蛋白經(jīng)與甲殼素親和層析純化，然后，將結(jié)合在親和介質(zhì)上的融合蛋白與苯硫酚及合成的肽一起保溫。由于琉基化合物的存在，使目標蛋白從蛋白內(nèi)含子上切割下來，并在其C端形成具有高度反應(yīng)性的巰酯基團，這個基團與合成肽的N端半胱氨酸殘基相作用，在兩個多肽分子之間形成天然肽鍵。由此可見利用上述原理可以在蛋白質(zhì)水平上對蛋白質(zhì)分子進行剪接。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第七十頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■三、tRNA介導(dǎo)定點攙入非天然氨基酸

通過引入非天然氨基酸到蛋白質(zhì)分子中，不但使我們對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能有更深的了解，也為生物醫(yī)學(xué)的研究提供新的手段。圖3-11給出將非天然氨基酸引入蛋白質(zhì)分子的特定位點的基本過程：①首先將目標蛋白質(zhì)的基因重組入可用于體外轉(zhuǎn)錄的載體中；②利用寡核苷酸介導(dǎo)的位點特異性突變，將為特定氨基酸編碼的密碼子(如圖中的AGC)突變成無義密碼(TAG)；③利用runoff轉(zhuǎn)錄或化學(xué)/酶法反密碼子環(huán)取代法合成相應(yīng)的校正tRNA,并用T4RNA連接酶通過PdCpA-非天然氨基酸，將非天然氨基酸連到校正tRNA上；④通過體外轉(zhuǎn)錄體系，產(chǎn)生在特定位點突變成UAG的mRNA；⑤通過體外翻譯體系，借助攜帶有非天然氨基酸的校正tRNA上的反密碼子，通讀mRNA上的UAG無義密碼子，將非天然氨基酸攙入到蛋白質(zhì)分子中的特定位點。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第七十一頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■三、tRNA介導(dǎo)定點攙入非天然氨基酸

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第七十二頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達一、目標蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達表達載體的一般特點與外源基因有效表達的相關(guān)因素改善表達水平及溶解性的方法二、目標蛋白質(zhì)在酵母細胞中的表達有關(guān)酵母表達載體的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄元件外源mRNA在酵母細胞中的翻譯外源蛋白質(zhì)在酵母中的分泌表達翻譯后修飾第九講蛋白質(zhì)的修飾和表達三、重組蛋白質(zhì)在哺乳動物細胞中的表達選擇哺乳動物細胞表達體系的優(yōu)點兩個主要的哺乳動物細胞表達系統(tǒng)四、噬菌體顯示關(guān)于表達載體噬菌體顯示技術(shù)的操作噬菌體顯示技術(shù)的應(yīng)用第七十三頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、目標蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達大腸桿菌(E.coli)表達體系是目前應(yīng)用最廣的一個外源基因表達體系。應(yīng)該說這是外源基因表達的首選體系，只有在大腸桿菌中的表達產(chǎn)物由于不能正確折疊或缺少轉(zhuǎn)譯后修飾而沒有生物活性，或當(dāng)天然蛋白質(zhì)的回收率太低時，才考慮選擇其他表達體系。利用大腸桿菌作為表達體系的優(yōu)點：①遺傳學(xué)和生理學(xué)背景清楚；②容易培養(yǎng)，特別是高密度發(fā)酵；③外源基因經(jīng)?？梢赃_到高效表達。第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達第七十四頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、目標蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達大腸桿菌系統(tǒng)的不足之處：①不能進行典型真核細胞所具有的復(fù)雜的翻譯后修飾，如糖基化、烷基化、磷酸化、特異性的蛋白水解加工等；而廣泛二硫鍵的形成以及外源蛋白質(zhì)組裝成多亞基復(fù)合體的能力也受到限制。②外源基因產(chǎn)物在大腸桿菌細胞內(nèi)易形成不溶性的包涵體；而當(dāng)真核基因在大腸桿菌中表達時，作為起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白質(zhì)的N末端。③由于真核mRNA的結(jié)構(gòu)特性以及密碼子使用頻率與大腸桿菌本身的差異，當(dāng)用真核mRNA的序列直接在大腸桿菌細胞中表達時，有時不能得到足夠的產(chǎn)物。然而，當(dāng)外源蛋白質(zhì)分子量較小，不存在半胱氨酸或分子內(nèi)的二硫鍵少于3-4個，以及不需要翻譯后修飾而能保持其生物活性的蛋白質(zhì)，大多可以利用大腸桿菌系統(tǒng)得到滿意的結(jié)果。第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達第七十五頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、目標蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達用于大腸桿菌細胞的表達載體有很多種，為了使外源基因能高效表達，一個典型的表達載體至少應(yīng)該包括如下的成分：第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達★1.表達載體的一般特點※(l)復(fù)制起始點絕大多數(shù)載體利用pBR322或pUC質(zhì)粒來源的復(fù)制起始點。復(fù)制起始點決定了細胞內(nèi)質(zhì)粒的拷貝數(shù)，也就決定了每個細胞內(nèi)目標基因的數(shù)目。對于pBR322和pUC來源的復(fù)制起始點，可分別保持每個細胞中20-50個拷貝和150-200個拷貝。二者復(fù)制起始點都來源于ColE1(即大腸桿菌素E1)質(zhì)粒。pUC具有較高拷貝數(shù)的原因是由于rop基因的失活所致。rop基因編碼一小分子量蛋白，而這一蛋白又是作為ColE1來源的DNA復(fù)制的負調(diào)控因子，因此rop基因的失活可導(dǎo)致質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加。適度的質(zhì)?？截悢?shù)可使外源基因得到高表達，但太高的拷貝數(shù)可造成質(zhì)粒在受體細胞中的不穩(wěn)定性，對于外源基因的表達并無特別好處，目前已很少用。值得指出的是利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能穩(wěn)定共存于一個受體細胞中，這種現(xiàn)象稱之為質(zhì)粒不相容性。

第七十六頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、目標蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達★1.表達載體的一般特點※(2)選擇性基因載體上要含有至少一個選擇性基因。選擇性基因的作用一方面用于對轉(zhuǎn)化體的確定，而另一方面在培養(yǎng)過程中使受體細胞保持質(zhì)粒不丟失。多拷貝的質(zhì)粒表現(xiàn)出分離性不穩(wěn)定，即在細胞分裂的過程中，有一定數(shù)量的細胞不能從親代細胞遺傳下任何質(zhì)?？截?。高水平地表達質(zhì)粒編碼的基因，特別是蛋白產(chǎn)物對細胞有毒性的基因更加重了這種不穩(wěn)定性。pUC來源的表達載體比pBR322來源的表達載體不穩(wěn)定，其最可能的原因是由于其更高的拷貝數(shù)引起較高的表達水平所致。為了解決質(zhì)粒分離性不穩(wěn)定間題，人們采取利用選擇性基因，在抗生素選擇壓力下，使宿主細胞保持足夠數(shù)目的質(zhì)粒還可以通過克隆穩(wěn)定分離基因，保持質(zhì)粒在宿主細胞中的穩(wěn)定性。選擇性基因往往是抗生素抗性基因，如氨芐青霉素以及四環(huán)素、卡那霉素抗性基因。值得指出的是，氨芐抗性基因在防止質(zhì)粒丟失方面并不特別有效，因為這個基因編碼的-內(nèi)酰胺酶可很快使抗生素降解，使氨芐青霉素的選擇壓力在細菌生長數(shù)代后喪失。而四環(huán)素抗性基因則能更有效地防止質(zhì)粒的不穩(wěn)定性。

第七十七頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、目標蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達★1.表達載體的一般特點※(3)強的、可誘導(dǎo)的啟動子原核細胞的啟動子作為RNA聚合酶的識別和結(jié)合位點，使得RNA的轉(zhuǎn)錄有效的起始。啟動子序列由-10區(qū)(TATAAT)和-35區(qū)(TTGACA)兩部分組成。-10區(qū)是RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點，-35區(qū)是RNA聚合酶的識別位點，這兩個序列是決定啟動子強度的重要因素。-10區(qū)和-35區(qū)之間的堿基組成并不重要，然而這兩個序列間的距離卻十分重要。實驗表明，兩個序列之間為17堿基對時轉(zhuǎn)錄效率最高。作為外源基因的表達載體之所以選擇可誘導(dǎo)的啟動子，是因為可誘導(dǎo)啟動子是一類嚴格調(diào)控的啟動子，能防止在培養(yǎng)過程中由于組成性高水平表達所造成的對細胞的毒性。當(dāng)然，足夠強的啟動子可使表達產(chǎn)物積累達到總細胞蛋白的一半；在選擇啟動子時除了考慮到其強度外，關(guān)鍵的是要考慮蛋白質(zhì)的合成是如何被誘導(dǎo)的，以及在沒有誘導(dǎo)物存在的條件下，蛋白質(zhì)的合成將被完全地關(guān)閉。再者選擇的啟動子應(yīng)該是在各種生理條件及宿主細胞遺傳背景下都很容易實施誘導(dǎo)的。第七十八頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、目標蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達★1.表達載體的一般特點常用的啟動子有LacUV5、trp、tac、trc、噬菌體PL和PR以及T7啟動子等，這些啟動子都可以全部或最大限度地符合上述有關(guān)啟動子的標準。LacUV5、tac、trc啟動子可被乳糖阻遏蛋白阻遏。由這些啟動子構(gòu)建的載體通常需要在載體上或宿主細胞中存在LacI或LacIq基因的高表達。對于這類啟動子的化學(xué)誘導(dǎo)劑是異丙基--D-硫代半乳糖苷(IPTG)，但由于IPTG價格昂貴且影響細胞的生理狀態(tài)，不適于工業(yè)生產(chǎn)；乳糖可代替IPTG，且便宜，不足之處是乳糖是一種較弱的誘導(dǎo)物。

第七十九頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、目標蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達★1.表達載體的一般特點※(4)強的轉(zhuǎn)錄終止序列為使目標基因被有效地轉(zhuǎn)錄，需要轉(zhuǎn)錄終止序列或抗-終止序列?？?終止調(diào)控序列保證目標基因完全被轉(zhuǎn)錄；而轉(zhuǎn)錄終止序列是減少不必需的轉(zhuǎn)錄通過復(fù)制起始點，其作用可能是幫助穩(wěn)定mRNA，從而增加mRNA的半壽期。轉(zhuǎn)錄終止序列元件的存在可提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

第八十頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、目標蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達★1.表達載體的一般特點※(5)核糖體結(jié)合位點在啟動子下游區(qū)和翻譯起始密碼ATG上游區(qū)要有核糖體結(jié)合位點(SD序列),SD序列的存在對原核細胞mRNA翻譯起始至關(guān)重要。近來確證了一個可有效促進大腸桿菌翻譯起始復(fù)合體形成的序列元件，它處于起始密碼子的下游，稱為“下游盒”(DB,downstreambox）。

※(6)合適的多克隆位點用于將目標基因插入到表達載體；也可以為載體的改造提供可選擇的限制性內(nèi)切酶切點，當(dāng)然，用于此種目的的限制性內(nèi)切酶切點可存在于多克隆位點之外。第八十一頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、目標蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達★2.與外源基因有效表達的相關(guān)因素※(l)有效的轉(zhuǎn)錄起始與基因的高效表達有效的轉(zhuǎn)錄起始是外源基因能否在宿主細胞中高效表達的關(guān)鍵步驟之一，也可以說，轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達的主要的限速步驟。因此，選擇強的可誘導(dǎo)的啟動子及相關(guān)的調(diào)控序列，是構(gòu)建一個高效表達載體首先要考慮的問題?！?2)有效的翻譯與基因的高效表達蛋白質(zhì)的有效合成依賴于mRNA的穩(wěn)定性、翻譯起始的頻率、肽鏈延伸和終止的速率以及翻譯的忠實性等。第八十二頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、目標蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達★2.與外源基因有效表達的相關(guān)因素①mRNA的穩(wěn)定性：細胞內(nèi)mRNA的濃度是由mRNA轉(zhuǎn)錄的速率和mRNA降解之差來決定的。在細茵中mRNA的壽命很短，其半壽期在1~3min。通常用非常強的啟動子可以彌補非常不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄物，使得蛋白質(zhì)合成達到一個可接受的水平?！?2)有效的翻譯與基因的高效表達

第八十三頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、目標蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達★2.與外源基因有效表達的相關(guān)因素①mRNA的穩(wěn)定性：保證有足夠的mRNA作為蛋白質(zhì)合成模板的另一種辦法是增加mRNA的半壽期，從而改善特定基因的表達。例如克隆具有高度傾向形成穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的序列，能防止轉(zhuǎn)錄物從3端到5端的降解，從而增加了mRNA的半壽期，提高了蛋白質(zhì)的有效合成。細胞的生長速率、肽鏈起始速率和延伸速率以及所用宿主菌的品系也影響mRNA的穩(wěn)定性。然而，提高mRNA的穩(wěn)定性并不必然提高蛋白質(zhì)的合成。※(2)有效的翻譯與基因的高效表達

第八十四頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、目標蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達★2.與外源基因有效表達的相關(guān)因素②翻譯的起始：無效的翻譯起始多半是蛋白質(zhì)低表達的最常見的原因。翻譯的起始與下列因素有關(guān)：核糖體結(jié)合位點(SD序列)、SD序列與起始密碼之間的距離、緊靠近起始密碼上游區(qū)的堿基序列以及圍繞著SD序列和可翻譯序列5端形成二級結(jié)構(gòu)的潛在能力?！?2)有效的翻譯與基因的高效表達

第八十五頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、目標蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達★2.與外源基因有效表達的相關(guān)因素②翻譯的起始：研究表明，如果符合下列條件可以得到最適的翻譯起始：(a)核糖體結(jié)合位點的序列為UAAGGAGG;(b)在SD序列和起始密碼之間的堿基數(shù)是6~11個堿基，且堿基組成富含A-U；(c)AUG作為起始密碼子。上述這些條件并不完全刻板，有些mRNA盡管SD序列與上述典型序列差得很遠，或含有局部的二級結(jié)構(gòu)，仍可進行有效的翻譯。

※(2)有效的翻譯與基因的高效表達

第八十六頁，共一百三十六頁，編輯于2023年，星期一■一、目標蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達★2.與外源基因有效表達的相關(guān)因素③翻譯的延伸(遺傳密碼的使用)：一個氨基酸可有多于一個密碼子為其編碼。61個密碼子使用的頻率因基因不同而有差別，有機體之間也有差別。在細胞中識別使用頻率高的密碼的tRNA含量要高。這樣，正在翻譯的核糖體遇到一串罕用密碼時，它可能停下來等待能識別此罕用密碼的氨酰tRNA出現(xiàn)。核糖體的暫停能引起翻譯提前成熟終止和目標蛋白的低產(chǎn)率。最適密碼子在決定外源基因表達水平上的重要程度仍是一個在爭論的問題，因為用優(yōu)先使用的密碼子取代罕用密碼不僅影響膚鏈延伸的速率，而且也影響mRNA的穩(wěn)定性和起始頻率，而這兩者對蛋白質(zhì)的產(chǎn)率都有很大的影響。也有的研究指出，罕用密碼的使用可使翻譯的效率減低約85％。然而也有實驗指出完全用優(yōu)先使用的密碼合成的基因，其蛋白的表達也沒有明顯的增加。即使蛋白表達增加，其原因更像是由于mRNA的穩(wěn)定性提高和有效的翻譯起始造成的。然而，確實有報道指出，在基因編碼序列的5端使用優(yōu)先使用的密碼可以提高蛋白質(zhì)的表達效率，因此，