實驗 細胞器的分級分離

實驗細胞器的分級分離第一頁，共十三頁，編輯于2023年，星期二[目的要求]1．掌握差速離心法和密度梯度離心法的原理。2．熟悉哺乳動物細胞的細胞核、線粒體分離和純化的實驗方法。第二頁，共十三頁，編輯于2023年，星期二[實驗原理]

球形顆粒的沉降速率取決于其密度、半徑、介質黏度和離心力。

差速離心法（differentialcentrifugation）是將細胞勻漿在密度均一的介質中從低速到高速離心，較大顆粒先在低速離心時沉淀，再用高速離心沉淀上清液中的小顆粒物質，從而達到逐級分離細胞器的目的。

密度梯度離心法（densitygradientcentrifugation）是一定介質形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，頂部的細胞勻漿在重力或離心力場的作用下分層、分離。

一般先通過差速離心法將細胞器初步分離，再進一步通過密度梯度離心法分離純化細胞器。第三頁，共十三頁，編輯于2023年，星期二

細胞器的分離常通過組織細胞勻漿、分級分離和分析三個步驟完成。

分級分離方法有兩種，即：差速離心法和密度梯度離心法。第四頁，共十三頁，編輯于2023年，星期二[實驗用品]1．器具：玻璃勻漿器、低速離心機、高速冷凍離心機、天平、普通光學顯微鏡、1.5mlEp管、載玻片、10ml滴管、冰盒、冰塊、濾網、染缸、20ml燒杯。2．材料：大白鼠。3．試劑：生理鹽水、PBS、0.25mol/L的蔗糖溶液、0.34mol/L蔗糖-0.5mmol/LMg(Ac)2溶液、0.88mol/L蔗糖-0.5mmol/LMg(Ac)2溶液、95％乙醇、甲基綠-派洛寧染液、丙酮、0.2％的詹納斯綠B。第五頁，共十三頁，編輯于2023年，星期二[實驗步驟]1．組織勻漿制備（1）取材將空腹12～24h的大鼠處死。剖開腹部，迅速取出肝臟，用預冷的生理鹽水洗凈血污，用濾紙吸干。（2）制備勻漿稱取約1～2g左右的肝組織，用預冷的0.25mol/L的蔗糖溶液沖洗數次，剪碎。以預冷的0.25mol/L的蔗糖溶液懸浮剪碎的組織，移入勻漿器內，在冰浴條件下勻漿。勻漿完成后，用濾網過濾，即制得肝細胞勻漿，備用。第六頁，共十三頁，編輯于2023年，星期二2.細胞器的分級分離(1)細胞核的分離：第一次:1000rpm,8min。(2)細胞核的純化在沉淀中加入0.34mo1/L蔗糖-0.5mmol/LMg(Ac)2至2ml，混懸。用長針頭注射器在混懸液下輕輕加入2ml的0.88mo1/L蔗糖-0.5mmol/LMg(Ac)2溶液。盡量使兩種溶液明顯分層。2000rpm離心8min。加0.25M蔗糖至4ml，混勻第二次:1300rpm,8min。棄上清上清保留于Ep管1.0處第七頁，共十三頁，編輯于2023年，星期二顯微鏡下觀察結果(3)細胞核鑒定：

。分色:快速放入丙酮中，蒸餾水漂洗，擦干水分固定：浸入95％的乙醇溶液5min，晾干染色：滴加甲基綠-派洛寧染液染色15min涂片：在離心后的沉淀中加入幾滴PBS，混勻后涂片，空氣干燥第八頁，共十三頁，編輯于2023年，星期二(4)線粒體的分離

將分離細胞核時收集的上清以10000g離心10min，將上清移入1.5mlEp管內待用。沉淀用0.25mol/L的蔗糖溶液重懸后，

10000g離心10min，取沉淀。

第九頁，共十三頁，編輯于2023年，星期二(2)線粒體的鑒定

于潔凈載玻片上滴1滴0.02％～1％的詹納斯綠B染液，用牙簽挑取線粒體沉淀均勻涂于染液中，染色5～10min，蓋上蓋玻片，鏡檢。第十頁，共十三頁，編輯于2023年，星期二[結果與分析

光學顯微鏡下觀察，細胞核經甲基綠-派洛寧染色，DNA呈藍綠色，核仁和胞質RNA呈紅色。觀察分析完整細胞核的數量及其比例。線粒體經詹納斯綠B染色呈亮綠色。第十一頁，共十三頁，編輯于2023年，星期二[注意事項]1．組織勻漿時，既要盡可能使細胞完全破碎，又要盡量快速。2．在細胞器分離過程中，所有操作應盡可能在1～4℃下進行。3．實驗過程應注意保持細胞器的完整性，避免操作過于劇烈。另線粒體進行的是活體染色，要求樣品制備好后盡快染色。第十二頁，共十三頁，編輯于2023年，星期二[作業(yè)與思考題]1．分別在高倍鏡和油鏡下觀察細胞