提取及常見問題分析

（優(yōu)選）提取及常見問題分析當前第1頁\共有27頁\編于星期日\1點第二部分：DNA提取方法簡介第三部分：DNA提取常見問題、原因分析及其對策內(nèi)容第一部分：前言當前第2頁\共有27頁\編于星期日\1點

核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學研究的主要對象，因此核酸的提取是分子生物學實驗技術(shù)中最重要、最基本的操作。前言當前第3頁\共有27頁\編于星期日\1點第二部分：DNA提取方法簡介當前第4頁\共有27頁\編于星期日\1點DNA提取的幾種方法基因組DNA的提取CTAB法SDS法其它

線粒體、葉綠體DNA的提取

差速離心結(jié)合SDS裂解法當前第5頁\共有27頁\編于星期日\1點基因組DNA－CTAB法

CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復合物。該復合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。注：CTAB溶液在低于15℃時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預熱。當前第6頁\共有27頁\編于星期日\1點

CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巰基乙醇終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除基因組DNA－CTAB法當前第7頁\共有27頁\編于星期日\1點

CTAB提取緩沖液的改進配方組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巰基乙醇終濃度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡合物，能與多酚形成一種不溶的絡合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖?；蚪MDNA－CTAB法當前第8頁\共有27頁\編于星期日\1點

CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－CTAB法當前第9頁\共有27頁\編于星期日\1點

SDS法原理基因組DNA－SDS法SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰浴），使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS終濃度10mM20mM0.4M2%

SDS法DNA提取緩沖液當前第10頁\共有27頁\編于星期日\1點SDS法流程圖

（以動物組織為例）

動物組織細胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－SDS法當前第11頁\共有27頁\編于星期日\1點基因組DNA－其它方法物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法化學方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法生物方式：酶法

根據(jù)細胞裂解方式的不同有：當前第12頁\共有27頁\編于星期日\1點基因組DNA－其它方法吸附材料結(jié)合法：

根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：硅質(zhì)材料

陰離子交換樹脂磁珠

高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫?？旖莞咝?。低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實驗。磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的物，從而達到分離目的。當前第13頁\共有27頁\編于星期日\1點基因組DNA－其它方法濃鹽法：

有機溶劑抽提法：

密度梯度離心法：

利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物當前第14頁\共有27頁\編于星期日\1點細胞器DNA－差速離心法差速離心法原理是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細胞器，自身可編碼蛋白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細胞內(nèi)各種組分分級分離出來。當前第15頁\共有27頁\編于星期日\1點第二部分：DNA提取常見問題、原因分析及其對策第三部分：DNA提取常見問題、原因分析及其對策當前第16頁\共有27頁\編于星期日\1點DNA提取的基本步驟I.材料準備II.破碎細胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中當前第17頁\共有27頁\編于星期日\1點材料準備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細胞（白細胞）組培細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取當前第18頁\共有27頁\編于星期日\1點細胞裂解材料應適量，過多會影響裂解，導致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當?shù)牧呀忸A處理方式：植物材料－－液氮研磨動物組織－－勻漿或液氮研磨組培細胞－－蛋白酶K細菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩基因組DNA的提取當前第19頁\共有27頁\編于星期日\1點核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應提供相應的緩沖體系采用有機（酚/氯仿）抽提時應充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應保證一定的轉(zhuǎn)速和時間針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應的去雜質(zhì)的方法基因組DNA的提取當前第20頁\共有27頁\編于星期日\1點核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理當前第21頁\共有27頁\編于星期日\1點多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。核酸分離、純化當前第22頁\共有27頁\編于星期日\1點多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：β-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合核酸分離、純化鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌當前第23頁\共有27頁\編于星期日\1點核酸沉淀、溶解當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解

基因組DNA的提取當前第24頁\共有27頁\編于星期日\1點DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見前）重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應。

原因?qū)Σ弋斍暗?5頁\共有27頁\編于星期日\1點材料不新鮮或反復凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷外源核酸酶污染反復凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量細胞裂解后的后續(xù)操作應盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復凍融DNA提取常見問題問題二：DNA降解。對策

原因當前第26頁\共有27頁\編于星期日\1點實