血液一般檢驗(yàn)-血涂片制備和染色課件

第二章血液一般檢驗(yàn)第一節(jié)血涂片制備和染色一.血涂片制備◆載玻片要求◆血涂片制備方法◆方法學(xué)評(píng)價(jià)◆質(zhì)量保證二.血涂片染色◆染料◆染色方法◆方法學(xué)評(píng)價(jià)◆質(zhì)量保證

本節(jié)內(nèi)容

新玻片上有游離堿質(zhì)，須清洗后使用。使用時(shí)切勿用手觸及玻片表面。一.血涂片的制備載玻片的要求手工涂片法厚血膜涂片法

自動(dòng)涂片法薄血膜推片法制備方法

血涂片的制備方法手工薄血涂片法取EDTA抗凝血滴血約50μl推片干燥30~45°兩玻片的角度以30-45°為宜，輕輕將雙凹片向前勻速推進(jìn)，即涂成血液薄膜。血涂片手工厚血涂片法全自動(dòng)推片染片機(jī)根據(jù)HCT可以設(shè)定8個(gè)水平的推片方案方法評(píng)價(jià)薄血膜推片法用血量少、操作簡單，臨床應(yīng)用最廣，主要用于觀察血細(xì)胞形態(tài)及儀器法檢測(cè)結(jié)果異常時(shí)的復(fù)查。某些抗凝劑可使血細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，分類時(shí)應(yīng)注意鑒別。白細(xì)胞減低患者的標(biāo)本經(jīng)離心后取棕黃層（有核細(xì)胞和血小板集中層）涂片，可提高異常細(xì)胞的陽性檢出率。厚血膜涂片法對(duì)瘧原蟲、微絲蚴等的陽性檢出率高。儀器自動(dòng)涂片法血涂片中細(xì)胞分布均勻、形態(tài)完好，且推片與染色可和血液分析儀構(gòu)成流水線作業(yè)，適用于大批量標(biāo)本的處理。但需要較高的投入。血涂片制備的方法學(xué)評(píng)價(jià)總體要求：血膜由厚到薄逐漸過度，應(yīng)厚薄適宜，頭、體、尾分明

良好血涂片的“標(biāo)準(zhǔn)”

①血膜至少長25mm，至玻片兩側(cè)邊緣的距離約為5mm。②血膜邊緣要比玻片邊緣窄，且邊緣光滑，適用于油鏡檢查。③血細(xì)胞從厚區(qū)到薄區(qū)逐步均勻分布，末端呈方形或羽毛狀。④血膜末端無粒狀、劃線或裂隙。⑤在鏡檢區(qū)域內(nèi)，白細(xì)胞形態(tài)應(yīng)無人為異常改變。⑥無人為污染。

血涂片制備的質(zhì)量保證瘧原蟲檢查血涂片要求

1）厚血膜：血量4.0～5.0μl，位于右1/3處，直徑0.8～1.0cm，外出圓形厚薄均勻，無劃痕。過厚易于脫落，過薄達(dá)不到檢出率的要求。2）薄血膜：血量1.0～1.5μl，位于1/2～1/3處，外觀舌狀厚薄均勻，無劃痕。血涂片制備的質(zhì)量保證◆涂片前：載玻片中性、潔凈、無油膩，邊緣無破碎。血液標(biāo)本推薦用非抗凝靜脈血或毛細(xì)管血，也可用EDTA抗凝靜脈血。標(biāo)本采集后4小時(shí)內(nèi)制片?！敉科校嚎刂坪醚瘟俊⑼破俣群徒嵌?。血滴越大、推片角度大、速度越快，血膜越厚◆涂片后：血涂片需及時(shí)干燥、固定，妥善保存。血涂片制備操作要求不良血涂片用力不均，厚薄不均刷尖，推片邊緣不光滑角度大,速度快,太厚,太短載玻片有油膩血量多，血滴未展開血滴展開不均勻玻片中間未干燥血涂片質(zhì)量問題原因不規(guī)則的間斷和尾部過長推片污染、推片速度不均勻、載玻片污染有空泡（空洞）載玻片被油脂污染血膜偏長或偏短推片角度小、血滴未完全展開即開始推片時(shí)血膜偏長；推片角度大、血滴太小時(shí)血膜偏短血膜無尾部血滴太大兩側(cè)無空隙推片太寬或血滴展開太寬血膜偏厚或偏薄血滴大、血液黏度高、推片角度大、推片速度快，血膜厚；相反則血膜偏薄血涂片質(zhì)量問題及可能的原因染料性質(zhì)常見品種作用堿性染料陽離子染料亞甲藍(lán)、天青、蘇木素細(xì)胞內(nèi)的酸性成分結(jié)合，用于細(xì)胞核染色酸性染料陰離子染料伊紅Y、伊紅B與細(xì)胞內(nèi)堿性成分結(jié)合并染色復(fù)合染料同時(shí)具有陰離子型、陽離子型的染料Wright染料、Giemsa染料細(xì)胞染色后可獲得紅藍(lán)分明、色澤艷麗的染色效果染料二.血涂片染色■瑞氏染色法（Wright’sstain）■吉姆薩染色法（Giemsa’sstain）■瑞氏-吉姆薩復(fù)合染色法染色方法瑞氏染液是瑞氏染料溶于甲醇而成。■細(xì)胞染色原理：物理吸附作用；

化學(xué)親和作用。■染色易受pH影響：偏酸環(huán)境染色偏紅，偏堿環(huán)境偏藍(lán)?！鋈鹗先旧ǎ╓right’sstain）瑞氏染料:酸性染料伊紅和堿性染料美藍(lán)組成的復(fù)合染料。Wright染色血細(xì)胞著色的原理

成分著色原理堿性物質(zhì)與伊紅結(jié)合染成紅色，該物質(zhì)稱為嗜酸性物質(zhì)，如血紅蛋白及嗜酸性顆粒等酸性物質(zhì)與亞甲藍(lán)結(jié)合而染成藍(lán)紫色，該物質(zhì)稱為嗜堿性物質(zhì)，如淋巴細(xì)胞胞質(zhì)及嗜堿性顆粒等中性顆粒呈等電狀態(tài)，與伊紅、亞甲藍(lán)均結(jié)合，染成淡紫紅色，該物質(zhì)稱為嗜中性物質(zhì)細(xì)胞核主要由DNA和堿性強(qiáng)的組蛋白等組成，后者與伊紅結(jié)合染成紅色，但因細(xì)胞核中含有少量的弱酸性物質(zhì)，與亞甲藍(lán)作用染成藍(lán)色，因含量太少，藍(lán)色反應(yīng)極弱，故細(xì)胞核染成紫紅色紅細(xì)胞①原始紅細(xì)胞和早幼紅細(xì)胞胞質(zhì)含有較多的酸性物質(zhì)，與亞甲藍(lán)親和力強(qiáng)，故染成較濃厚的藍(lán)色②晚幼紅細(xì)胞和Ret含有酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)，可同時(shí)與亞甲藍(lán)和伊紅結(jié)合，故染成紅藍(lán)色或灰紅色③成熟紅細(xì)胞的酸性物質(zhì)完全消失，只與伊紅結(jié)合，染成橙紅色用蠟筆在已干的血膜兩端劃線。瑞氏染液2～5滴，染0.5～1min。加等量或稍多的緩沖液，混勻，染10～15min。流水沖去染液，干后鏡檢。Wright染色步驟正常血膜外觀為淡紫紅色。鏡下RBC和嗜酸性顆粒染粉紅色，嗜堿性顆粒染紫黑色，中性顆粒染淡紫紅色，細(xì)胞核染紫紅色。Wright染色法染色結(jié)果血涂片的染色效果與血涂片中細(xì)胞數(shù)量、血膜厚度、染液質(zhì)量、染色時(shí)間、染液濃度、pH等密切相關(guān)，在染色的全過程（前、中、后）均需嚴(yán)格按要求操作，否則將導(dǎo)致染色效果不佳。

Wright染色法質(zhì)量保證■血涂片：血涂片血膜厚度、細(xì)胞數(shù)量要恰當(dāng)。血膜徹底干透后方可染色。

涂片后1小時(shí)內(nèi)染色?！鋈疽嘿|(zhì)量：染液放置時(shí)間越久，亞甲藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)?/p>

天青B越多，染色效果越好。Wright染色法質(zhì)量保證---染色前項(xiàng)目質(zhì)量保證時(shí)間與濃度染液濃度低、室溫低、細(xì)胞多、有核細(xì)胞多，則染色時(shí)間要長；反之，則染色時(shí)間要相應(yīng)短。染色過程血涂片應(yīng)水平放置；染液不能過少，以免蒸發(fā)后染料沉淀，不易沖洗掉，使細(xì)胞深染或胞漿中有大量堿性顆粒出現(xiàn)；加染料后可用洗耳球輕吹，讓染液覆蓋全部血膜；加緩沖液后要讓緩沖液和染液充分混勻，兩者比例約為（1～1.5）:1pH值偏酸或偏堿均可導(dǎo)致染色效果不佳沖洗染液①應(yīng)用流水將染液與緩沖液沖去，而不能先倒掉染液后再用流水沖洗，以免染料沉著于血涂片上，干擾檢查②水流不宜太快，水壓不宜太高，避免水流垂直沖到血膜上，而導(dǎo)致血膜脫落③沖洗時(shí)間不宜過長，以免脫色④沖洗后的血涂片應(yīng)立即立于玻片架上，防止血涂片被剩余水分浸泡脫色⑤若見血膜上有染料顆粒沉積，用甲醇或Wright染液溶解，但應(yīng)立即用水沖洗脫色與復(fù)染①染色過深：可用甲醇或Wright染液適當(dāng)脫色，也可用清水沖洗一定時(shí)間；②染色過淺：可以復(fù)染，復(fù)染時(shí)應(yīng)先加緩沖液，后加染液，或加染液與緩沖液的混合液，不可先加染液Wright染色法質(zhì)量保證---染色中評(píng)價(jià)方式染色良好特征肉眼觀察血膜外觀為淡紫紅色顯微鏡觀察細(xì)胞分布均勻，血細(xì)胞無人為形態(tài)改變，紅細(xì)胞呈淡粉紅色，白細(xì)胞胞質(zhì)能顯示各自特有的色彩，白細(xì)胞核呈紅色或紫紅色，核染色質(zhì)清晰可見，細(xì)胞內(nèi)外無或少見染料沉著血涂片染色良好特征

Wright染色法質(zhì)量保證---染色后

血涂片染色不佳的原因及糾正措施染色效果原因糾正措施染色偏藍(lán)血膜偏厚、染色時(shí)間長、沖洗用水的pH過高、沖洗時(shí)間過短、稀釋染液未用緩沖液、貯存的染液暴露于陽光下用含1%硼酸的95%乙醇溶液沖洗2次，再用中性蒸餾水沖洗，待干后鏡檢染色偏紅儲(chǔ)存染液質(zhì)量不佳、沖洗時(shí)間過長、沖洗用水的pH過低、血涂片干燥前加封片規(guī)范操作，使用中性蒸餾水，保證染液質(zhì)量染色偏淺染色時(shí)間偏短、沖洗時(shí)間過長復(fù)染染料沉積染料沉淀、染料陳舊、甲醇濃度偏低、染液未過濾、涂片被污染、溫度較高用甲醇沖洗2次，并立即用水沖掉甲醇，持干后復(fù)染藍(lán)色背景固定不當(dāng)、血涂片未固定而儲(chǔ)存過久、使用肝素抗凝劑注意血涂片的固定，使用EDTA抗凝劑Giemsa染色法■染色原理：與Wright染色法基本相同，Giemsa染色法加強(qiáng)了天青的作用，提高了噻嗪類染料的效果?！鲈噭篏iemsa染料1.0g;甘油66ml;甲醇66ml?！鋈旧?）標(biāo)記血涂片：用蠟筆在的血涂片一端編號(hào)。2）固定血膜：用甲醇固定3～5分鐘。3）血膜染色：將固定的血涂片置于被pH6.4～6.8磷酸鹽緩沖液稀釋10～20倍的Giemsa染液中，浸染10～30分鐘，取出后用流水沖洗，干燥后備用。Wright-Giemsa染色法在Wright染色過程中，以稀釋Giemsa染液代替緩沖液，或先用Wright染色法染色后，再用稀釋的Giemsa染液復(fù)染，或者在Wright染液配方的基礎(chǔ)上，每1.0gWright染料添加0.3gGiemsa染料，染色步驟同Wright染色法。

方法評(píng)價(jià)Wright染色法最常用的染色方法，染色時(shí)間短，對(duì)胞質(zhì)成分及中性顆粒等染色效果好，但對(duì)胞核的染色不如Giemsa染色法Giemsa染色法染色過程易控制，不易被污染，對(duì)胞核和寄生蟲等著色較好，結(jié)構(gòu)更清晰，而胞質(zhì)和中性顆粒著色較差，染色保存時(shí)間久，但染色時(shí)間長，價(jià)格高。Wright-Giemsa染色法對(duì)胞質(zhì)、顆粒、胞核均著色鮮艷，對(duì)比鮮明，但此法染液變性快、易污染，為臨床一般檢驗(yàn)次選方法血涂片染色的方法學(xué)評(píng)價(jià)第二節(jié)改良牛鮑血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)和使用

本節(jié)內(nèi)容

一.計(jì)數(shù)板結(jié)構(gòu)◆結(jié)構(gòu)◆區(qū)域劃分二.計(jì)數(shù)板使用

◆使用◆計(jì)數(shù)順序與原則◆質(zhì)量保證◆評(píng)價(jià)◆考核方法一、改良Neubauer計(jì)數(shù)板結(jié)構(gòu)計(jì)數(shù)板上下各一個(gè)計(jì)數(shù)池1mm1mm計(jì)數(shù)板結(jié)構(gòu)區(qū)域劃分二、計(jì)數(shù)板使用準(zhǔn)備計(jì)數(shù)扳稀釋血液充液靜置顯微鏡計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)原則“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”計(jì)數(shù)順序計(jì)數(shù)順序與原則計(jì)數(shù)板使用質(zhì)量保證1．計(jì)數(shù)板（1）計(jì)數(shù)板合格性鑒定

鑒定周期：每隔1年，要求計(jì)數(shù)室的玻面光滑、透明、劃線清晰，劃線面積準(zhǔn)確。1）蓋玻片檢查：包括厚度和平整度，要求蓋玻片應(yīng)具有一定的重量，平整、光滑、無裂痕，厚薄均勻一致。2）計(jì)數(shù)室深度：高度誤差應(yīng)在±2%（±2μm）以內(nèi)。3）計(jì)數(shù)室劃線：每個(gè)大方格邊長的誤差應(yīng)小于1%。1．計(jì)數(shù)板（2）保證計(jì)數(shù)板和蓋玻片清潔：防止計(jì)數(shù)板污染，致使充液時(shí)產(chǎn)生氣泡。如使用血液充液，計(jì)數(shù)板和蓋玻片使用后應(yīng)依次用95%（V/V）乙醇、蒸餾水棉球擦拭，最后用清潔紗布手揩凈。（3）加蓋玻片：WHO推薦采用推式法，以保證充液的高度為0.10mm。當(dāng)蓋玻片蓋在計(jì)數(shù)板上時(shí)，若兩層玻璃之間見到彩色條帶（Newton環(huán)），說明計(jì)數(shù)板和蓋玻片清潔良好。計(jì)數(shù)板使用質(zhì)量保證1．計(jì)數(shù)板2．充液

（1）平放計(jì)數(shù)板。充液前應(yīng)適當(dāng)用力、快速振蕩細(xì)胞懸液30秒，使其充分混勻，但不能產(chǎn)生過多氣泡，以免影響充液和準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，也要防止劇烈振蕩以免破壞細(xì)胞。（2）一次完成充液，如充液過少、過多、有氣泡或出現(xiàn)任何碎片，應(yīng)拭凈計(jì)數(shù)板及蓋玻片后重新操作。（3）充液后不能移動(dòng)蓋玻片。計(jì)數(shù)板使用質(zhì)量保證1．計(jì)數(shù)板3．靜置計(jì)數(shù)板白細(xì)胞和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)一般需沉淀2～3分鐘，血小板計(jì)數(shù)應(yīng)沉淀10～15分鐘，同時(shí)需注意保濕。（1）如果細(xì)胞嚴(yán)重分布不均，應(yīng)重新充液計(jì)數(shù)。如白細(xì)胞總數(shù)在正常范圍內(nèi)時(shí)，各大方格的細(xì)胞數(shù)不得相差8個(gè)以上。兩次重復(fù)計(jì)數(shù)誤差：白細(xì)胞不超過10%，紅細(xì)胞不超過5%。（2）計(jì)數(shù)原則

計(jì)數(shù)細(xì)胞時(shí)應(yīng)遵循計(jì)數(shù)原則，并注意與非細(xì)胞成分相區(qū)別。4．計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)板使用質(zhì)量保證1．計(jì)數(shù)板5．計(jì)數(shù)誤差（1）技術(shù)誤差（technicalerror）：由于操作不規(guī)范或使用器材不準(zhǔn)確造成的誤差稱為技術(shù)誤差。這類誤差通過主觀努力可以避免或顯著減小，屬系統(tǒng)誤差。（2）固有誤差（inherenterror）：包括計(jì)數(shù)域誤差、計(jì)數(shù)室誤差和吸管誤差。計(jì)數(shù)板使用質(zhì)量保證血細(xì)胞計(jì)數(shù)常見的技術(shù)誤差與原因1）計(jì)數(shù)域誤差（fielderror）：又稱分布誤差，屬于偶然誤差。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，血細(xì)胞在計(jì)數(shù)室內(nèi)分布的不均一性符合泊松分布：（m為細(xì)胞多次計(jì)數(shù)的均值）計(jì)數(shù)域誤差變異系數(shù)（CV）與細(xì)胞計(jì)數(shù)的數(shù)量成反比，細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)量越多，計(jì)數(shù)范圍越廣，誤差越??；反之，誤差越大計(jì)數(shù)板使用質(zhì)量保證2）計(jì)數(shù)室誤差和吸管誤差：同一稀釋血液采用多支吸管稀釋，在多個(gè)計(jì)數(shù)板內(nèi)計(jì)數(shù)，較同一稀釋液在同一計(jì)數(shù)板進(jìn)行多次計(jì)數(shù)所得的結(jié)果更接近真值。以白細(xì)胞計(jì)數(shù)為例，固有誤差總變異系數(shù)的計(jì)數(shù)公式為：nb：計(jì)數(shù)的白細(xì)胞總數(shù)，

nc：計(jì)數(shù)板使用次數(shù)，

np：吸管使用次數(shù)計(jì)數(shù)板使用質(zhì)量保證計(jì)數(shù)板使用評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：為WHO推薦的參考方法，設(shè)備簡單、費(fèi)用低廉、簡便易行，在嚴(yán)格規(guī)范條件下，可用于校準(zhǔn)血液分析儀及其結(jié)果異常的復(fù)查，多次重復(fù)（10-20次）測(cè)定的均值可作為校正血細(xì)胞分析儀的參考值。適用于日檢測(cè)量少的基層醫(yī)療單位和分散檢測(cè)。缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)，受吸血量和血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的質(zhì)量、細(xì)胞分布狀態(tài)以及檢驗(yàn)