選修三基因工程操作程序鬻

選修三基因工程操作程序鬻第一頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子外顯子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)(啟動子)。與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)第二頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的，邊_________邊_________編碼區(qū)是間隔的、_____的，先_____后_____相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼轉(zhuǎn)錄翻譯轉(zhuǎn)錄翻譯第三頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二①目的基因的獲?、诨虮磉_(dá)載體的構(gòu)建（核心）③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞④目的基因的檢測與鑒定四個步驟第四頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因請舉出三個以上的例子2、獲取目的基因的常用方法（1）從基因文庫中獲取（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成第五頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二1)基因文庫？1.從基因文庫中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫2)基因文庫的種類:種類基因組DNA文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫第六頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二基因文庫的構(gòu)建方法①基因組文庫的構(gòu)建提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接重組載體基因組文庫導(dǎo)入受體菌中儲存第七頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二②cDNA文庫的構(gòu)建-----逆轉(zhuǎn)錄法：提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時(shí)期的mRNA單鏈DNA雙鏈cDNA片段重組載體與載體連接cDNA文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶導(dǎo)入受體菌中儲存第八頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二思考？真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到的cDNA與原基因相同嗎？第九頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二真核細(xì)胞的cDNA的獲取編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)DNA聚合酶剪接有關(guān)的酶RNA聚合酶mRNA前體mRNA單鏈DNAcDNA逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄剪接逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制啟動子終止子基因不含非編碼序列。即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子第十頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較

文庫類型cDNA文庫

基因組文庫

文庫大小基因中啟動子（具有啟動作用的DNA片段）基因中內(nèi)含子(位于編碼蛋白質(zhì)序列的非編碼DNA片段）

基因多少

物種間的基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以第十一頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)。2原理：DNA復(fù)制原料：模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列第十二頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二1.變性（95℃）雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成________氫鍵單鏈DNA2.復(fù)性

(55℃)溫度降低，

與DNA模板結(jié)合，形成局部______。雙鏈引物3.延伸（72℃）在

的作用下，從引物的

連接

，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。3′端脫氧核苷酸Taq酶第十三頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二PCR技術(shù)的操作過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復(fù)a.b.c步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加___倍一第十四頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)場所原理?xiàng)l件解旋方式酶特點(diǎn)結(jié)果堿基互補(bǔ)配對原則堿基互補(bǔ)配對原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再復(fù)制體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)大量的DNA片段形成整個DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶等第十五頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二3.人工合成法

在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成推測推測思考：化學(xué)法合成的目的基因含內(nèi)含子、啟動子和終止子嗎？第十六頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二反轉(zhuǎn)錄法：

雜交雙鏈(單鏈RNA/單鏈DNA)單鏈DNA雙鏈DNA(cDNA)目的基因的mRNA某種酶DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶人工合成法（真核生物）第十七頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二課堂小結(jié)目的基因的獲取1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫第十八頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心1目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因第十九頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二表達(dá)載體啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來第二十頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子表達(dá)載體同一種一個切口兩個黏性末端第二十一頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二注意：①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動子、終止子對于目的基因表達(dá)必不可少④目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。第二十二頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二

三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。2常用的受體細(xì)胞：大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細(xì)胞等。3目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。第二十三頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點(diǎn):能感染雙子葉植物和祼子植物,對單子葉植物無感染能力Ti質(zhì)粒的T—DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到其染色體上轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌第二十四頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二1、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法（2）基因槍法：目的基因?qū)雴巫尤~植物細(xì)胞①操作方法：利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。②

鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.6～4um。③適用：單子葉植物第二十五頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二1、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法（3）花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞①操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞②

特點(diǎn):十分簡便經(jīng)濟(jì)。③例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉第二十六頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二2、將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞①方法：顯微注射法①程序目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動物第二十七頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞過程：Ca2+處理受體細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞重組表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子思考：早期的基因工程用什么作受體細(xì)胞？為什么？常用原核生物，因?yàn)樵松锓敝晨?、多為單?xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少等。方法——Ca2+處理法用Ca2＋處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性思考：為什么要用Ca2+處理受體細(xì)胞？第二十八頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化——方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)第二十九頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二

四、目的基因的檢測與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入重組DNA分子嗎？1真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少。2目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？不一定，需要檢測第三十頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二1、鑒定——分子水平的鑒定轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因基因探針：放射性同位素等標(biāo)記的DNA分子方法——DNA分子雜交技術(shù)變性變性第三十一頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二第三十二頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二1、鑒定——分子水平的鑒定變性方法——分子雜交技術(shù)（2）檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA14N14N第三十三頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二1、鑒定——分子水平的鑒定提?。?）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)第三十四頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期二2、鑒定——個體水平的鑒定抗蟲、抗病接種實(shí)驗(yàn)，活性比較實(shí)驗(yàn)例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目