第八章分光光度法課件

§8-1概述

光度分析是利用物質(zhì)對光具有選擇性吸收的性質(zhì)來進行分析的方法。第八章光度分析法

光度分析

比較有色物質(zhì)溶液顏色深淺確定物質(zhì)含量的分析方法目視比色法利用分光光度計測定物質(zhì)對光的吸收強度確定物質(zhì)含量的分析方法比色分析分光光度法常用方法分：可見、紅外、

紫外、熒光等

待測組分有色溶液

一、目視比色法——準確度不高的常規(guī)分析法配制不同濃度的標準系列溶液用同種材料，大小、形狀相同的比色管盛裝C2C3C4C5CXC1色階進行目視比色法確定含量分光光度法的特點：（1）靈敏度高：1～10-3％微量分析，甚至達10-4～10-5％痕量（2）準確度高：比色相對誤差5～20％，分光光度2～5％，一般不超過6％（3）應(yīng)用廣泛：幾乎所有的無機離子和許多有機化合物（4）操作簡便，快速，儀器設(shè)備不復(fù)雜二、分光光度法§8.2物質(zhì)對光的選擇性吸收波粒關(guān)系：一、光的基本性質(zhì)光是一種電磁波，同時具有波動性和微粒性。光按波長分λE小紫外10～380nmE大可見380～760nm↓紅外760～3000nm由能量和波長相同的光所組成的.（波長相同的光）光按組成分單色光復(fù)合光由能量和波長不同的光所組成的光子流例如白光，由400～780nm各種能量和波長光所組成只有一種顏色有多種顏色的光復(fù)合白光棱鏡色散對角線的光互補物質(zhì)對光的選擇性吸收

看見的是透射光的顏色（眼睛所觀察到的）吸收的光不被看見∴透射光——吸收光（互補色光）白光入射反射反射光很小吸收散射均勻溶液可忽略透射刺激人眼而使人感覺到顏色的存在均勻溶液物質(zhì)呈現(xiàn)顏色與吸收光顏色的互補關(guān)系物質(zhì)呈顏色吸收光顏色波長/nm黃綠黃橙紅紅紫紫藍綠藍藍綠紫藍綠藍綠黃綠黃橙紅380～435435～480480～500500～560560～580580～595595～650650～780物質(zhì)呈現(xiàn)不同的顏色是由于物質(zhì)對不同波長的光具有選擇性吸收而產(chǎn)生的.

三、光吸收曲線將不同波長的單色光照射某一物質(zhì)，測定吸光度，以波長為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制曲線，光吸收曲線.可描述物質(zhì)對不同波長光的吸收能力。吸收曲線的討論：圖8-1吸收曲線①A最大處所對應(yīng)的波長為最大吸收波長（λmax）②λmax不隨濃度的變化而變化③同一種物質(zhì)不同濃度的吸收曲線形狀似。λmax不同物質(zhì)對不同波長的光具有不同的吸收程度（光的選擇吸收）奠定了定性分析基礎(chǔ)在一定的實驗條件下，濃度越大吸光度越大。奠定了定量分析基礎(chǔ)ABAAC增大最大波長處吸光度差最大，測定靈敏度最大§8.3光的吸收定律

一、朗伯—比耳定律1.朗伯定律：當一束平行單色光通過濃度c一定，均勻的非散射性溶液時，該溶液對光的吸收程度(A)與液層厚度b成正比2.比耳定律：當一束單色光通過液層厚度b一定的均勻的非散射性時，該溶液對光的吸收程度(A)與溶液中吸光物質(zhì)的濃度c成正比加合起來

入射光I0透射光I吸光度透光率

物理定義：當一束平行單色光通過均勻的、非散射性溶液時，溶液對光的吸收程度與吸光物質(zhì)的濃度c和液層厚度b的乘積成正比。

3.朗伯－比耳定律（1）表達式中的K為比例常數(shù)，與溫度、λ、有色溶液的性質(zhì)等有關(guān)；（2）朗伯比耳定律適用于紫外、紅外、可見光區(qū)；也適用于溶液及任何均勻的、非散射的吸光物質(zhì)；說明（4）濃度c的單位為mol·L-1，則K=ε

ε：摩爾吸光系數(shù)，L/（mol·cm）

ε與a的關(guān)系：ε=aM（3）濃度c的單位為g·L-1，則K=aa：吸光系數(shù)，L/（g·cm）

（5）ε是吸光物質(zhì)在一定條件下，一定λ和溶劑情況下的特征常數(shù)。在λmax處的ε最大以εmax表示。ε隨λ而變化。（6）同一物質(zhì)與不同顯色劑生成不同的顯色化合物，具有不同的ε。

ε越大，表示該有色物質(zhì)對入射光的吸收能力越強，顯色反應(yīng)越靈敏（ε≥6×104）。（7）光度分析的一般步驟配標準系列→做吸收曲線，確定λmax→做標準曲線（工作曲線）→測定未知樣，數(shù)據(jù)處理強吸收ε＞

104

。弱吸收ε

＜102中強吸收ε=102～

104

λ一定（λmax作為入射波長），b一定，改變標準樣的濃度c，測得相應(yīng)的A，做A與c的關(guān)系曲線，目的：據(jù)未知樣的A未確定c未。ACA（8）吸收曲線（A-λ）：（9）標準（工作）曲線（A-c）：c一定，b一定，改變波長λ，測得相應(yīng)的A，做A與λ的關(guān)系曲線，目的：確定λmax。A未c未λmax標準曲線做圖過程中，濃度C單位經(jīng)常用ug/mL,mg/mL,ug/50mL,mg/50mL表示

c未單位與之對應(yīng)。樣品的濃度根據(jù)稀釋倍數(shù)和要求進行計算。1.定義：產(chǎn)生0.001的吸光度時，單位截面積（cm2）的光程內(nèi)所含吸光物質(zhì)的微克數(shù)，單位μg/cm2。

2.公式：A=0.001=abc

bc=0.001/ac的單位g/L，即106μg/1000cm3b的單位cm,bc就是單位截面積(cm2)光程內(nèi)吸光物質(zhì)的微克數(shù)

S=bc·106/1000=bc·103S=1/a

ε=aM

S=M/εε越大，S越小，靈敏度越高。二、桑德爾靈敏度三、偏離比爾定律的原因：理想狀態(tài)下，當波長和強度一定的入射光通過液層厚度一定的有色溶液時，A∝c。正常正偏負偏CCX0AXA

2.化學因素：高濃度時，粒子間有相互作用力，不能獨立存在，使吸光能力發(fā)生改變，光度測量宜在較稀溶液中進行（一般小于0.01mol·L-1）

1.非單色光：嚴格講朗伯—比爾定律只適用于具有一定波長的單色光，但實際上單色器提供的波長范圍比較窄的光帶。

3.工作曲線不過原點存在系統(tǒng)誤差：吸收池不完全一樣（同厚度比色皿之間的透光率相差應(yīng)少于0.5%）；參比溶液選擇不當?shù)萈216例1：Fe2+濃度為5mg/L的溶液1mL，與鄰二氮菲顯色后，定容為10mL。該絡(luò)合物在波長580nm，比色皿厚度為2cm時，測得A=0.190。計算ε。

解P291.習題2濃度為25.5ug/50ml的Cu2+溶液，用雙環(huán)己酮草酰二蹤顯色后測定。在λ=600nm處用2cm比色皿測得A=0.300，求透光率T，吸光系數(shù)a，摩爾吸光系數(shù)ε（已知銅的摩爾質(zhì)量為63.55g）解：A=-㏒T=kbcT=10-A=10-0.300=50.1%1、有一符合朗伯－比爾定律的有色溶液，當先選用1cm比色皿時測得透光率為0.50,若選用2cm比色皿時透光率為___

___。

0.252、符合朗伯-比爾定律的有色溶液，當有色物質(zhì)的濃度增大時，其最大吸收波長

，透光率

。(填：增大，減小或不變)

不變

減少3、桑德爾靈敏度(S)單位是

,數(shù)值上S=μg/cm2

M/ε4、某顯色配合物的摩爾吸光系數(shù)

值很大，則表明------------------------------------------()(A)該物質(zhì)的濃度很高

(B)該物質(zhì)對某波長的光吸收能力很強(C)測定該物質(zhì)的靈敏度很高

(D)測定該物質(zhì)的準確度高C

5.以下說法錯誤的是--------------------------------------------------------------------------------(）(A)吸光度A與濃度呈直線關(guān)系

(B)透光率隨濃度的增大而減小

(C)當T為“0”時吸光度值為∞

(D)最大吸收波長隨濃度變化而變化

D

（4）濃度c的單位為mol·L-1，則K=ε

ε：摩爾吸光系數(shù)，L/（mol·cm）

ε與a的關(guān)系：ε=aM（3）濃度c的單位為g·L-1，則K=aa：吸光系數(shù)，L/（g·cm）

（5）ε是吸光物質(zhì)在一定條件下，一定λ和溶劑情況下的特征常數(shù)。在λmax處的ε最大以εmax表示。ε隨λ而變化。（6）同一物質(zhì)與不同顯色劑生成不同的顯色化合物，具有不同的ε。

ε越大，表示該有色物質(zhì)對入射光的吸收能力越強，顯色反應(yīng)越靈敏（ε≥6×104）。AλmaxA最大

λ一定（λmax作為入射波長），b一定，改變標準樣的濃度c，測得相應(yīng)的A，做A與c的關(guān)系曲線，目的：據(jù)未知樣的A未確定c未。ACA（8）吸收曲線（A-λ）（做法）（9）標準（工作）曲線（A-c）：c一定，b一定，改變波長λ，測得相應(yīng)的A，做A與λ的關(guān)系曲線，目的：確定λmax。A未c未λmax標準曲線做圖過程中，濃度C單位經(jīng)常用ug/mL,mg/mL,ug/50mL,mg/50mL表示

c未單位與之對應(yīng)。樣品的濃度根據(jù)稀釋倍數(shù)和要求進行計算。定義：產(chǎn)生0.001的吸光度時，單位截面積（cm2）的光程內(nèi)所含吸光物質(zhì)的微克數(shù)，單位μg/cm2。

S=1/a

ε=aM

S=M/εε越大，S越小，靈敏度越高。桑德爾靈敏度三、偏離比爾定律的原因：理想狀態(tài)下，當波長和強度一定的入射光通過液層厚度一定的有色溶液時，A∝c。正常正偏負偏CCX0AXA

2.化學因素：高濃度時，粒子間有相互作用力，不能獨立存在，使吸光能力發(fā)生改變，光度測量宜在較稀溶液中進行（一般小于0.01mol·L-1）

1.非單色光：嚴格講朗伯—比爾定律只適用于具有一定波長的單色光，但實際上單色器提供的波長范圍比較窄的光帶。

3.工作曲線不過原點存在系統(tǒng)誤差：吸收池不完全一樣（同厚度比色皿之間的透光率相差應(yīng)少于0.5%）；參比溶液選擇不當?shù)取?.4吸光度的測量

一、分光光度計的基本組成顯示儀表或記錄儀光源單色器樣品室檢測器1．光源在整個可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在320～2500nm。2．單色器將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光的光學系統(tǒng)。

①入射狹縫：光源的光由此進入單色器；

②準光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；

③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；

⑤出射狹縫。

3.樣品室樣品室（放置吸收池和相應(yīng)的池架）。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池.大多數(shù)比色皿為長方形，也有圓柱形的。一般厚度為0.5、1、2和3厘米。4.檢測器利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。近代的儀器型號

方法儀器單色器檢測器型號分光光度法分光光度計玻璃棱鏡硒光電池72型石英棱鏡光電管721石英棱鏡光電倍增751光柵光電倍增710，7305.顯示儀表和記錄儀檢流計、數(shù)字顯示、微機進行儀器自動控制和結(jié)果處理。顯示A與T的讀數(shù)二、測量條件的選擇1.入射光波長的選擇

（1）吸收曲線Amax處λmax靈敏度高，對比耳定律偏離較?。?）若λmax不在儀器可測內(nèi)或干擾物在λmax有強烈吸收，可選次峰值處的λ，即ε不易改變的λ。

λmaxA次峰對于一臺給定的儀器，吸光度A與透光率T讀數(shù)誤差是儀器誤差的主要來源2.吸光度測量范圍的選擇

已知T=10-εbcT與C對應(yīng)作圖TΔTΔTΔTΔC1ΔC2ΔC2100500CΔT一定時，T越大ΔC越小T越大有色溶液濃度越稀，對應(yīng)C越小大

相對誤差大T越小ΔC越大，有色溶液濃度越大，即C越大大

由朗伯——比爾定律一般儀器透光率的±0.2～±2%相對誤差=T的讀數(shù)誤差（定）推導(dǎo)：今假定△T=0.5%，則用上式算出下表濃度相對誤差濃度相對誤差透光度T/%吸光度A

透光度T/%吸光度A950.022（±）10.2

400.3991.36900.0465.3

300.5231.38800.0972.8

200.6991.55700.1552.0

101.0002.17600.2221.63

31.5234.75500.3011.44

21.6996.38⊿C/C(%)T(%)2036.8650.2A0.70.434

★一般選擇A=0.2～0.7（T為20％～65％）的吸光度測量范圍，在A=0.434（T=36.8％）時，測量的相對誤差最小。如果不在此范圍，根據(jù)A=εbc，改變b及c，使A處于要求范圍內(nèi)。

A總=A待測物+A顯色劑+A溶劑+A輔+A比色皿參比溶液調(diào)A=0，T=100%

A=A待測物=εbc3.選擇適當?shù)膮⒈热芤捍郎y組分、過量顯色劑、溶劑、其它輔助試劑、比色皿等因素影響待測組分透光度或吸光度的測量吸光度具有加合性

⑵若顯色劑或其它所加試劑在測定波長處略有吸收，而試液本身無吸收，用“試劑空白”(不加試樣溶液)作參比溶液；參比溶液的選擇一般遵循以下原則：⑴若僅待測組分與顯色劑反應(yīng)產(chǎn)物在測定波長處有吸收，其它所加試劑均無吸收，用純?nèi)軇ㄋ?作參比溶液；⑷若顯色劑、試液中其它組分在測量波長處有吸收，則可在試液中加入適當掩蔽劑將待測組分掩蔽后再加顯色劑，作為參比溶液。⑶若待測試液在測定波長處有吸收，而顯色劑等無吸收，則可用“試樣空白”(不加顯色劑)作參比溶液；§8.5顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇

一、顯色反應(yīng)

pH=2～9橘紅色lgK穩(wěn)=21.3

ε=1.1×104λmax=510nm同一種被測物質(zhì)組分可能和多種顯色劑反應(yīng)，生成不同的有色物質(zhì)，因此顯色反應(yīng)的選擇要考慮以下因素：1.靈敏度：高，ε≥6x104的顯色反應(yīng)2.選擇性：好，顯色劑僅與一種組分發(fā)生顯色反應(yīng)（特效顯色劑）或與少數(shù)幾種組分發(fā)生顯色反應(yīng)3.對比度：大，絡(luò)合物的最大吸收波長與顯色劑的最大吸收波長之差⊿λmax大。4.MR組成：恒定，化學性質(zhì)穩(wěn)定，保證測量中吸光度基本不變，否則影響A的再現(xiàn)性。二、顯色反應(yīng)的選擇（一）反應(yīng)體系的酸度：靠實驗來確定合適的酸度AbpHa固定待測組分及顯色劑濃度，改變?nèi)芤簆H值測A，作A-pH圖，三、顯色反應(yīng)條件的選擇方法取平坦曲線下的pH值為測定此組分的最佳pH。

（二）顯色劑用量：固定其他條件，只改變R的用量，然后測定A，以A-CR作圖0CRbaaA③①②靠實驗來確定合適的顯色劑用量方法（三）其他因素：溫度時間溶劑共存離子的影響靠實驗來確定合適的§8.6差示分光光度法和光度分析法的應(yīng)用一、差示分光光度法普通分光光度法一般只適于測定微量組分，當待測液的濃度過大或過低，測量誤差都較大。1.定義：用采用濃度稍低于（高于）待測溶液濃度的標準溶液作參比溶液代替普通光度法中以試劑空白作參比測量吸光度的方法2.優(yōu)點：改善普通分光光度法的測量誤差提高測量的靈敏度3.分類：根據(jù)參比溶液，分為濃溶液差示法、稀溶液差示法和高精密度差示法A=0.2～0.7（T為20％～65％）A=0.434T=36.8%濃溶液示差吸光光度法應(yīng)用更廣泛

測c2：A相對=εbc相對=εb（c2-c1）4.濃溶液差示法原理：設(shè)有兩個有色溶液c1<c2T1>T2（1）普通光度法：測c1：A1=εbc1測c2：A2=εbc2（2）差示光度法：c1為參比，調(diào)A=0T=100%空白為參比，調(diào)A=0，T=100%或ΔA=εbΔc=εb（c2-c1）A>0.7或T<20%,測量誤差太大普通光度法差示光度法c2c1T2=5%T1=10%T2′=50%T1′=100%c2:T2=5%A2=1.301c1:T1=10%

A1=1.000

落在測量誤差較大

的范圍c1作參比，調(diào)T1′=100%A1’=0,放大T2T2′=50%A2’=0.301

落在測量誤差較

小

的范圍T=100%

ΔA=εbΔc=εb（c2-c1）測定值待測標準一元弱酸：c=[HB]+[B]

二、弱酸、弱堿離解常數(shù)的測定A=εHB·b·[HB]+εB·b·[B]AB=εB·b·cAHB=εHB·b·c已知pH,AHB,AB,A,可計算pKa酸全以HB存在時測定酸全以B存在時測定一定pH下，HB和B共存時，測定A需知公式:A=abcε=Ma

S=M/ε例:鐵（Ⅱ）濃度為5.0×10-4g·L-1

的溶液，與鄰二氮菲反應(yīng)，生成橙紅色配合物。該配合物在波長508nm，比色皿厚度為2cm時，測得A=0.190。計算鄰二氮菲鐵的a、ε及S。S=M/ε=55.85/(1.1×104)=5.0×10-3μg·cm-2解：先求a，再求ε。已知M(Fe)=55.85

a=A/bc

=0.190/(2×5.0×10-4)=190L·g