染色體工程課件

第六章染色體工程6.1人工誘導(dǎo)多倍體6.2人工誘導(dǎo)雌雄核發(fā)育6.3動物的性別控制6.4染色體分離與轉(zhuǎn)移6.5人工染色體染色體工程是人們按照一定的設(shè)計，有計劃地消減、添加或代換同種或異種染色體的技術(shù)。它不但在遺傳學(xué)等生命科學(xué)基礎(chǔ)理論研究上大有可為，在人工誘導(dǎo)多倍體的育種研究、人工誘導(dǎo)雌、雄核發(fā)育及性別控制等研究領(lǐng)域都將大顯身手，為人類造福6.1人工誘導(dǎo)多倍體多倍體(polyploid)是指每個體細胞中含有三個或更多染色體組的個體，在自然界高等植物中較多出現(xiàn)，而動物界較少。1939年，F(xiàn)rankhauser和Griftiths首先在兩棲類中成功地誘發(fā)了三倍體。由于多倍體動物具有生長速度快，成活率高及抗病能力強等特點，所以人工誘導(dǎo)多倍體，改善動物經(jīng)濟性狀倍受重視?，F(xiàn)在，該技術(shù)已成為低等經(jīng)濟動物育種的主要技術(shù)之一，其成果已經(jīng)應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，取得了明顯的經(jīng)濟效益和社會效益多倍體的形成多倍體是由于細胞內(nèi)染色體加倍而形成的，即通過抑制受精卵第二極體的放出了產(chǎn)生三倍體或抑制第一次卵裂產(chǎn)生四倍體，可以利用生物、化學(xué)和物理的方法得到多倍體。生物學(xué)上主要通過雜交尤其是種間雜交獲得異源多倍體。物理學(xué)方法包括溫度休克法、水靜壓法和高鹽高堿法等。有些化學(xué)物質(zhì)也可以用來阻止第二極體的排出或受精卵的有絲分裂而產(chǎn)生三倍體或四倍體，如細胞松弛素B。生物學(xué)方法生物學(xué)上主要通過雜交尤其是種間雜交獲得異源多倍體。例如用雌性草魚（2n＝48）與雄性三角魴（2n＝48）雜交可以獲得子一代草魴雜種三倍體。這種不同科、屬、種之間的遠源雜交、會導(dǎo)致第二極體不排出，而產(chǎn)生多倍體。物理學(xué)方法溫度休克法：冷休克法（0～5度）和熱休克法（30度左右）。定義：用略高于或略低于致死溫度的冷或熱休克來誘導(dǎo)三倍體或四倍體的方法。關(guān)鍵：能否成功地阻止第二次成熟分裂或第二極體的排出。要達到這一點，必須考慮溫度處理的開始時間（TA）、處理持續(xù)時間（D）和處理溫度（T）這三個因素。目前對魚類使用溫度休克法誘導(dǎo)三倍體的工作報道較多。一般來說，冷水性魚類如鮭科種類應(yīng)用熱休克法、而溫水性魚類用冷休克效果較好。優(yōu)點：廉價、易操作，是誘導(dǎo)動物細胞多倍體化的常用手段，也有利于大規(guī)模生產(chǎn)使用。該法的成功率為80％。染色體介導(dǎo)技術(shù):使細胞經(jīng)有絲分裂阻斷秋水仙胺處理而同步，再洗滌數(shù)次以去除殘存于細胞破碎和保持染色體的形狀；性別控制（sexcontrol）：通過人為地干預(yù)或操作，使動物按人們的愿望繁殖出所需性別的后代的技術(shù)。多倍體(polyploid)是指每個體細胞中含有三個或更多染色體組的個體，在自然界高等植物中較多出現(xiàn)，而動物界較少。細胞毒性分析法:將H-Y抗血清與補體（豚鼠血清）加入培養(yǎng)液中對胚胎進行培養(yǎng)，將在培養(yǎng)過程中繼續(xù)發(fā)展發(fā)育胚胎分類微H-Y－（雌性），將出現(xiàn)個別卵裂球溶解以及不能發(fā)育到囊胚期者分類為H-Y＋（雄性），用這種方法鑒定的H-Y胚胎移植后所生仔鼠有86％為雌性。但是仍舊在遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論和育種中都有一定的價值，利用雄核生殖的精子可用育冷凍基因庫，保存種質(zhì)資源對基因世代克隆系的建立，不同種間核質(zhì)的雜種的產(chǎn)生和YY雄性引起的性別控制等也有特殊的意義。人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育是指用經(jīng)過紫外線、X射線或Y射線等處理后的失活精子來“受精”，再在適當(dāng)時間施以冷、熱、高壓等物理處理，以抑制第二極體的排出，使卵子發(fā)育為正常的二倍體動物。要達到這一點，必須考慮溫度處理的開始時間（TA）、處理持續(xù)時間（D）和處理溫度（T）這三個因素。一般來說，冷水性魚類如鮭科種類應(yīng)用熱休克法、而溫水性魚類用冷休克效果較好。質(zhì)量好的染色體標本可以從胚胎獲得，因為胚胎細胞分裂指數(shù)高。秋水仙堿可以抑制細胞分裂中紡錘絲的形成，因而抑制有絲分裂，這在植物中已經(jīng)廣泛應(yīng)用。溫度對某些生物而言，是一條控制性別發(fā)育的途徑。這種方法分析的靈敏度之高，甚至單個精子細胞的性別也可在3小時之內(nèi)鑒定出來。假如二倍體源自第一次有絲分裂的抑制，雜和雌性個體的子代應(yīng)該都是純合型；1939年，F(xiàn)rankhauser和Griftiths首先在兩棲類中成功地誘發(fā)了三倍體。ZW型，大部分鳥類、鱗翅目昆蟲、一部分魚類和兩棲類屬于這種類型。但試驗證明，溫度變化只改變了性別發(fā)育的方向，并沒有改變?nèi)旧w組成。γ射線和X射線具有較高的穿通能力，有利于處理大量精子，其主要作用可能是誘使染色體斷裂，因而對精子的存活可能有一定影響。多倍體是由于細胞內(nèi)染色體加倍而形成的，即通過抑制受精卵第二極體的放出了產(chǎn)生三倍體或抑制第一次卵裂產(chǎn)生四倍體，可以利用生物、化學(xué)和物理的方法得到多倍體。蛋白質(zhì)電泳鑒定：間接法物理學(xué)方法水靜壓法：采用較高的水靜壓（65kg/cm2）來抑制第二極體的放出或第一次卵裂產(chǎn)生多倍體。這種方法誘導(dǎo)率高（一般在90％～100％）、處理時間（3～5min）短，對受精卵損傷小、成活率高。但是，該法需要專門的設(shè)備——水壓機，成本較高，其樣品室容量有限，處理卵的量有限，所以不適于大規(guī)模生產(chǎn)的。化學(xué)方法有些化學(xué)物質(zhì)也可以用來阻止第二極體的排出或受精卵的有絲分裂而產(chǎn)生三倍體或四倍體。細胞松弛素B能抑制肌動蛋白聚合微絲，從而抑制細胞質(zhì)分裂。秋水仙堿可以抑制細胞分裂中紡錘絲的形成，因而抑制有絲分裂，這在植物中已經(jīng)廣泛應(yīng)用。其它藥物還有麻醉劑，如N2O、CHClF2和聚乙二醇等。缺點：化學(xué)藥品一般比較昂貴、且具有毒性，影響處理后的胚胎發(fā)育，同時加上化學(xué)藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的多倍體往往是在育種上沒有價值的鑲嵌體，所以化學(xué)方法在實際中的應(yīng)用不及物理方法。鑒定方法核體積測量：間接法測量紅血球來鑒定：間接法蛋白質(zhì)電泳鑒定：間接法染色體計數(shù)是鑒定多倍體倍性：直接法另外，利用血液成分、酶的含量等進行生化分析也可以鑒定多倍體。采用何種方法均有利有弊，進行鑒定主要依賴于所測樣本的發(fā)育時期、實驗要求和所具備的儀器設(shè)備條件。主要方法的介紹核體積測量屬于間接法。一般，細胞核大小與染色體數(shù)目成比例增加，而且為維持恒定的核質(zhì)比例，隨著細胞核的增大，細胞大小也按比例增加。因此組成多倍體有機體的細胞及細胞核通常要比二倍體大一些。但多倍體的器官或身體并不一定都比二倍體大。主要方法的介紹在魚類，通常通過測量紅血球來鑒定多倍體倍性，其中核體積之比最為常用，也有用核面積甚至單獨用核長X或短X之比來表示的。蛋白質(zhì)電泳也可以用來鑒定多倍體倍性，屬于間接法，但在鑒定時要慎用。利用血清蛋白質(zhì)電泳圖差異來辨別二倍體和三倍體卵胎生帆鏘，但不能用來分辨關(guān)東銀鯽。染色體計數(shù)是鑒定多倍體倍性的一個準確的直接方法，但比較費時。質(zhì)量好的染色體標本可以從胚胎獲得，因為胚胎細胞分裂指數(shù)高。流式細胞儀測定DNA含量是較準確的方法優(yōu)點和缺點多倍體育種技術(shù)方法簡單、見效快，具有潛在的理論和應(yīng)用價值。許多誘導(dǎo)的多倍體動物如兩棲類、魚類、貝類等卻具有良好的生存力和生長率。種間雜交生長快，可以同時具有兩個不同的種的優(yōu)良特性，但成活率較低。利用三倍體不育的特性，將生殖腺發(fā)育消耗的能量用于動物生長，可以避免因繁殖季節(jié)及肉質(zhì)下降而延誤上市時間或影響商品價值，縮短了養(yǎng)殖周期，減少了養(yǎng)殖成本，這在鮑魚、昆蟲等方面已有應(yīng)用。某些多倍體動物肉質(zhì)量、含氧量、抗病性等經(jīng)濟性狀較二倍體好。雖然，還有一些難點比如準確的處理時間、誘導(dǎo)率、成活率、孵化率、倍性鑒定方法等還未解決，但隨生命科學(xué)的進一步發(fā)展，多倍體育種技術(shù)將為人類做出更大的貢獻。5.2人工誘導(dǎo)雌、雄發(fā)育雌核發(fā)育（gynogenesis），俗稱假受精，意指精子雖然正常地鉆入和激活卵子，但精子的細胞核并未參與卵球的發(fā)育，精子的染色體很快消失，胚胎的發(fā)育僅在母體遺傳的控制下進行。自然界中一些無脊椎動物和魚類等存在。人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育是指用經(jīng)過紫外線、X射線或Y射線等處理后的失活精子來“受精”，再在適當(dāng)時間施以冷、熱、高壓等物理處理，以抑制第二極體的排出，使卵子發(fā)育為正常的二倍體動物。凡雌核發(fā)育的個體，都具有純母系的單倍體染色體組，依賴于卵子染色體組的二倍體化。歷史1911年，赫特威氏就第一個成功地人工消除了精子染色體活性，并發(fā)現(xiàn)了“赫特威氏效應(yīng)”。赫特威氏效應(yīng)指只有在適當(dāng)?shù)母咻椛鋭┝肯拢拍軐?dǎo)致精子染色體完全失活，屆時精子雖能穿入卵內(nèi)，卻能起到激活卵球啟動發(fā)育的作用。雌核發(fā)育的關(guān)鍵問題要達到實驗性二倍體雌核發(fā)育目的，必須解決兩個最主要的問題。第一：人為地使精子的遺傳物質(zhì)失活；第二：阻止雌性個體染色體數(shù)目的減少。不同種類的物理輻射和化學(xué)藥品的處理對精子遺傳物質(zhì)失活頗為有效。輻射處理包括γ射線（通常用60Co或173Cs）、X射線和紫外光線。γ射線和X射線具有較高的穿通能力，有利于處理大量精子，其主要作用可能是誘使染色體斷裂，因而對精子的存活可能有一定影響。紫外光的主要作用是誘使胸腺嘧啶二聚化，因此這一過程能在光作用下修補復(fù)活，但對較厚的、不透明的精細胞樣品，失活的效果較差，不適易處理大體積精子。采用顯微手術(shù)也可以直接去除受精卵中雄性原核，再在第一次卵裂時期二倍體化，而得到雌核發(fā)育的二倍體，這在小鼠實驗中已經(jīng)成功。另外，甲苯胺藍、乙烯尿素、二甲基硫酸等化學(xué)物質(zhì)具有消除精子染色體遺傳活性的能力，其機理可能是與精子DNA相互作用。核體積測量屬于間接法。此外,胚胎質(zhì)量似乎也與熒光強度和類型有關(guān)，第二抗體有時發(fā)生非特異性結(jié)合，如與同卵周隙的細胞碎片結(jié)合等。間接免疫熒光法:將胚胎先用H-Y抗體處理30分鐘，再用異硫氰酸鹽熒光素（FITC）標記的二抗處理，根據(jù)特異熒光判斷，有熒光者為雄胚，無熒光者為雌胚，將兩類胚胎移植后，判為雄胚者有78％發(fā)育成雄鼠，判微雌胚者有81％發(fā)育為雌鼠。胚胎性別鑒定研究注意采用四種方法：細胞遺傳學(xué)方法、生物化學(xué)方法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法當(dāng)前用PCR進行胚胎性別鑒定的最大問題是污染，在采胚細胞時采到粘在胚胎上的精子、或切割刀粘上另一個胚胎的細胞、空氣中的污染、PCR、試劑的污染以及培養(yǎng)液中的BSA、FCS都可能成為污染源、引致假陽性結(jié)果。YAC是酵母人工染色體的縮寫。3）雄性單倍體型：沒有單獨的性染色體存在，其性別決定于卵細胞是否受精。對胚胎的H-Y抗原檢測有三種方法：即細胞毒性分析法、間接免疫熒光分析法和囊胚形成抑制法。1kb，編碼204個氨基酸蛋白質(zhì)，其高泳動類非組蛋白(HMG)高度保守。測量紅血球來鑒定：間接法免疫學(xué)方法：利用H-Y抗血清或H-Y單克隆抗體檢測胚胎上是否存在雄性特異性H-Y抗原，從而進行胚胎性別鑒定的一種方法。環(huán)境決定性別可以分為兩種類型SRY啟動睪丸分化，然后由睪丸分泌睪酮（T）和AMH(轉(zhuǎn)化因子B家族的一員)控性別的分化。性別控制（sexcontrol）：通過人為地干預(yù)或操作，使動物按人們的愿望繁殖出所需性別的后代的技術(shù)。人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育是指用經(jīng)過紫外線、X射線或Y射線等處理后的失活精子來“受精”，再在適當(dāng)時間施以冷、熱、高壓等物理處理，以抑制第二極體的排出，使卵子發(fā)育為正常的二倍體動物。缺點：化學(xué)藥品一般比較昂貴、且具有毒性，影響處理后的胚胎發(fā)育，同時加上化學(xué)藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的多倍體往往是在育種上沒有價值的鑲嵌體，所以化學(xué)方法在實際中的應(yīng)用不及物理方法。對胚胎的H-Y抗原檢測有三種方法：即細胞毒性分析法、間接免疫熒光分析法和囊胚形成抑制法。1911年，赫特威氏就第一個成功地人工消除了精子染色體活性，并發(fā)現(xiàn)了“赫特威氏效應(yīng)”。染色體計數(shù)是鑒定多倍體倍性：直接法例如某些蛙類XX為雌體，XY為雄體，若蝌蚪在20℃下發(fā)育，子代一半為雄性，一半為雌性；雄核發(fā)育的個體的生存率非常低，這是由于精子基因型的純合性、卵子由于照射的損傷和阻止第一次卵裂處理的損傷等原因造成的。實現(xiàn)二倍體化利用保留卵球第二極體，或者阻礙受精卵早期有絲分裂，都可以實現(xiàn)二倍體化。如前節(jié)所述，利用溫度、壓力或化學(xué)方法可以誘使卵球二倍體化，如冷休克、熱休克、流體靜水壓、細胞松弛素B、聚乙二醇處理等，這些都已經(jīng)在魚類上實現(xiàn)。鑒定方法鑒別雌核發(fā)育的個體，通常以顏色、形態(tài)以及生化等方面的指標為依據(jù)，也可以通過細胞學(xué)的研究。若是雌核發(fā)育，其囊胚細胞中只出現(xiàn)一套來自雌核的染色體，否則雌核和雄核染色體各占一半，得到的是雜交種。用遺傳標志的方法來鑒別雄核發(fā)育的二倍體化，即由第一次有絲分裂的阻礙，還是由保留極體而來。假如二倍體源自第一次有絲分裂的抑制，雜和雌性個體的子代應(yīng)該都是純合型；而如果是通過阻止第二極體的外排產(chǎn)生的雌核發(fā)育個體，則子代的情況取決于著絲點與基因間的距離。在著絲點－基因距離遠離時，將明顯增加雜和型子代的比例。優(yōu)缺點雌核發(fā)育具有產(chǎn)生單性種群的能力，用之已經(jīng)成功地得到100％草魚、鯉魚的雌性個體，其核型與同型雌性配子一樣，但也不可避免地會導(dǎo)致后代的近親繁殖的衰退，因此其實際應(yīng)用價值有待研究。能得到同源型的二倍體克隆，在育種上具有重要性，也提供了一種優(yōu)越的研究品系。如果用激素致使性反轉(zhuǎn)為雄性，再與同胞姐妹交配，可以獲得強壯的純系同型配子的二倍體。借助雌核發(fā)育，可以得到新的純系來篩選，除去有害的等位基因，改良近親繁殖系。雌核發(fā)育還可以為遺傳學(xué)研究提供某些致死突變種的生物品系，精確地測定雌核發(fā)育引起的近親繁殖衰退程度，影響生存力的致死基因的測定和分析，成為個體發(fā)育研究和遺傳育種實踐的好材料。雄核發(fā)育（androgenesis）是指因經(jīng)過紫外線、X射線或Y射線處理的卵子與正常的精子受精，再在適當(dāng)時間施以冷、熱或高壓等物理處理，使進入卵子內(nèi)的精子染色體加倍，而發(fā)育成為完全為父本性狀的二倍體。雄核發(fā)育的個體的生存率非常低，這是由于精子基因型的純合性、卵子由于照射的損傷和阻止第一次卵裂處理的損傷等原因造成的。但是仍舊在遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論和育種中都有一定的價值，利用雄核生殖的精子可用育冷凍基因庫，保存種質(zhì)資源對基因世代克隆系的建立，不同種間核質(zhì)的雜種的產(chǎn)生和YY雄性引起的性別控制等也有特殊的意義。5.3動物的性別控制

性別控制（sexcontrol）：通過人為地干預(yù)或操作，使動物按人們的愿望繁殖出所需性別的后代的技術(shù)。動物性別控制在畜牧業(yè)、家禽養(yǎng)殖業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和家蠶養(yǎng)殖業(yè)等方面有重要的經(jīng)濟意義。一般，雌性的經(jīng)濟效益較雄性的經(jīng)濟效益高。實現(xiàn)性別控制，不僅可以提高大量雌性個體如奶牛、奶羊、母雞的數(shù)量，節(jié)省懷公犢（羔）雌體繁殖年度的飼料消耗。雄性肉牛、綿羊和豬等則以雄性增重要快，肉質(zhì)優(yōu)，故可通過性別控制多產(chǎn)雄性后代。同時通過性別控制可以消滅不理想的隱性疾病，防止性連鎖疾病；加快珍惜動物的繁殖、保種進程；促進遺傳科學(xué)的發(fā)展。在有性生殖的生物中，不同生物性別決定的機制有所不同，大多數(shù)決定于性染色體的差異，少數(shù)取決于體細胞染色體的倍數(shù)性，極少數(shù)決定于個體發(fā)育所處的內(nèi)外環(huán)境條件。性別決定的遺傳類型1）雄性異配子型：該類型的雌性個體只產(chǎn)生一種染色體組成的配子，雄性個體產(chǎn)生兩種不同類型的配子。包括：XO型，屬于這一類的有大部分直翅目昆蟲以及臭蟲、蜘蛛、多足類昆蟲和線蟲等；XY型，絕大部分哺乳類動物、雙翅目、鞘翅目昆蟲，以及某些魚類和兩棲類為此類型。2）雌性異配子型：雄性個體只產(chǎn)生一種染色體組成的配子，而雌性個體產(chǎn)生兩種不同的配子。ZO型，主要發(fā)生在某些昆蟲中；ZW型，大部分鳥類、鱗翅目昆蟲、一部分魚類和兩棲類屬于這種類型。3）雄性單倍體型：沒有單獨的性染色體存在，其性別決定于卵細胞是否受精。由孤雌生殖產(chǎn)生的單倍體卵發(fā)育為雄性個體，二倍體的受精卵發(fā)育為雌性個體。這一類型主要是膜翅目昆蟲，包括蜜蜂、馬蜂、葉蜂和螞蟻等環(huán)境決定性別可以分為兩種類型內(nèi)在環(huán)境型：即某些低等的雌雄同體動物和絕大部分雌雄同株和雌雄同花植物，它們的同一個體能夠分化出兩種性器官，產(chǎn)生兩種配子，例如蚯蚓、蘋果、蝸牛和多數(shù)顯花植物屬于此類，它們不同性腺和配子的產(chǎn)生僅僅取決于所處位置及內(nèi)在發(fā)育環(huán)境的差異。外在環(huán)境型：因所處外界環(huán)境條件的不同，而引起性別的表現(xiàn)不同。例如某些蛙類XX為雌體，XY為雄體，若蝌蚪在20℃下發(fā)育，子代一半為雄性，一半為雌性；在30℃下發(fā)育，則全部發(fā)育為雄蛙。但試驗證明，溫度變化只改變了性別發(fā)育的方向，并沒有改變?nèi)旧w組成。性別決定的理論1.性傾向的平衡學(xué)說1932年，布里奇斯提出平衡學(xué)說，又稱Bridges平衡學(xué)說。用二倍體的雄果蠅（2n=8）與三倍體的雌果蠅(2n=12)雜交，在后代中獲得了具有不同染色體組合的個體。根據(jù)X染色體和常染色體(A)之間的平衡性，他觀察到不同程度的雄性和雌性。以X染色體與常染色體間的X/A比率來表示這種平衡，在果蠅中，Y染色體在性別決定上似乎不具有任何效應(yīng)。2.Y染色體決定雄性理論在人類和其他哺乳動物中，Y染色體是強有力的雄性決定因子。雌性個體為XX，雄性個體為XY，據(jù)試驗觀察證實，凡是Y染色體存在的，無論X染色體多少，都表現(xiàn)為雄性個體，這不符合性傾向的平衡理論，性別表現(xiàn)主要取決于Y染色體的存在與否。3.Goldschmidt學(xué)說戈爾德施密特(Goldschmidt，1934)的研究是在舞毒蛾上進行的。這種生物的雄性是同配性別的（WW），而雌性是異配性別的(WZ),雌雄嵌合體的中間性別很普通。Goldschmidt認為，舞毒蛾的性別是由母蛾遺傳來的雌性性別決定因子(F)和位于W染色體上的雄性性別決定因子（M）這兩種力量的對比或平衡所決定的。認為雌性組成方式是F/W(F>W),而雄性是F/MM(F<MM)，若雄性和雌性決定因子強度平衡，則出現(xiàn)雌雄嵌合體的中間性別。另外，利用血液成分、酶的含量等進行生化分析也可以鑒定多倍體。但試驗證明，溫度變化只改變了性別發(fā)育的方向，并沒有改變?nèi)旧w組成。蛋白質(zhì)電泳鑒定：間接法在魚類，通常通過測量紅血球來鑒定多倍體倍性，其中核體積之比最為常用，也有用核面積甚至單獨用核長X或短X之比來表示的。缺點是可鑒定的胚胎較少。YAC是酵母人工染色體的縮寫。一般來說，冷水性魚類如鮭科種類應(yīng)用熱休克法、而溫水性魚類用冷休克效果較好。1kb，編碼204個氨基酸蛋白質(zhì)，其高泳動類非組蛋白(HMG)高度保守。在有性生殖的生物中，不同生物性別決定的機制有所不同，大多數(shù)決定于性染色體的差異，少數(shù)取決于體細胞染色體的倍數(shù)性，極少數(shù)決定于個體發(fā)育所處的內(nèi)外環(huán)境條件。其它藥物還有麻醉劑，如N2O、CHClF2和聚乙二醇等。水靜壓法：采用較高的水靜壓（65kg/cm2）來抑制第二極體的放出或第一次卵裂產(chǎn)生多倍體。兩種類型配子的分離是由異配型的性別來實現(xiàn)的。間接免疫熒光法:將胚胎先用H-Y抗體處理30分鐘，再用異硫氰酸鹽熒光素（FITC）標記的二抗處理，根據(jù)特異熒光判斷，有熒光者為雄胚，無熒光者為雌胚，將兩類胚胎移植后，判為雄胚者有78％發(fā)育成雄鼠，判微雌胚者有81％發(fā)育為雌鼠。性染色體引起性別分化的途徑3）在果蠅中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)某一條染色體集中較多的與性別有關(guān)的基因時，可以變成性染色體。此外,胚胎質(zhì)量似乎也與熒光強度和類型有關(guān)，第二抗體有時發(fā)生非特異性結(jié)合，如與同卵周隙的細胞碎片結(jié)合等。一般來說，冷水性魚類如鮭科種類應(yīng)用熱休克法、而溫水性魚類用冷休克效果較好。最后使細胞經(jīng)注射針噴射而破碎，即可使染色體釋放出來。但是，該法需要專門的設(shè)備——水壓機，成本較高，其樣品室容量有限，處理卵的量有限，所以不適于大規(guī)模生產(chǎn)的。常染色體集中了許多雄性傾向基因，因而也對性別起作用。溫度休克法：冷休克法（0～5度）和熱休克法（30度左右）。酵母人工染色體是典型的克隆系統(tǒng)，可以用來分離和克隆極大的DNA片段。多倍體(polyploid)是指每個體細胞中含有三個或更多染色體組的個體，在自然界高等植物中較多出現(xiàn)，而動物界較少。水靜壓法：采用較高的水靜壓（65kg/cm2）來抑制第二極體的放出或第一次卵裂產(chǎn)生多倍體。在類似的研究中，用生物素標記的Y特異性探針進行原位雜交，準確率達100％。XY型，絕大部分哺乳類動物、雙翅目、鞘翅目昆蟲，以及某些魚類和兩棲類為此類型。要達到這一點，必須考慮溫度處理的開始時間（TA）、處理持續(xù)時間（D）和處理溫度（T）這三個因素。多倍體(polyploid)是指每個體細胞中含有三個或更多染色體組的個體，在自然界高等植物中較多出現(xiàn)，而動物界較少。一般來說，冷水性魚類如鮭科種類應(yīng)用熱休克法、而溫水性魚類用冷休克效果較好。3）在果蠅中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)某一條染色體集中較多的與性別有關(guān)的基因時，可以變成性染色體。細胞毒性分析法:將H-Y抗血清與補體（豚鼠血清）加入培養(yǎng)液中對胚胎進行培養(yǎng)，將在培養(yǎng)過程中繼續(xù)發(fā)展發(fā)育胚胎分類微H-Y－（雌性），將出現(xiàn)個別卵裂球溶解以及不能發(fā)育到囊胚期者分類為H-Y＋（雄性），用這種方法鑒定的H-Y胚胎移植后所生仔鼠有86％為雌性。人的SRY基因位于YP11.測量紅血球來鑒定：間接法3）在果蠅中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)某一條染色體集中較多的與性別有關(guān)的基因時，可以變成性染色體。在類似的研究中，用生物素標記的Y特異性探針進行原位雜交，準確率達100％。用遺傳標志的方法來鑒別雄核發(fā)育的二倍體化，即由第一次有絲分裂的阻礙，還是由保留極體而來。利用保留卵球第二極體，或者阻礙受精卵早期有絲分裂，都可以實現(xiàn)二倍體化。這就對操作過程提出了更嚴格的要求但是，該法需要專門的設(shè)備——水壓機，成本較高，其樣品室容量有限，處理卵的量有限，所以不適于大規(guī)模生產(chǎn)的。生物學(xué)上主要通過雜交尤其是種間雜交獲得異源多倍體。反之，易形成XY的雄性合子。利用三倍體不育的特性，將生殖腺發(fā)育消耗的能量用于動物生長，可以避免因繁殖季節(jié)及肉質(zhì)下降而延誤上市時間或影響商品價值，縮短了養(yǎng)殖周期，減少了養(yǎng)殖成本，這在鮑魚、昆蟲等方面已有應(yīng)用。性染色體引起性別分化的途徑1)由單個基因或單個基因的復(fù)合體決定的。兩種類型配子的分離是由異配型的性別來實現(xiàn)的。單個基因可能有三種基因型為AA、AA’和A’A’。如果以同配性別AA出現(xiàn)則為雌性，而異配性別AA’出現(xiàn)則為雄性。前提是沒有A’A’產(chǎn)生。2）有些生物的性別決定是由于位于某染色體上的主基因發(fā)生突變來實現(xiàn)的。通過長期的逐步分化，一個普通染色體可能會演變?yōu)闆Q定性別的性染色體。玉米這種雌雄異花同株的植物就是如此，當(dāng)空桿6a基因或無花絲8k基因發(fā)生突變后，可以抑制雌穗發(fā)育。3）在果蠅中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)某一條染色體集中較多的與性別有關(guān)的基因時，可以變成性染色體。X染色體事實上已集中了許多雌性傾向基因，成為決定雌性的主要遺傳基礎(chǔ)。常染色體集中了許多雄性傾向基因，因而也對性別起作用。3）在果蠅中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)某一條染色體集中較多的與性別有關(guān)的基因時，可以變成性染色體。X染色體事實上已集中了許多雌性傾向基因，成為決定雌性的主要遺傳基礎(chǔ)。常染色體集中了許多雄性傾向基因，因而也對性別起作用。4）在哺乳動物所以種類中，均發(fā)現(xiàn)了SRY基因，它是Y染色體性別決定區(qū)基因。人的SRY基因位于YP11.3，只含有一個外顯子，無內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄單位長約1.1kb，編碼204個氨基酸蛋白質(zhì)，其高泳動類非組蛋白(HMG)高度保守。哺乳動物性腺發(fā)育的基本途徑是雌性的，最早由DAX－1編碼的一種蛋白質(zhì)啟動，這一途徑在雄性體內(nèi)被SRY的活動所掩蓋。SRY啟動睪丸分化，然后由睪丸分泌睪酮（T）和AMH(轉(zhuǎn)化因子B家族的一員)控性別的分化。實現(xiàn)性別控制的方法對于較高等的動物，如家畜等，可以利用X、Y精子分離和胚胎性別鑒定技術(shù)來實現(xiàn)性別控制。依賴X和Y型精子不同的特性，人們試圖分離精子。早在1925年，Lush就通過離心法分離兔子的X與Y精子，但沒有成功。后來，人們試圖通過受精前陰道輸入精氨酸，改變生殖道pH的方式選擇性利用精子來控制性別比率為目的。pH值堿性，雌兔比例高，但結(jié)果不穩(wěn)定。利用免疫親和柱層析技術(shù)的方法，可以將表達H-Y抗原的Y精子于不表達的X精子分開。利用流式細胞儀鑒定精子DNA的含量，可以將X與Y精子分開。這類方法目前對精子分離的準確率為79％，對Y精子分離的準確率為70％。其主要缺點是分離速度慢，一臺分類器1小時僅能分離40萬個精子，不夠一次子宮頸內(nèi)輸精應(yīng)用，只能通過手術(shù)進行輸卵管輸精。溫度對某些生物而言，是一條控制性別發(fā)育的途徑。例如:鱷魚的性別完全由胚胎發(fā)育的溫度所決定，受精卵在30度發(fā)育起來的全是雌性，34度以上，孵化起來的全是雄性。另外，在牡蠣、蛙、和鱉等動物中也存在這樣的現(xiàn)象。性激素也可以控制性別，這甚至在鳥類和其它一些高等哺乳動物中也有體現(xiàn)，只是不同的動物受影響的程度有所不同罷了，這在魚類性別控制中有廣泛的應(yīng)用。利用甲基睪丸素、雄性激素等可以實現(xiàn)性反轉(zhuǎn)得到全部雄性個體，但指數(shù)表現(xiàn)型改變，不能遺傳。如果調(diào)整陰道酸堿度，也可以達到性別篩選的目的。當(dāng)陰道液偏酸時，Y型精子移動慢，而X型精子速度快，因而受精卵是XX的概率高；反之，易形成XY的雄性合子。該法的成功率為80％。如在精液中加入睪丸，胎血、腦垂體等生物制劑或激素，也可控制生物性別，該法的成功率也有60～70％。在低等動物中，通過人工雌雄核發(fā)育，三倍體激素等實現(xiàn)性別控制。性別鑒定雌性胚胎中存在的X染色體相關(guān)酶的活性、雄性胚胎存在的H-Y抗原以及SRY基因可以對植前胚進行性別鑒定。胚胎性別鑒定研究注意采用四種方法：細胞遺傳學(xué)方法、生物化學(xué)方法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法

細胞遺傳學(xué)方法：指通過核型分析對胚胎進行性別鑒定。其準確率為100％，但獲得高質(zhì)量的中期染色體分散相難度很大。生物化學(xué)微量分析法：指通過測定與X染色體相關(guān)聯(lián)的酶活性來鑒定雌性胚胎的一種方法。其原理是早期雌性胚胎的兩條X染色體中必有一條失活，在胚胎基因組的激活與X染色體失活之間的短暫時期內(nèi)，雌性的兩條X染色體都可以被轉(zhuǎn)移，這反映在雌性胚胎中與X染色體相關(guān)連的細胞內(nèi)濃度及活性是雄性胚胎的兩倍。此點可作為進行胚胎性鑒的依據(jù)免疫學(xué)方法：利用H-Y抗血清或H-Y單克隆抗體檢測胚胎上是否存在雄性特異性H-Y抗原，從而進行胚胎性別鑒定的一種方法。對胚胎的H-Y抗原檢測有三種方法：即細胞毒性分析法、間接免疫熒光分析法和囊胚形成抑制法。細胞毒性分析法:將H-Y抗血清與補體（豚鼠血清）加入培養(yǎng)液中對胚胎進行培養(yǎng)，將在培養(yǎng)過程中繼續(xù)發(fā)展發(fā)育胚胎分類微H-Y－（雌性），將出現(xiàn)個別卵裂球溶解以及不能發(fā)育到囊胚期者分類為H-Y＋（雄性），用這種方法鑒定的H-Y胚胎移植后所生仔鼠有86％為雌性。但該方法是以破壞一部分胚胎為代價。間接免疫熒光法:將胚胎先用H-Y抗體處理30分鐘，再用異硫氰酸鹽熒光素（FITC）標記的二抗處理，根據(jù)特異熒光判斷，有熒光者為雄胚，無熒光者為雌胚，將兩類胚胎移植后，判為雄胚者有78％發(fā)育成雄鼠，判微雌胚者有81％發(fā)育為雌鼠。此方法的主要優(yōu)點是不損害胚胎，亦具有適當(dāng)?shù)男詣e鑒定準確率，但對熒光強度的估價則具有高度的主觀性。此外,胚胎質(zhì)量似乎也與熒光強度和類型有關(guān)，第二抗體有時發(fā)生非特異性結(jié)合，如與同卵周隙的細胞碎片結(jié)合等。細胞毒性分析法:將H-Y抗血清與補體（豚鼠血清）加入培養(yǎng)液中對胚胎進行培養(yǎng)，將在培養(yǎng)過程中繼續(xù)發(fā)展發(fā)育胚胎分類微H-Y－（雌性），將出現(xiàn)個別卵裂球溶解以及不能發(fā)育到囊胚期者分類為H-Y＋（雄性），用這種方法鑒定的H-Y胚胎移植后所生仔鼠有86％為雌性。第一：人為地使精子的遺傳物質(zhì)失活；輻射處理包括γ射線（通常用60Co或173Cs）、X射線和紫外光線。每個YAC都可以裝進100萬堿基以上的DNA片段，既可以保證基因結(jié)構(gòu)的完整性，又可以大大減少核基因庫所需的克隆數(shù)目，從而使文庫的操作難度減少。蛋白質(zhì)電泳鑒定：間接法利用流式細胞儀鑒定精子DNA的含量，可以將X與Y精子分開。多倍體(polyploid)是指每個體細胞中含有三個或更多染色體組的個體，在自然界高等植物中較多出現(xiàn)，而動物界較少。溫度對某些生物而言，是一條控制性別發(fā)育的途徑。但是仍舊在遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論和育種中都有一定的價值，利用雄核生殖的精子可用育冷凍基因庫，保存種質(zhì)資源對基因世代克隆系的建立，不同種間核質(zhì)的雜種的產(chǎn)生和YY雄性引起的性別控制等也有特殊的意義。人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育是指用經(jīng)過紫外線、X射線或Y射線等處理后的失活精子來“受精”，再在適當(dāng)時間施以冷、熱、高壓等物理處理，以抑制第二極體的排出，使卵子發(fā)育為正常的二倍體動物。真核生物的染色體的關(guān)鍵序列：人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育是指用經(jīng)過紫外線、X射線或Y射線等處理后的失活精子來“受精”，再在適當(dāng)時間施以冷、熱、高壓等物理處理，以抑制第二極體的排出，使卵子發(fā)育為正常的二倍體動物。如果以同配性別AA出現(xiàn)則為雌性，而異配性別AA’出現(xiàn)則為雄性。但是仍舊在遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論和育種中都有一定的價值，利用雄核生殖的精子可用育冷凍基因庫，保存種質(zhì)資源對基因世代克隆系的建立，不同種間核質(zhì)的雜種的產(chǎn)生和YY雄性引起的性別控制等也有特殊的意義。其它藥物還有麻醉劑，如N2O、CHClF2和聚乙二醇等。最后使細胞經(jīng)注射針噴射而破碎，即可使染色體釋放出來。但試驗證明，溫度變化只改變了性別發(fā)育的方向，并沒有改變?nèi)旧w組成。染色體計數(shù)是鑒定多倍體倍性：直接法雄核發(fā)育的個體的生存率非常低，這是由于精子基因型的純合性、卵子由于照射的損傷和阻止第一次卵裂處理的損傷等原因造成的。對胚胎的H-Y抗原檢測有三種方法：即細胞毒性分析法、間接免疫熒光分析法和囊胚形成抑制法。最后使細胞經(jīng)注射針噴射而破碎，即可使染色體釋放出來。YAC既可以大到連在一起很容易形成很長的連續(xù)排列的DNA，又可以小到能夠方便地通過亞克隆進行DNA序列分析研究，這種特性對于目前正在實施的各種基因組計劃意義極大。囊胚形成抑制法:利用H-Y抗體對雄性桑椹胚向囊胚發(fā)育具有可逆性抑制的原理發(fā)展起的一種胚胎性別鑒定法。這種方法是一種簡單而有效的胚胎性別鑒定方法。不足之處是容易將一部分發(fā)育遲緩的雄性胚胎誤判為雌性胚胎分子生物學(xué)方法:指從胚胎取下少量細胞，將其DNA與Y染色體特異標記的DNA序列（探針）雜交。在類似的研究中，用生物素標記的Y特異性探針進行原位雜交，準確率達100％。此法的優(yōu)點是不用放射性標記、設(shè)備簡單、技術(shù)難度低，且可在24小時之內(nèi)得到結(jié)果.缺點是可鑒定的胚胎較少。通過聚合酶連式反應(yīng)擴增Y染色體DNA可大大增加靈敏度，改善準確度。這種方法分析的靈敏度之高，甚至單個精子細胞的性別也可在3小時之內(nèi)鑒定出來。當(dāng)前用PCR進行胚胎性別鑒定的最大問題是污染，在采胚細胞時采到粘在胚胎上的精子、或切割刀粘上另一個胚胎的細胞、空氣中的污染、PCR、試劑的污染以及培養(yǎng)液中的BSA、FCS都可能成為污染源、引致假陽性結(jié)果。這就對操作過程提出了更嚴格的要求5.4染色體轉(zhuǎn)移染色體轉(zhuǎn)移又稱為染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)，是指把同特定基因表達有關(guān)的染色體或染色體片段取出轉(zhuǎn)入受體細胞，使之表達，并能在細胞分裂中一代一代傳遞下去的技術(shù)。前面所講述的微細胞核移植是一種方法。染色體介導(dǎo)技術(shù):使細胞經(jīng)有絲分裂阻斷秋水仙胺處理而同步，再洗滌數(shù)次以去除殘存于細胞破碎和保持染色體的形狀；同時，在分離緩沖液中加入的乙烯乙二醇可維系染色體的完整性，提高鈣離子的濃度則能防止染色體的解離；最后使細胞經(jīng)注射針噴射而破碎，即可使染色體釋放出來。分離到中期染色體后，可以通過細胞的吞噬作用進入受體細胞。由于近年技術(shù)的改進，可先用磷酸鈣和染色體共沉淀，再用二甲亞砜處理受體細胞，或采用卵磷脂與膽固醇制備脂質(zhì)體，將染色體轉(zhuǎn)入受體細胞內(nèi)。轉(zhuǎn)移頻率可達10－5～10－4水平受體細胞的分離和鑒定導(dǎo)入基因的受體細胞還要利用HAT培養(yǎng)基等篩選系統(tǒng)將含有外