實驗三的酶切

實驗三的酶切第一頁，共十一頁，編輯于2023年，星期二實驗原理限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNA。第二頁，共十一頁，編輯于2023年，星期二限制性內(nèi)切酶酶分子識別位點切割位點限制作用是否需用ATPⅠ類三亞基雙功能酶二分非對稱至少在識別位點外1000bpYesⅡ類內(nèi)切酶與甲基化酶分子不在一起4-6bp,大多數(shù)為回文對稱結(jié)構(gòu)

在識別位點中或靠近識別位點無特異性NoⅢ類二亞基雙功能酶5-7

bp非對稱在識別位點下游24-26bpYes限制性內(nèi)切酶可分為三類第三頁，共十一頁，編輯于2023年，星期二Ⅱ類限制性內(nèi)切酶

Ⅱ類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切割,產(chǎn)生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3’)；有的切割位點在對稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端，如EcoRⅠ切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3'→5'…GAATTC…3'3'…CTTAA↑G…5'→3'…CTTAAG…5'

第四頁，共十一頁，編輯于2023年，星期二實驗材料和試劑實驗材料：玉米基因組DNA實驗試劑：BamHI酶及其酶切緩沖液：購買成品。SalI酶及其酶切緩沖液：購買成品。瓊脂糖(Agarose)：進口或國產(chǎn)的電泳用瓊脂糖均可。

第五頁，共十一頁，編輯于2023年，星期二實驗儀器恒溫水浴鍋第六頁，共十一頁，編輯于2023年，星期二用手指輕彈管壁使溶液混勻，使溶液集中在管底混勻反應體系后，37℃水浴保溫2-3h電泳檢測EP管編號實驗步驟反應體系20μL酶液

DNA15μLBamHⅠ1μLSalⅠ1μL10×BufferT3μL第七頁，共十一頁，編輯于2023年，星期二對質(zhì)粒DNA酶切反應

限制性內(nèi)切酶用量可按標準體系1μgDNA加1單位酶,消化1-2h。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應時間也要適當延長。第八頁，共十一頁，編輯于2023年，星期二電泳檢測示例第九頁，共十一頁，編輯于2023年，星期二實驗注意事項限制性內(nèi)切酶用量可按標準體系1μgDNA加1單位酶，消化1-2h。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應時間也要適當延長。酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶反應。許多實驗制備的DNA不易于降解，需適當增加酶的使用量。反應液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應。市場銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時可事先用酶反應緩沖液（1×）進行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實驗中，應將反應液中甘油濃度控制在1/10之下，否則酶活性將受影響。

第十頁，共十一頁，編輯于2023年，星期二思考題