血紅蛋白的提取和分離

血紅蛋白的提取和分離第一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二

21世紀(jì)初，工程浩大的國際人類基因組計劃正式完成，但僅僅測繪出基因組序列還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，必須對基因組的編碼產(chǎn)物——蛋白質(zhì)組進行深入的研究才能真正實現(xiàn)基因診斷和基因治療，近年來，我國科學(xué)家在蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域取得了令人矚目的成績，首次由我國科學(xué)家領(lǐng)導(dǎo)的國際重大科研合作項目人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃已經(jīng)取得階段性進展。我國蛋白質(zhì)組研究取得突破性進展/kid/wzxqt/2012-8-2/134388789376.shtml第二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二人類基因組：指DNA分子所攜帶的全部遺傳信息。蛋白質(zhì)組：生物個體表達的蛋白質(zhì)分子的總和。主要是對蛋白質(zhì)功能的研究第三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二思考

蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì)。第四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二（一）蛋白質(zhì)提取和分離的原理一

基礎(chǔ)知識根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異：P64分子的形狀大??；電荷性質(zhì)和多少；溶解度；吸附性質(zhì)；對其他分子親和力

（二）蛋白質(zhì)提取和分離的方法1.凝膠色譜法（分配色譜法）；2.電泳法色譜法：也叫層析法，是指利用混合物中各組分理化性質(zhì)的不同，使各組分以不同程度分布進而實現(xiàn)分離的技術(shù)。如：綠葉中色素的提取和分離第五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二閱讀并回答（P64）

1、凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的依據(jù)；

2、凝膠的實質(zhì)；

3、凝膠色譜法的原理。基礎(chǔ)知識（三）凝膠色譜法第六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二（三）凝膠色譜法P641.分離依據(jù)：不同蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量不同

2.凝膠的結(jié)構(gòu)：微小的多孔球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道；具多孔的凝膠就叫“分子篩”3.凝膠的化學(xué)組成：多糖類化合物，如葡聚糖或瓊脂糖第七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物通過裝填了凝膠的色譜柱時相對分子質(zhì)量較小相對分子質(zhì)量較大凝膠內(nèi)部的通道容易進入無法進入凝膠內(nèi)部的通道只能在凝膠外部移動路程較長移動速度較慢路程較短移動速度較快相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先從色譜柱中洗脫出來,相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)后洗脫出來4.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理—分子篩效應(yīng)第八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二第九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理第十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的進行過程可表示為圖中哪一個B第十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二1、我們在什么地方遇到過緩沖物質(zhì)的？2、緩沖物質(zhì)有哪些？3、緩沖溶液的作用是什么？4、怎樣配制緩沖溶液？基礎(chǔ)知識（四）緩沖溶液第十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等（四）緩沖溶液——洗脫劑P65

1.概念一定范圍內(nèi)，能夠抵制外加少量強酸或強堿的影響，使原來溶液pH值基本保持不變的混合溶液。2.配制通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。思考：你還記得人體血液中的緩沖物質(zhì)嗎？第十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二2.你認(rèn)為在血紅蛋白整個實驗中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究(活性)。生物體內(nèi)進行的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定的pH下進行的，為了能夠在實驗室條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的過程，就必須保持體外的pH與體內(nèi)的基本一致。因此，緩沖溶液的正確配制和pH的準(zhǔn)確測定，在生物化學(xué)的研究工作中有著極其重要的意義。思考：

1.在生物化學(xué)的研究工作，為什么要正確配制緩沖溶液和準(zhǔn)確測定緩沖溶液的pH？第十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二基礎(chǔ)知識（五）電泳第十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二閱讀第65-66頁的相關(guān)內(nèi)容，回答以下問題：

1、電泳的概念；

2、電泳的原理；

3、電泳的種類；

4、SDS的作用?；A(chǔ)知識（五）電泳第十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二1.概念：帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。2.原理：3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。（五）電泳P65--66待分離樣品帶電性質(zhì)的差異大小、形狀的不同各種帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度而分離①多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團會帶上正電或負(fù)電。②在電場作用下，帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。第十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二4實例：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(1)用途:

測定蛋白質(zhì)分子量（鑒定蛋白質(zhì)純度）(2)聚丙烯酰胺凝膠：單體丙烯酰胺+N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(交聯(lián)劑)

→聚合交聯(lián)→具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠注意:

SDS能使蛋白質(zhì)完全變性，使蛋白質(zhì)復(fù)合體解聚成單條肽鏈，故測得的蛋白質(zhì)分子量實質(zhì)上是單條肽鏈的分子量。SDS：十二烷基硫酸鈉第十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二(3)原理:P66②SDS與蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過蛋白質(zhì)分子原有電荷量，使蛋白質(zhì)在SDS—聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移速率完全取決于蛋白質(zhì)分子的大小。①

蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。正極，因為凝膠中的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷思考：若將蛋白質(zhì)樣品加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，在電場作用下，蛋白質(zhì)會往哪個電極遷移？第十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異第二十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二討論：如何測定蛋白質(zhì)的分子量？使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量時，可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時進行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售第二十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二不同。①凝膠色譜法是根據(jù)相對分子質(zhì)量大小分離蛋白質(zhì);②電泳法是根據(jù)各種分子性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)在電場中將各種分子分離。思考：凝膠色譜法和電泳法分離蛋白質(zhì)的原理相同嗎？第二十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二二

實驗操作血液組成(1)洗滌紅細(xì)胞(2)釋放血紅蛋白(3)分離血紅蛋白溶液樣品處理粗分離純化純度鑒定透析：除去分子較小的雜質(zhì)凝膠色譜法：除去雜蛋白質(zhì)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：鑒定血紅蛋白純度、測定分子量第二十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二思考人們用哺乳動物的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？哺乳動物的紅細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。二

實驗操作

本課題可選用豬、牛、羊或其他哺乳動物的血液來分離血紅蛋白。選材第二十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二第二十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二紅細(xì)胞的主要組成水血紅蛋白兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵血紅素基團血紅蛋白特點：每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，此基團可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。第二十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二蛋白質(zhì)占細(xì)胞干重的50％以上，細(xì)胞中含量最多的有機物2、組成元素C、H、O、N復(fù)習(xí)1、含量3、相對分子質(zhì)量高分子化合物4、基本組成單位氨基酸5、氨基酸通式RHCCOOHNH2第二十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二6、氨基酸的結(jié)合方式CHCOOHR1CHNH2COOHR2NH2COHNHOH第二十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二氨基酸的結(jié)合方式CHR1NH2OHCOH2OCHCOOHR2HNH第二十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二氨基酸的結(jié)合方式:CHR1NH2COCHCOOHR2HNH2O二肽肽鍵脫水縮合第三十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二氨基酸的結(jié)合方式:脫水縮合肽鍵CHCOOHR3HNOHHCCHR1NH2COCHR2HNO二肽H2OH2O第三十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二氨基酸的結(jié)合方式:脫水縮合CCHR1NH2COCHR2HNO肽鍵二肽CHCOOHR3HNH2O肽鍵三肽以此類推，由多個氨基酸分子縮合而成的含有多個肽鍵的化合物，叫多肽（鏈狀）。肽鏈盤曲，折疊，形成有一定空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子。H2O第三十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二8、分子結(jié)構(gòu)7、肽鍵CONH氨基酸肽鏈蛋白質(zhì)脫水縮合盤曲折疊（一條或者多條）第三十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二10、生理功能細(xì)胞和生物體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，是人體發(fā)育和組織更新的主要原料，具有運輸、調(diào)節(jié)、免疫、催化等作用，是一切生命活動的主要承擔(dān)者氨基酸的種類不同；數(shù)目成百上千；排列順序變化多端；多肽鏈的空間結(jié)構(gòu)千差萬別9、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性第三十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二①氨基酸間脫水縮合時，原來的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一個氨基，另一端只有一個羧基（不計R基上的氨基和羧基）。所以對于一條多肽鏈說，至少應(yīng)有的氨基和羧基都是一個②若有n個氨基酸分子縮合成m條肽鏈,則可形成________個肽鍵,脫去______個水分子，至少有氨基和羧基各____個11、相關(guān)計算n-mn-mm思考：血紅蛋白共有574個氨基酸，4條肽鏈，至少有氨基、羧基多少？第三十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二③蛋白質(zhì)可以含有一條或n條肽鏈、肽鏈通過化學(xué)鍵（如二硫鍵）互相連接，具有不同的空間結(jié)構(gòu)第三十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二第三十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二④關(guān)于蛋白質(zhì)相對分子量的計算：n個氨基酸形成m條肽鏈，每個氨基酸的平均相對質(zhì)量為a,那么由此形成的蛋白質(zhì)的相對分子量為______________n·a-(n-m)·18第三十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細(xì)胞血漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色1、洗滌紅細(xì)胞(2)洗滌過程（一）樣品處理（1）洗滌目的:去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，洗滌次數(shù)不可過少。第三十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二1、速度越高和時間越長會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達不到分離的效果。問：1、洗滌操作過程中，為什么要低速短時間離心？2、為了使紅細(xì)胞洗滌干凈，需如何處理？3、用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9％的氯化鈉溶液洗滌，能否用蒸餾水或濃度高的氯化鈉溶液？為什么？1、紅細(xì)胞的洗滌2、重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。

（一）樣品處理第四十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二2、血紅蛋白的釋放：

加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯

，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。磁力攪拌器攪拌器轉(zhuǎn)子蒸餾水：使紅細(xì)胞吸水脹破甲苯：溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜充分?jǐn)嚢璧哪康模杭铀偌t細(xì)胞的破裂第四十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二攪拌器正在工作第四十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二紅細(xì)胞破碎混合液高速離心10min離心管濾紙過濾脂類物質(zhì)燒杯3分離血紅蛋白第四十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二20mmol/L磷酸緩沖液（二）透析血紅蛋白——粗分離透析的目的：去除血紅蛋白溶液中的小分子雜質(zhì)透析的原理：

透析袋是半透膜，能使小分子自由進出，而將大分子保留在袋內(nèi)。透析袋透析的過程：取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12h。第四十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二1.凝膠色譜柱的制作2.凝膠色譜柱的裝填3.樣品的加入和洗脫（三）血紅蛋白的純化-凝膠色譜操作第四十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二1凝膠色譜柱的制作①主體：取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端用砂紙磨平。③底塞(帶樣品出口)：

橡皮塞上部打孔挖出凹穴安裝移液管頭部(樣品出口)在凹穴上方依次覆蓋尼龍網(wǎng)和尼龍紗，包好②頂部：安裝了玻璃管的橡皮塞第四十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二2凝膠色譜柱的裝填(1)計算凝膠用量(3)配制凝膠懸浮液計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水中充分溶脹。(2)凝膠的選擇：交聯(lián)葡聚糖凝膠(G-75）“G”:

凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75：凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5g第四十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二(5)洗滌平衡：

裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時。(4)裝填凝膠懸浮液：

將色譜柱固定在支架上，將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時輕敲色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。第四十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。

④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）

注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。3樣品的加入和洗脫第四十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。第五十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二加樣(蛋白質(zhì)混合物)洗脫(緩沖液)收集(分離)緩沖液第五十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二緩沖液出樣口加樣第五十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二樣品的加入和洗脫的操作不正確的是A．加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面B．加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)C．等樣品完全進入凝膠層后，關(guān)閉下端出口D．用吸管小心的將1ml透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面

A

第五十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二分子向陽極移動陽極水平電泳------DNA的分離（四）純度鑒定-----SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳第五十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二垂直電泳裝置---用于蛋白質(zhì)分離鑒定第五十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二加樣：用移液器吸取樣品后，將樣品加入加樣孔中樣品遷移方向加樣孔(嵌入凝膠一端)凝膠(沒入電解緩沖液中)電極SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳第五十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二電泳過程中分子遷移的規(guī)律：小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒。混合樣品凝膠按分子大小分離電泳方向電泳小分子大分子第五十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期二思考：如何測定未知種類蛋白質(zhì)的分子量？使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電