雙酶切及連接

雙酶切及連接第一頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二目錄原理類型命名法實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)連接常見問題及對(duì)策第二頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二DNA的限制性酶切實(shí)驗(yàn)原理核酸限制性內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈ＤＮＡ中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)，它們的功能猶似高等功物的免疫系統(tǒng)，用于抗擊外來ＤＮＡ的侵襲。限制性內(nèi)切酶以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的ＤＮＡ片段５’端為Ｐ，３’端為ＯＨ。第三頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性，催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。限制性內(nèi)切酶的類型第四頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二限制性內(nèi)切酶的類型

第一類（I型）限制性內(nèi)切酶：能識(shí)別專一的核苷酸順序，它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)很遠(yuǎn)的地方任意切割DNA鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機(jī)的。這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中用處不大，無法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。第五頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二

第二類（III型）限制性內(nèi)切酶：也有專一的識(shí)別順序，在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)也不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此也不能應(yīng)用于基因克隆。限制性內(nèi)切酶的類型第六頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二第三類（Ⅱ型）限制性內(nèi)切酶：就是通常指的ＤＮＡ限制性內(nèi)切酶.

它們能識(shí)別雙鏈ＤＮＡ的特異順序，并在這個(gè)順序內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的ＤＮＡ片段；Ⅱ型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應(yīng)的輔助因子，識(shí)別順序一般為４～６個(gè)堿基對(duì)的反轉(zhuǎn)重復(fù)順序；Ⅱ型內(nèi)切酶切割雙鏈ＤＮＡ產(chǎn)生３種不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。正是得益于限制性的內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，才使得人們能在體外有目的地對(duì)遺傳物質(zhì)ＤＮＡ進(jìn)行改造，從而極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)的興旺和發(fā)展。

限制性內(nèi)切酶的類型第七頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二粘性末端：是交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。如EcoRI的識(shí)別順序?yàn)椋?/p>

5’……G|AATTC……3’3’……CTTAA|G……5’在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置切割后生成

5’……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’各有一個(gè)單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過DNA連接酶的作用而“粘合”。第八頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二II型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如EcoRV的識(shí)別位置是：5’……GAT|ATC……3’3’……CTA|TAG……5’

切割后形成5’……GATATC……3’3’……CTATAG……5’這種末端同樣可以通過DNA連接酶連接起來。平頭末端：第九頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二用屬名的頭一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母表示寄主菌的物種名稱，如E.coli

用Eco表示，所以用斜體字。用一個(gè)字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilusinfluenzae)Rd菌株用d，即Hind。如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個(gè)不同的限制與修飾酶，則以羅馬數(shù)字表示，如HindⅠ,HindⅡ，HindⅢ等。

限制性核酸內(nèi)切酶的命名法第十頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)材料及儀器高速離心機(jī)，電爐，電泳儀，制膠槽，電泳槽，梳子，錐形瓶，量筒，移液槍，冰盒，槍頭，Ep管，手套，記號(hào)筆，TAE電泳緩沖液(10×)，瓊脂糖，溴化乙錠(EB)，質(zhì)粒DNA

第十一頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二

雙酶切無菌水0.8μL10x緩沖液2μL質(zhì)粒16μLBglI0.6μLSalII0.6μL共20μL按如下體系加入到0.5ml離心管中加體系離心37℃水浴1h跑電泳第十二頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二結(jié)果第十三頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二結(jié)果與分析

質(zhì)粒的雙酶切沒有出現(xiàn)結(jié)果但marker出了條帶說明膠沒有問題，而PCR的酶切產(chǎn)物出現(xiàn)了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。第十四頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二１．內(nèi)切酶：不應(yīng)混有其它雜蛋白特別是其它內(nèi)切酶或外切酶的污染；注意內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)及形成的粘性末端；內(nèi)切酶的用量：根據(jù)內(nèi)切酶單位和ＤＮＡ用量而定。同時(shí)內(nèi)切酶體積不能超過反應(yīng)體系１０％，因內(nèi)切酶中含５０％甘油，體系中甘油超過５％會(huì)抑制內(nèi)切酶活力；內(nèi)切酶操作應(yīng)在低溫下進(jìn)行（冰上）；使用時(shí)防止操作中對(duì)內(nèi)切酶的污染。五、注意事項(xiàng)——限制性內(nèi)切酶酶切第十五頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二連接反應(yīng)DNA分子的體外連接（重組）是指外源DNA片段和載體DNA分子在體外通過DNA連接酶共價(jià)連接。DNA酶切片段的聯(lián)接是兩DNA片段相鄰的5'磷酸和3'羥基間可由聯(lián)接酶催化形成磷酸二酯鍵，即能完成聯(lián)接反應(yīng)。第十六頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二連接體系10×Buffer2.5μL載體1μLDNA10μLT4酶1μL無菌水10.5μL共25μL第十七頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二內(nèi)切酶失活DNA不純，含有SDS，酚，EDTA等內(nèi)切酶抑制因子條件不適（試劑、溫度）DNA酶切位點(diǎn)上的堿基被甲基化DNA酶切位點(diǎn)上沒有甲基化（如DpnI）DNA位點(diǎn)上存在其它修飾DNA不存在該酶識(shí)別順序標(biāo)準(zhǔn)底物檢測酶活性將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA檢查反應(yīng)系統(tǒng)是否最佳換用對(duì)DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至dcm-，dam-基因型的細(xì)菌菌株換用不同切割非甲基化位點(diǎn)的同裂酶消化DNA（如San3AI代替DpnI)，重新將質(zhì)粒轉(zhuǎn)至dcm+dam+菌株中擴(kuò)增將DNA底物與λDAN混勻進(jìn)行切割驗(yàn)證換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進(jìn)行驗(yàn)證六、限制性內(nèi)切酶酶切常見問題分析問題一：DNA完全沒有被內(nèi)切酶切割原因?qū)Σ叩谑隧摚捕?，編輯?023年，星期二內(nèi)切酶活性下降內(nèi)切酶稀釋不正確DNA不純，反應(yīng)條件不佳內(nèi)切酶識(shí)別的DNA位點(diǎn)上的堿基被甲基化或存在其它修飾部分DNA溶液粘在管壁上內(nèi)切酶溶液粘度大，取樣不準(zhǔn)酶切后DNA粘末端退火由于反應(yīng)溶液、溫度、強(qiáng)烈振蕩使內(nèi)切酶變性過度稀釋使酶活性降低反應(yīng)條件不適識(shí)別位點(diǎn)兩側(cè)插入了可影響酶切效率的核酸順序用5-10倍量過量消化用酶貯藏液或反應(yīng)緩沖液稀釋酶同上同上反應(yīng)前離心數(shù)秒將內(nèi)切酶稀釋，增大取樣體積電泳前將樣品置65℃保溫5-