常規(guī)PCR實驗演示文稿

常規(guī)PCR實驗演示文稿當前第1頁\共有33頁\編于星期六\6點掌握：1、PCR的基本操作方法。2、瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的基本原理和方法。理解：1、PCR儀的使用方法。了解：1、PCR體外擴增的原理及其引物設計原則。2、擴增過程中各因素對擴增結果的影響。教學目的：當前第2頁\共有33頁\編于星期六\6點1、PCR反應體系的建立。2、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。教學重點：教學難點：

1、PCR反應程序的設計方法。當前第3頁\共有33頁\編于星期六\6點一、基本原理聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，PCR）：體外DNA酶促擴增技術，能特異高效地在體外擴增目的DNA片段。當前第4頁\共有33頁\編于星期六\6點PCR反應的基本步驟變性94?C雙鏈DNA模板被加熱變性成兩條單鏈退火45~60?C（Tm-5?C）寡聚核苷酸引物按堿基互補配對原則與單鏈模板DNA特異結合延伸72?CDNA聚合酶作用下，以引物為起始，合成與模板DNA互補的新鏈當前第5頁\共有33頁\編于星期六\6點Cycle255555Primer15Primer2Cycle155TemplateDNAPCR技術的工作原理55555555當前第6頁\共有33頁\編于星期六\6點Cycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。當前第7頁\共有33頁\編于星期六\6點瓊脂糖凝膠電泳原理把DNA樣品加入到瓊脂糖凝膠的樣品孔中，并置于靜電場上。由于DNA分子的雙螺旋骨架兩側帶有含負電荷的磷酸根殘基，因此在電場中向正極移動。具有不同的相對分子質量的DNA片段泳動速度不一樣，因而可依據DNA分子的大小來使其分離。在電泳前向凝膠或樣品中預加示蹤染料，電泳過程中染料同DNA結合，電泳后在紫外光照射下，可觀察到熒光，從而對分離的DNA進行檢測。當前第8頁\共有33頁\編于星期六\6點二、操作步驟當前第9頁\共有33頁\編于星期六\6點模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶(如Taq酶)dNTPs反應緩沖液（含Mg2+）PCR反應的基本組分當前第10頁\共有33頁\編于星期六\6點10×PCR緩沖液（Mg2+

Plus）

5μldNTP混合物（2.5mM）

4μl上游引物（10μM）

2μl

下游引物（10μM）

2μlDNA模板

4μlTaqDNA聚合酶（2.5U/μl）

1μl去離子水

32μl實驗步驟一：PCR反應體系的建立（重點）50μl2345671加樣順序當前第11頁\共有33頁\編于星期六\6點PCR反應程序的設計（難點）預變性：94℃5min

變性：94℃30sec

退火：55℃30sec

延伸：72℃40sec(60sec)

最終延伸：72℃5min

保存：4℃forever25cycles實驗步驟二：PCR反應程序的設計當前第12頁\共有33頁\編于星期六\6點PCR程序設計的主要因素循環(huán)溫度和時間Tm的概念：在雙鏈DNA解鏈過程中，紫外吸光度的變化ΔA260達到最大變化值的一般時所對應的溫度。Tm計算方法堿基數小于20：Tm=4×(GC%)+2×(AT%)堿基數大于20：Tm=81.5+0.41×(GC%)–

(675/引物長度)當前第13頁\共有33頁\編于星期六\6點主要實驗儀器PCR儀當前第14頁\共有33頁\編于星期六\6點主要實驗儀器PCR儀當前第15頁\共有33頁\編于星期六\6點實驗步驟三：結果檢測瓊脂糖電泳檢測PCR產物1.試劑：50×TAE電泳緩沖液：Tris242g，乙酸57.1ml，0.5mol/LEDTA（pH8.0）100ml，定容至1L，高壓滅菌后備用。1×TAE電泳緩沖液：20ml50×TAE電泳緩沖液加入雙蒸水，定容至1L。2.1％瓊脂糖凝膠的配制：100mlTAE電泳緩沖液中加入1g瓊脂糖，搖勻后放入微波爐中，小火加熱幾分鐘至溶液透明位置，取出后冷卻至56℃左右時，加入微量（3.5μL）的EB（溴化乙錠），混勻后倒入槽中，冷卻后待用。當前第16頁\共有33頁\編于星期六\6點不同類型瓊脂糖分離DNA片段大小的范圍瓊脂糖/％標準高強度低熔點0.30.5700bp～25kb0.8500bp～15kb800bp～10kb800bp～10kb1.0250bp～12kb400bp～8kb400bp～8kb1.2150bp～6kb300bp～7kb300bp~7kb1.580bp~4kb200bp~4kb200bp~4kb當前第17頁\共有33頁\編于星期六\6點3.上樣反應結束后取5μL反應產物，加入1μL上樣緩沖液（6×loadingbuffer），用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

指示劑：溴酚藍Marker：DL2000。注意：

加樣孔位于負極，DNA由負極向正極泳動40~60°當前第18頁\共有33頁\編于星期六\6點4.電泳電泳100V，10min左右。5.觀察凝膠成像系統(tǒng)或紫外燈下觀察結果（手套拿取凝膠）當前第19頁\共有33頁\編于星期六\6點三、注意事項1、注意移液槍的正確使用方法。2、按順序逐一加入PCR反應體系各組分，切勿遺漏。3、取用各組分時，應避免污染和貼槍頭壁損失。4、按操作步驟正確設置使用PCR儀。5、帶手套操作實驗。當前第20頁\共有33頁\編于星期六\6點四、影響PCR反應的因素1、模板任何來源的各種構型的含量極低的DNA樣品都可作PCR的模板。

輕微的污染都會影響PCR的最終結果。2、脫氧核苷三磷酸（dNTPs）

4種dNTP在反應中濃度應相等，過高會抑制Taq酶活性，增加錯配的幾率。

當前第21頁\共有33頁\編于星期六\6點3、引物(引物的好壞是整個PCR反應的關鍵)引物濃度一般為0.1～0.5mmol/L，濃度太高，會增加非特異性擴增，形成引物二聚體；濃度太低，影響擴增效率和產率。*引物設計的原則長度15

～

30bpGC含量45

～

55%兩條引物退火溫度一致或接近，Tm差值小于5℃無連續(xù)核苷酸引物內部及引物間無互補，以免形成發(fā)夾結構和引物二聚體當前第22頁\共有33頁\編于星期六\6點特異性的引物：特異性的產物當前第23頁\共有33頁\編于星期六\6點4、Mg2+濃度Mg2+是DNA聚合酶發(fā)揮作用的必須成分；最適濃度一般為0.5-2.5mmol/L,濃度過低則無法啟動反應，過高則影響產物特異性。

當前第24頁\共有33頁\編于星期六\6點5、TaqDNA聚合酶

具有5’→3’DNA聚合活性外，還具有5’→3’DNA外切活性。因此，在某些時候可選擇具有校讀活性的聚合酶例如Pfu；可以根據需要選擇擴增長片段的Taq酶，高速擴增的Taq酶等反應終濃度以2～2.5U/100μl為最佳當前第25頁\共有33頁\編于星期六\6點五、問題分析當前第26頁\共有33頁\編于星期六\6點問題1：無擴增產物現象：正對照有條帶，而樣品則無M樣品A樣品B正對照當前第27頁\共有33頁\編于星期六\6點純度：含有抑制物濃度：含量低質量：全長結構：二級結構

原因對策純化模板或者使用優(yōu)質試劑盒提取模板DNA加大模板的用量用好的反轉錄酶用溫度高的反轉錄酶(1)無擴增產物之模板原因當前第28頁\共有33頁\編于星期六\6點引物錯誤引物設計不好引物降解引物合成、純化不好

原因對策合成前檢查評價、重新設計引物換一管新引物免費重新合成(2)無擴增產物之引物原因當前第29頁\共有33頁\編于星期六\6點退火溫度延伸時間循環(huán)次數

原因對策遞度PCR聚合酶的延伸速度適當增加循環(huán)數(3)無擴增產物之PCR條件原因當前第30頁\共有33頁\編于星期六\6點

現象：條帶與預計的大小不一致或者非特異性擴增帶問題2：非特異性擴增M12當前第31頁\共有33頁\編于星期六\6點引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數過多

原因對策重新設計引物或者使用巢式PC