電泳和電色譜演示文稿

電泳和電色譜演示文稿當(dāng)前第1頁\共有87頁\編于星期六\11點優(yōu)選電泳和電色譜當(dāng)前第2頁\共有87頁\編于星期六\11點電泳的基本原理

帶電的膠?；虼蠓肿釉谕饧与妶鲋?，向帶相反電荷的電極作定向移動的現(xiàn)象稱為電泳。生物分子都帶電荷，其電荷的多少取決于分子性質(zhì)及其所在介質(zhì)的pH及其組成。由于混合物中各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量以及分子量的不同，在同一電場的作用下，各組分泳動的方向和速度也各異。因此，在一定時間內(nèi)各組分移動的距離不同，從而達(dá)到分離鑒定各組分的目的。當(dāng)前第3頁\共有87頁\編于星期六\11點在電場中，推動帶電質(zhì)點運動的力（F）等于質(zhì)點所帶凈電荷量（Q）與電場強度（X）的乘積。F＝QX

質(zhì)點的前移同樣要受到阻力（f

）的影響，對于一個球形質(zhì)點，服從Stoke定律，即：f

＝6πrην（r為質(zhì)點半徑，η為介質(zhì)粘滯系數(shù)，ν為質(zhì)點移動速度）當(dāng)前第4頁\共有87頁\編于星期六\11點當(dāng)質(zhì)點在電場中作穩(wěn)定運動時：F＝f即：QX＝6πrην

遷移率u：單位電場強度下的電泳速度，粒子的遷移率在一定條件下決定于粒子本身的性質(zhì)即其所帶電荷及大小和形狀。u＝v/E=q/6πrη

v=QX/6πrη

當(dāng)前第5頁\共有87頁\編于星期六\11點在具體實驗中，移動速度V為單位時間t（單位為s）內(nèi)移動的距離d（單位為cm），即V＝d/t。電場強度X為單位距離L（單位為cm）內(nèi)電勢差E（單位為伏特），即X＝E/L。將這兩個公式代入上述公式，得到U=v/X=dL/Etd=u*Et/L由此可以得到兩種物質(zhì)移動距離的差為△

d=(dA-dB)=(uA-uB)Et/L從這個公式可以看出物質(zhì)能否進行分離決定于二者的遷移率。

當(dāng)前第6頁\共有87頁\編于星期六\11點實際過程中影響電泳遷移率的因素很多，可以分為以下三大類：(1)與被動離子(或粒子)本身的特性有關(guān)

(2)環(huán)境因素

(3)所加電場的特性這些因素在實驗過程中要充分注意，盡量保持條件恒定不變，以便獲得可重復(fù)的結(jié)果。當(dāng)前第7頁\共有87頁\編于星期六\11點分類按支持介質(zhì)的不同可分為：

⑴紙電泳（Paperelectrophorisis）

⑵醋酸纖維薄膜電泳（CelluloseAcetateelectrophoresis）

⑶瓊脂凝膠電泳（AgarGelelectrophoresis）⑷聚丙烯酰胺凝膠電泳（PolyacrylamideGelelectrophoresis）（PAGE）

⑸SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）。按支持介質(zhì)形狀不同可分為：⑴薄層電泳；

⑵板電泳；

⑶柱電泳當(dāng)前第8頁\共有87頁\編于星期六\11點分類區(qū)帶電泳不同的離子在均一的緩沖液體系中分離形成獨立的區(qū)帶。等速電泳區(qū)帶相隨分成清晰的界面，等速移動。等電聚焦影響因素電荷，電場強度（強，快），溶液pH，離子強度（高，慢），電滲現(xiàn)象（區(qū)別分析），支持物（均勻，吸附力?。瑴囟龋ǜ?，快，擴散也快）當(dāng)前第9頁\共有87頁\編于星期六\11點區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個點或一薄層樣品溶液，然后加電場，分子在支持介質(zhì)上或支持介質(zhì)中遷移。支持介質(zhì)的作用主要是為了防止機械干擾和由于溫度變化以及大分子溶液的高密度而產(chǎn)生的對流。區(qū)帶電泳使用不同的支持介質(zhì)，早期有濾紙、玻璃珠、淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、聚氯乙烯樹脂；以后有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，現(xiàn)在則多用聚丙烯酰胺（PAGE）和瓊脂糖凝膠。當(dāng)前第10頁\共有87頁\編于星期六\11點Electrophoresis(電泳)——NucleicacidsDNA&RNA的分離瓊脂糖凝膠電泳EB(溴化乙啶)或Goldenview染色當(dāng)前第11頁\共有87頁\編于星期六\11點蛋白質(zhì)分離SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)考馬斯亮藍(lán)染色蛋白質(zhì)電泳當(dāng)前第12頁\共有87頁\編于星期六\11點聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）原理:分子篩(區(qū)別于過濾的分子篩)+電荷效應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠的優(yōu)點：1.樣品不易擴散；2.控制凝膠濃度形成不同孔徑；3.不產(chǎn)生電滲，化學(xué)惰性；4.制成的多聚物再現(xiàn)性高，重現(xiàn)性好；5.機械強度好，6.需要設(shè)備簡單，時間短。當(dāng)前第13頁\共有87頁\編于星期六\11點SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的流體力學(xué)和光學(xué)性質(zhì)表明，它們在水溶液中的形狀，近似于雪茄煙形狀的長橢園棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度都一樣（約為18?，即1.8nm），而長軸則隨蛋白質(zhì)分子量成正比地變化。這樣的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，在凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只是橢園棒的長度也就是蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。由于SDS和巰基乙醇的作用，蛋白質(zhì)完全變性和解聚，解離成亞基或單個肽鏈，因此測定的結(jié)果只是亞基或單條肽鏈的分子量。當(dāng)前第14頁\共有87頁\編于星期六\11點SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取決于用于灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度。在沒有交聯(lián)劑的情況下聚合的丙烯酰胺形成毫無價值的粘稠溶液，而經(jīng)雙丙烯酰胺交聯(lián)后凝膠的剛性和擴張強度都有所增加，并形成SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物必須通過的小孔。這些小孔的孔徑隨“雙丙烯酰胺～丙烯酰胺”比率的增加而變小，比率接近1：20時孔徑達(dá)到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按“雙丙烯酰胺～丙烯酰胺”為1：29配制，試驗表明它能分離大小相差只有3%的蛋白質(zhì)。凝膠的篩分特性取決于它的孔徑，而孔徑又是灌膠時所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕對濃度的函數(shù)。

當(dāng)前第15頁\共有87頁\編于星期六\11點蛋白質(zhì)樣品用SDS處理后亞基的解聚和分子形狀的改變當(dāng)前第16頁\共有87頁\編于星期六\11點未知蛋白質(zhì)分子量的測定基于上述SDS的原理介紹，我們可以利用SDS電泳進行未知蛋白質(zhì)的分子量測定；當(dāng)前第17頁\共有87頁\編于星期六\11點實驗過程1.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干,準(zhǔn)備2個干凈的錐形瓶.

2.把玻璃板在灌膠支架上固定好.

※固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板.

當(dāng)前第18頁\共有87頁\編于星期六\11點3.按比例配好分離膠,用移液管快速加入,大約5厘米左右,之后加少許蒸餾水,靜置40分鐘.

※凝膠配制過程要迅速,催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結(jié)無法注膠.注膠過程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡.

※水封的目的是為了使分離膠上延平直，并隔絕空氣

※凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面.

當(dāng)前第19頁\共有87頁\編于星期六\11點當(dāng)前第20頁\共有87頁\編于星期六\11點4.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干,按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處,迅速插入樣梳,靜置40分鐘.

※樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平.

5.在上槽內(nèi)加入緩沖液后,拔出樣梳。

※要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出,否則會影響加樣效果.

當(dāng)前第21頁\共有87頁\編于星期六\11點當(dāng)前第22頁\共有87頁\編于星期六\11點實驗過程6、加樣（1）取10μl標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶解液于EP管內(nèi)，再加入10μl2倍樣品緩沖液，上樣量為10μl。

（2）取10μl樣品溶液，再加入10μl2倍樣品緩沖液，上樣量分別為5μl和3μl。

7.用微量注射器距槽底三分之一處進樣,加樣前,樣品在

沸水中加熱3分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。

※注射器不可過低,以防刺破膠體,也不可過高,在樣下沉?xí)r會發(fā)生擴散.

※為避免邊緣效應(yīng),最好選用中部的孔注樣當(dāng)前第23頁\共有87頁\編于星期六\11點當(dāng)前第24頁\共有87頁\編于星期六\11點8.電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進行電泳，開始電流恒定在10mA，當(dāng)進入分離膠后改為20mA，溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時，停止電泳。

當(dāng)前第25頁\共有87頁\編于星期六\11點當(dāng)前第26頁\共有87頁\編于星期六\11點9.凝膠板剝離與染色：電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，染色1小時左右。10.脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。

※剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分當(dāng)前第27頁\共有87頁\編于星期六\11點當(dāng)前第28頁\共有87頁\編于星期六\11點電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后的凝膠照片

11.結(jié)果處理量出各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm)，按下式計算相對遷移率mR:相對遷移率mR=

蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離(cm)溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離(cm)當(dāng)前第29頁\共有87頁\編于星期六\11點SDS電泳常見問題分析1.配膠緩沖液系統(tǒng)對電泳的影響？

在SDS－PAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris－HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris－甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導(dǎo)電性與電場強度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓梯度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進行分離。

所以，pH對整個反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應(yīng)首要考慮該因素。

當(dāng)前第30頁\共有87頁\編于星期六\11點2.樣品如何處理？

根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。

1）還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT（或Beta巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。

2）帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護SH基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現(xiàn)象。100ul樣品緩沖液中10ul20％的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。

3）非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。

當(dāng)前第31頁\共有87頁\編于星期六\11點3.SDS電泳凝膠中各主要成分的作用？

聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；

制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇tris－HCL系統(tǒng)，TEMED與AP：AP提供自由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的聚合反應(yīng)進行；十二烷基硫酸鈉（SDS）：陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。

4.提高SDS電泳分辨率的途徑？

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的《蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊》P82-103。

當(dāng)前第32頁\共有87頁\編于星期六\11點5.“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？

主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。

處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實驗。

6.“皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？

主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。

處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。7.為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？

主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。

處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。8.為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？

主要是樣品不溶性顆粒引起的。

處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。當(dāng)前第33頁\共有87頁\編于星期六\11點9.什么是“鬼帶”，如何處理？

“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時，常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻與目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對應(yīng)的抗體作用。

處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。10.為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用？

我們在實驗中常會遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。

處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。11.為什么電泳的條帶很粗？

電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。

處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7）；適當(dāng)降低電壓；

當(dāng)前第34頁\共有87頁\編于星期六\11點12.為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？

這種現(xiàn)象一般初學(xué)者易出現(xiàn)。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。

處理辦法：電泳槽正確裝配即可。

13.濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎？

這主要出現(xiàn)在初學(xué)者中，一般對電泳不會有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進入引起的。

14.凝膠時間不對，或慢或快，怎么回事？

通常膠在30MIN-1H內(nèi)凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，AP劑量不夠或者失效。AP應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用，TEMED不穩(wěn)定，易被氧化成黃色。如果凝的太快，可能是AP和TEMED用量過多，此時膠太硬易裂，電泳時易燒膠。

15.電泳時間比正常要長？

可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電級緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯誤，即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質(zhì)的等電點差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強度太高。

當(dāng)前第35頁\共有87頁\編于星期六\11點等電聚焦電泳

NH3++OH－

NH3++OH－

NH2

PPPCOOH＋H＋

COO－＋H＋

COO－蛋白質(zhì)的陽離子蛋白質(zhì)的兼性離子蛋白質(zhì)的陰離子

當(dāng)前第36頁\共有87頁\編于星期六\11點當(dāng)前第37頁\共有87頁\編于星期六\11點兩性電解質(zhì)的種類(1)Ampholine(瑞典LKB)安福靈它是由許多脂肪族的多氨基,多羧基的異構(gòu)體和同系物組成的,pH范圍，4-6.5，5-8，3.5-9.5.當(dāng)前第38頁\共有87頁\編于星期六\11點(2)Servalyte(德國Serva公司)它是在由丙烯基乙胺與乙烯基亞胺縮合并蒸餾得到的多胺混合物中,再引入磺酸基團或磷酸基團合成的.pH范圍:2-4,3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、9-11、2-11、3-10.當(dāng)前第39頁\共有87頁\編于星期六\11點(3)Pharmalyte(瑞典Pharmacia)七氨基多羧基組成的pH范圍:2.5-5,4-5.5,5-8,8-10,3-10等當(dāng)前第40頁\共有87頁\編于星期六\11點(4)載體兩性電解質(zhì)(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)合成的方式與Ampholine基本相同.pH范圍當(dāng)前第41頁\共有87頁\編于星期六\11點等電聚焦電泳（IFE）

利用聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)的緩沖液在電場作用下沿電場方向在凝膠內(nèi)制造一個pH梯度。每種蛋白質(zhì)都將遷移至與它的pI相一致的pH處。凝膠中加有兩性電解質(zhì)溶液（pH9-3）

加電場后在凝膠內(nèi)形成一個穩(wěn)定pH梯度

加樣品，然后繼續(xù)電泳凝膠染色表明樣品按照各自pI值沿著pH梯度分布當(dāng)前第42頁\共有87頁\編于星期六\11點等電聚焦電泳進行過程中等電聚焦電泳結(jié)束后（＋）（＋）（－）（－）高pH高pH低pH低pH當(dāng)前第43頁\共有87頁\編于星期六\11點操作步驟及注意要點

凝膠配制：

a取10×0.5cm內(nèi)徑的玻璃管，從一端量出7cm作好標(biāo)記，用橡皮片封底（用兩條橡皮圈扎緊），垂直放置。

b

配制凝膠液（按順序，每加一種試劑后都要輕輕充分搖勻，TEMED最后才加入，加入搖勻后要立即灌膠），用長滴管吸取配好的凝膠液，沿玻璃管注入至7ml標(biāo)記平面，緩緩注入，避免產(chǎn)生氣泡。

c立即用5ml注射器配針頭注入約0.5cm高的蒸餾水，垂直放置（將長滴管及時清洗）

注意：丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用，注意避免直接接觸。當(dāng)前第44頁\共有87頁\編于星期六\11點

電泳將已聚合的凝膠去除水層，垂直插入電泳槽的橡皮管中，注意不要漏液。上槽注入5%H3PO4，下槽注入2%NaOH，檢查凝膠管上下口內(nèi)有無氣泡，如有必須排除。上槽接正極，下槽接負(fù)極，50V預(yù)電泳30min，然后將電壓維持在250V，電泳2小時。剝膠

用帶有針頭的注射器吸入蒸餾水，將針頭插入凝膠與水之間，使針頭慢慢螺旋前進?？克鲏毫⒛z與玻璃管分開，最后可用吸耳球在一端輕輕施壓，將其取下。測量樣品pI

直接用pH試紙插入所需測定的蛋白區(qū)帶中測量當(dāng)前第45頁\共有87頁\編于星期六\11點二維聚丙烯酰胺凝膠電泳（2D―PAGE）二維聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)結(jié)合了等電聚焦技術(shù)（根據(jù)蛋白質(zhì)等電點進行分離）以及SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)（根據(jù)蛋白質(zhì)的大小進行分離）。這兩項技術(shù)結(jié)合形成的二維電泳是分離分析蛋白質(zhì)最有效的一種電泳手段。

當(dāng)前第46頁\共有87頁\編于星期六\11點大腸桿菌全蛋白提取液雙向電泳凝膠染色后照片當(dāng)前第47頁\共有87頁\編于星期六\11點

雙向電泳第一向：等電聚焦電泳第二向：SDS

雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色后蛋白呈現(xiàn)二維分布圖：水平方向反映出蛋白在pI上的差異，垂直方向反映出它們在分子量上的差別。第一向電泳：等電聚焦電泳聚焦后凝膠放置在SDS凝膠上，進行第二向電泳第二向電泳：SDS分子量大分子量小pH9pH3pH9pH3當(dāng)前第48頁\共有87頁\編于星期六\11點第一維電泳是等電聚焦，在細(xì)管中（φ1～3mm）中加入含有兩性電解質(zhì)、8M的脲以及非離子型去污劑的聚丙烯酰胺凝膠進行等電聚焦，變性的蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點的不同進行分離。而后將凝膠從管中取出，用含有SDS的緩沖液處理30min，使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合。將處理過的凝膠條放在SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的瓊脂糖溶液使其固定并與濃縮膠連接。

當(dāng)前第49頁\共有87頁\編于星期六\11點在第二維電泳過程中，結(jié)合SDS的蛋白質(zhì)從等電聚焦凝膠中進入SDS－聚丙烯酰胺凝膠，在濃縮膠中被濃縮，在分離膠中依據(jù)其分子量大小被分離。這樣各個蛋白質(zhì)根據(jù)等電點和分子量的不同而被分離、分布在二維圖譜上。當(dāng)前第50頁\共有87頁\編于星期六\11點細(xì)胞提取液的二維電泳可以分辨出1000～2000個蛋白質(zhì)，有些報道可以分辨出5000～10000個斑點，這與細(xì)胞中可能存在的蛋白質(zhì)數(shù)量接近。由于二維電泳具有很高的分辨率，它可以直接從細(xì)胞提取液中檢測某個蛋白。例如將某個蛋白質(zhì)的mRNA轉(zhuǎn)入到青蛙的卵母細(xì)胞中，通過對轉(zhuǎn)入和未轉(zhuǎn)入細(xì)胞的提取液的二維電泳圖譜的比較，轉(zhuǎn)入mRNA的細(xì)胞提取液的二維電泳圖譜中應(yīng)存在一個特殊的蛋白質(zhì)斑點，這樣就可以直接檢測mRNA的翻譯結(jié)果。當(dāng)前第51頁\共有87頁\編于星期六\11點雙向電泳分析中的樣品制備制備原則：應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。當(dāng)前第52頁\共有87頁\編于星期六\11點電泳

electrophoresis是指溶液中帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的電動現(xiàn)象。毛細(xì)管電泳

capillaryelectrophoresis

是利用被分析離子在電場作用下移動的速率不同而達(dá)到分離的目的，這種技術(shù)主要用來分析在毛細(xì)管緩沖溶液中能離解為離子的物質(zhì)。毛細(xì)管電色譜

可以分離離子和中性分子。它是利用緩沖溶液的電滲流作為泵，使被分析的分子通過對其具有不同保留程度的第二相，達(dá)到分離的目的。毛細(xì)管電泳當(dāng)前第53頁\共有87頁\編于星期六\11點毛細(xì)管電泳的基本原理電泳分離的基礎(chǔ)

=eE

為離子移動的速度

e為電泳遷移率E為毛細(xì)管柱進樣端至檢測窗口間電場強度。離子的電泳遷移率不同，在電場中移動的速度不一樣，利用這個原理可以把不同的離子彼此分離。電泳遷移率與分析物質(zhì)所帶電荷呈正比，與摩擦阻力系數(shù)呈反比。如果兩種物質(zhì)帶有不同的電荷或者通過緩沖溶液移動的摩擦力不同，那么這兩種物質(zhì)可以彼此分離。電荷-尺寸只有一個相?。?！當(dāng)前第54頁\共有87頁\編于星期六\11點毛細(xì)管電泳1

離子移動的速率

=eE=eU/LU是毛細(xì)管柱兩端施加的壓力L是毛細(xì)管柱總長。采用高電壓可以達(dá)到使離子迅速移動和快速分離。2

毛細(xì)管電泳中的板高N=eU/2D由于分離度隨塔板數(shù)的增加而增加，因此為了獲得高的分離度應(yīng)采用高電壓。在凝膠板形電泳中，一般最高使用的電壓約為500V。在毛細(xì)管電泳中，一般可采用20,000~60,000V的高電壓。當(dāng)前第55頁\共有87頁\編于星期六\11點3

電滲流在電泳過程中還存在另一種電動現(xiàn)象，即電滲。當(dāng)高電壓通過含有緩沖溶液的毛細(xì)管柱時，管內(nèi)的溶質(zhì)向陰極或陽極移動，產(chǎn)生電滲流。在柱內(nèi)層氧化硅與溶質(zhì)的界面上形成雙電層是電滲流產(chǎn)生的原因。在典型的毛細(xì)管電泳分離中，若有電滲存在，離子的洗脫順序是:首先是最快的陽離子，緊接著是依次減慢的陽離子，然后是全部的中性分子在一個區(qū)域出現(xiàn)，最后是最慢的陰離子，緊接著的是依次加快的陰離子。當(dāng)前第56頁\共有87頁\編于星期六\11點毛細(xì)管電泳的分離模式與應(yīng)用細(xì)管區(qū)帶電泳capillaryzoneelectrophoresis,CZE毛細(xì)管凝膠電泳capillarygelelectrophoresis,CGE毛細(xì)管等速電泳capillaryisota-chophoresis,CITP毛細(xì)管等電聚焦capillaryisoelectricfocus,CIEF當(dāng)前第57頁\共有87頁\編于星期六\11點細(xì)管區(qū)帶電泳是基于試樣中各個組分間荷質(zhì)比的差異進行分離的。這種電泳模式的特征是整個系統(tǒng)都用同一種緩沖溶液充滿。背景電解質(zhì)的濃度一般高于試樣，起運載電流的作用，其離子有一定的遷移率。當(dāng)電流通過時，緩沖溶液中的陰，陽離子分別以一特定的速度分別向正極和負(fù)極移動。同時試樣中的不同離子將按各自的恒定速度移動，形成背景電解質(zhì)離子流動中伴隨有試樣離子的流動。如果試樣中不同離子的遷移率差別很大，就能將不同離子分離。毛細(xì)管區(qū)帶電泳可以分離小離子，而且能分離那些衍生化或反應(yīng)生成離子的物質(zhì)，如抗炎藥物，氨基酸，蛋白質(zhì)等物質(zhì)。當(dāng)前第58頁\共有87頁\編于星期六\11點毛細(xì)管凝膠電泳是將生物大分子如蛋白質(zhì)，DNA片斷，按相對分子質(zhì)量大小進行分離的一種分離方法。毛細(xì)管凝膠電泳一般是在多孔的凝膠基質(zhì)上進行，如聚酰胺聚合物。在凝膠的孔穴中含有緩沖混合物，分離是在穴中進行。最常用的凝膠是在交聯(lián)劑的存在下聚合丙烯酸酰胺。聚合物的孔穴大小取決于單體與交聯(lián)劑的比例，增加交聯(lián)劑的量可以得到小孔穴凝膠。當(dāng)前第59頁\共有87頁\編于星期六\11點毛細(xì)管等速電泳是基于試樣中各組分電泳遷移率的差異而進行分離的。在等速電泳中試樣是引入在兩種不同的電解質(zhì)之間，其中一種是遷移率較高的前導(dǎo)離子電解質(zhì)溶液另一種是遷移率較低的尾隨離子電解質(zhì)溶液。當(dāng)加上電場后，由于各種離子遷移率不同，向正極遷移的速度不同，故電解質(zhì)溶液將形成由負(fù)極到正極增加的離子濃度梯度，而電位梯度與電導(dǎo)率呈反比，故低濃度離子區(qū)即低電導(dǎo)區(qū)有較高的電位梯度。因此電泳池內(nèi)電解質(zhì)溶液的電位梯度有正極向負(fù)極增加。由于離子的遷移速度與電場強度呈正比，隨著電泳的進行，離子進入等速狀態(tài)，此時形成緊緊相鄰而又彼此完全分離的單組分區(qū)帶。當(dāng)前第60頁\共有87頁\編于星期六\11點毛細(xì)管等電聚焦是基于不同蛋白質(zhì)或多肽之間等電點pH的差異進行分離。分子中既有酸性基團又有堿性基團的兩性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)，有一個等電點pI,即電荷為零時的pH。當(dāng)溶液中的pH正好是兩性物質(zhì)的等電點時，它們在電場中不移動。高于此pH時，它們失去質(zhì)子帶負(fù)電荷，在電場作用下向正極移動低于此pH時，移向負(fù)極。若在毛細(xì)管柱中置一pH梯度緩沖溶液，從一端向另一端遞增。當(dāng)兩性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)進入毛細(xì)管柱置于高于它的pI的地方，它就帶負(fù)電荷，趨向正極而朝這個方向pH逐漸變小，最后達(dá)到pH等于它的pI值的部位，此時凈電荷為零，速度也為零。通過等電點聚焦，將試樣中不同物質(zhì)濃縮在不同的等電點處，從而達(dá)到分離的目的。當(dāng)前第61頁\共有87頁\編于星期六\11點毛細(xì)管電色譜填充柱毛細(xì)管電色譜。基于填充柱的電色譜是各種電泳中最新出現(xiàn)的一種技術(shù)。它是利用電滲透驅(qū)動極性溶劑通過反相高效液相色譜毛細(xì)管柱，利用試樣在兩相的分配進行分離。膠束電動毛細(xì)管色譜。是在緩沖溶液中加入濃度高于膠束臨界濃度的表面活性劑。膠束相在分離中起到了準(zhǔn)固定相的作用，電中性的有機化合物按照它們在水相和有機相之間分配系數(shù)的差異進行分離。該方法也可用來改善帶電有機化合物的分離選擇性。當(dāng)前第62頁\共有87頁\編于星期六\11點毛細(xì)管電動色譜的優(yōu)點像高效液相色譜，能夠分離不帶電荷的物質(zhì)。像毛細(xì)管電泳法，不需要壓力泵系統(tǒng)的情況下，提供了微量體積試樣溶液的高效分離通過電滲流泵，而不是通過機械輸送流動相通過固定相的。明顯地簡化了輸送體系。電滲泵產(chǎn)生的是塞子式流動輪廓，而不是流體動力學(xué)輪廓，因此毛細(xì)管電色譜的分離柱效比高效液相色譜法高。當(dāng)前第63頁\共有87頁\編于星期六\11點

毛細(xì)管電色譜CEC:以電滲流驅(qū)動流動相，開管和填充兩種比高效液相色譜具有更高的柱效

當(dāng)前第64頁\共有87頁\編于星期六\11點高效毛細(xì)管電泳儀器（1）當(dāng)前第65頁\共有87頁\編于星期六\11點高效毛細(xì)管電泳儀器（2）當(dāng)前第66頁\共有87頁\編于星期六\11點高效毛細(xì)管電泳儀器（3）當(dāng)前第67頁\共有87頁\編于星期六\11點

一、高效毛細(xì)管電泳基本原理

在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同可實現(xiàn)分離。1.經(jīng)典電泳分離法的不足所用分離柱的柱徑大，柱較短，分離效率不高（遠(yuǎn)低于HPLC），溫度影響大。高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項重要改進。當(dāng)前第68頁\共有87頁\編于星期六\11點2.高效毛細(xì)管電泳技術(shù)上的重要突破高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項重要改進：

一是采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細(xì)管,；二是采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場電壓可以很高。電壓升高，電場推動力大，又可進一步使柱徑變小，柱長增加，高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬。當(dāng)前第69頁\共有87頁\編于星期六\11點3.電泳現(xiàn)象與電滲流現(xiàn)象

電泳現(xiàn)象：帶電離子在電場作用下的遷移，速度ν電泳

電滲流現(xiàn)象：玻璃表面存在硅羥基,pH>3時,形成雙電層，在高電場的作用下引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動，速度ν電滲流。當(dāng)前第70頁\共有87頁\編于星期六\11點4.分離過程

電場作用下，柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。

帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流兩種速度的矢量和。正離子：兩種效應(yīng)的運動方向一致，在負(fù)極最先流出；中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；陰離子：兩種效應(yīng)的運動方向相反，ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時被相互分離。當(dāng)前第71頁\共有87頁\編于星期六\11點5.分離類型八種分離類型(1)毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）最普遍、最基本的一種分離模式。(2)毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）將聚丙烯酰胺在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高?？煞蛛x測定蛋白質(zhì)、DNA等。當(dāng)前第72頁\共有87頁\編于星期六\11點(3)毛細(xì)管膠束電動色譜（MECC）

在緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。在電場力的作用下，膠束在柱中移動。由于電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流

>ν電泳，則帶負(fù)電的膠束以較慢的速度向負(fù)極方向移動，中性試樣分子在膠束相和溶液（水相）兩相間分配，疏水性強的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時間長?？捎脕矸蛛x中性物質(zhì)，擴展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍。當(dāng)前第73頁\共有87頁\編于星期六\11點二、儀器裝置一般在一根長40~100cm,內(nèi)徑10~100m的毛細(xì)管柱中充入緩沖溶液，柱的兩端置于兩個緩沖池中。在兩個緩沖池之間的毛細(xì)管接有兩個鉑電極。試樣從一端進入，而檢測器則在另一端。使用的高電壓可以反相，以能分析陰離子。當(dāng)前第74頁\共有87頁\編于星期六\11點一般的進樣方式是電動進樣和壓力進樣。電動進樣是將毛細(xì)管柱的一端及其相應(yīng)端的電極從緩沖池中移出，放入試樣杯中，然后在一準(zhǔn)確時間范圍內(nèi)施加壓力，使試樣因離子移動和電滲流進入毛細(xì)管柱。壓力進樣是用壓差使試樣溶液進入毛細(xì)管。產(chǎn)生壓差的辦法可以采用在檢測器端抽真空，或者通過提高試樣端液面。當(dāng)前第75頁\共有87頁\編于星期六\11點三、影響柱效的因素及改進方法熱效應(yīng)：焦耳熱仍是影響柱效的主要因素。采用外部冷卻的方法散熱，擇合適的電壓和電解質(zhì)也是提高柱效的有效途徑。選擇合適的電解質(zhì)降低電阻，電流低于200微安，一般幾十微安。電滲流控制：電滲流的大小和方向依賴于毛細(xì)管壁與溶液間電勢的極性和大小。使用添加劑可以改變電滲流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低電滲流；加入乙腈則可以增大電滲流。加入反轉(zhuǎn)劑,則可以改變電滲流的方向。當(dāng)前第76頁\共有87頁\編于星期六\11點四、主要特點和應(yīng)用高分辨率：理論塔板數(shù)高達(dá)數(shù)百萬塊，甚至數(shù)千萬塊。高靈敏度：可檢測出低至10-21mol/L濃度的物質(zhì)。高分析速度：可