北中大中藥化學實驗指導02基本實驗項目-1虎杖中蒽醌類成分及白藜蘆醇苷的提取分離和鑒定

第二章基本實驗項目實驗一虎杖中蒽醌類成分及白藜蘆醇苷的提取分離和鑒定虎杖系蓼科蓼屬植物（Polygonumcuspidatumsieb.etzucc.）的根莖，又名陰陽蓮。味苦，性微寒，具有瀉下、健胃、清熱、解毒之功。民間多用于消炎、殺菌、利尿、通經(jīng)、鎮(zhèn)痛，近年來用于燙傷、止血、消結(jié)石、降血脂的治療。近年來用于治療燙傷、止血、消結(jié)石和降低血脂均有療效?；⒄雀o中含有大量的蒽醌成份和二苯乙烯類成份，后者具降血脂的作用。一、部分已知成分的理化性質(zhì)1.大黃素（Emodin）：橙黃色長結(jié)晶（丙酮中為橙色，甲醇中為黃色），mp.256℃—257℃，能升華。其溶解度如下：Et2O0.14%，CCl40.01%，CHCl30.0718%，CS20.009%，乙醚0.14%；易溶于乙醇；可溶于氨水、Na2CO3和NaOH水溶液；幾乎不溶于水。2.大黃素-6-甲醚（Physion）：金黃色針晶，mp.207℃，能升華。溶解性與大黃酚相似。3.大黃素-3-D-葡萄糖苷（Emodinmonoglucoside）mp.190℃—191℃，淺黃色針晶，（稀乙醇中結(jié)出，含一分子結(jié)晶水）。4.大黃素-6-甲醚-8-D-葡萄糖苷mp.230℃—232℃，黃色針晶（稀甲醇中結(jié)出）。5.白藜蘆醇（resveratrol）：無色針狀結(jié)晶。mp.256℃—257℃，261℃—264℃，能升華。易溶于乙醚、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮等。6.白藜蘆醇葡萄糖苷（polydatin,peceid）：又名3，4，5-三羥基芪-3-β-D-葡萄糖苷，mp.225℃，232℃（分解）。無色針狀蔟晶。易溶于甲醇、乙醇、丙酮、熱水；可溶于乙酸乙酯，稍溶于Na2CO3和NaOH水溶液，難溶于乙醚。UV：λMeOHmaxnm（logε）216（4.42），230sh（4.29），303（4.52），318（4.52）IR：υKBrmax（cm-1）3400，1600，1525，1470，1270，1185，1160，1100，1040，970，850，690附注：此化合物具順反二種異構體，能互相轉(zhuǎn)化，所得常是二者的混合物以反式為多，故前人工作中所報道的熔點有所不同，按本實驗方法所得的白藜蘆醇苷結(jié)晶含一分子結(jié)晶水，在130～140℃先融化，繼續(xù)加熱固化，至225～226℃全熔。二、實驗目的 1.學習脂溶性成分（苷元）和水溶性成份（苷）的分離方法。2.學習用pH梯度萃取法分離酸性不同的蒽醌類成分。3.了解蒽醌類成分的一般性質(zhì)和鑒別反應。三、實驗原理根據(jù)游離蒽醌與苷溶解性能的差異，先用乙醚萃取出游離蒽醌等脂溶性成份，從而使脂溶性成分（苷元）和水溶性成份（苷）得到分離。再根據(jù)虎掌中蒽醌類成分由于結(jié)構中酚羥基數(shù)目及位置不同而成不同強度的酸性，用堿性遞加的的水溶液（5%NaHCO3，5%Na2CO3，2%NaOH）自乙醚中提出不同酸性強弱的游離蒽醌類成分，達到分離的目的。四、提取分離流程五、溶劑、試劑、展開劑及顯色劑1.原料：虎杖粗粉50g2.溶劑：90-95%乙醇500ml，80%乙醇200ml，乙醚500ml，CHCl3，MeOH各50～100ml。3.試劑：HCl，NaHCO3，Na2CO3，NaOH，無水硫酸鈉，活性炭（2g），Al2O3（30g），硅膠G。4.展開劑：（1）石油醚（bp30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15:5:1，上層）15ml。（2）氯仿-甲醇（9:2）5.顯色劑（1）5%KOH/MeOH液（2）1%FeCl3-1%鐵氰化鉀（1:1）6.定性試劑2%NaOH，0.5%Mg（Ac）2六、實驗方法1．乙醇總提取物的制備取虎杖粗粉50g，用90～95%乙醇回流提取二次（200ml1h；150ml1h），過濾合并乙醇液，如有沉淀，抽濾，濾液減壓回收乙醇至無醇味，得乙醇總提取物。2．總游離蒽醌的提取將上述提取物，加入15ml水稀釋至分液漏斗中，用乙醚萃?。?5ml×2，20ml×4），合并乙醚液即為總游離蒽醌。乙醚萃取后的水層含有水溶性成分。3．游離蒽醌得分離（1）大黃素的分離上述乙醚液移至分液漏斗中，用5%NaHCO3水溶液萃取3～4次（20ml×2，15ml×1～2），棄去NaHCO3液。乙醚溶液再用5%Na2CO3水溶液萃取7～9次（25ml×2，20ml×2～3，15ml×3～4）。合并Na2CO3萃取液，揮去堿液中的乙醚，堿液在攪拌下慢慢滴加6NHCl調(diào)PH=2，稍放置，抽濾，沉淀水洗至中性，干燥，稱重。沉淀物用20ml環(huán)己烷-丙酮（7:3）溶解后，經(jīng)硅膠柱層析（15g），環(huán)己烷-丙酮（7:3）洗脫，流速約4～5ml/min，洗脫至橙色色帶洗下即可，收集洗脫液，回收溶劑至干，殘留物加少量乙醇溶解，得大黃素乙醇液。（2）大黃素-6-甲醚的分離以上用Na2CO3萃取過的乙醚溶液再用2%NaOH水溶液萃取4～5次，每次10ml，合并NaOH液，干燥、揮去堿液中的乙醚，堿液在攪拌下慢慢滴加6NHCl調(diào)PH=2，稍放置，抽濾，沉淀水洗至中性，干燥，稱重，得大黃素-6-甲醚粗品。（3）中性脂溶性成分的分離上述NaOH萃取過的乙醚液，用水洗至中性，再用無水Na2SO4脫水，回收乙醚得殘留物，即得中性脂溶性成分。4．白藜蘆醇苷的分離：取“2”中乙醚萃取過的水層，揮去乙醚，置燒杯中加水至150ml，攪拌混合后，加熱10min，放冷過濾，濾液加活性炭2g，煮沸20分鐘，趁熱過濾，濾液放冷后置分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取5～7次（40×2～3，30×3～4），合并乙酸乙酯萃取液回收溶劑，殘留物用適量80%乙醇溶解，經(jīng)Al2O3柱層析（中性Al2O3100～200目，裝柱15cm，柱徑2cm，干法裝柱）凈化，80%乙醇洗脫（約100ml），洗脫液回收至干，加1ml水及5ml乙醇，加熱溶解（需要過濾時須趁熱過濾）。濾液放置，析晶，鑒識。5．鑒識A．層析法鑒定：（1）游離蒽醌的硅膠GTLC對照品：大黃素、大黃素甲醚樣品：自制大黃素、大黃素甲醚乙醇液展開劑：石油醚(bp30～60℃)—甲酸乙酯—甲酸（15:5:1），上層。顯色劑：a.紫外燈下觀察熒光b.5%KOH甲醇溶液（2）白藜蘆醇苷的硅膠GTLC對照品：白藜蘆醇苷樣品：自制白藜蘆醇苷乙醇液展開劑：CHCl3-MeOH（9:2）顯色劑：a.紫外燈（365nm）下觀察熒光b.5%KOH甲醇溶液B．定性反應—游離蒽醌的反應分別取大黃素、大黃素甲醚少許，乙醇2ml溶解，做如下反應：a：Borntrager反應：取試液1ml，滴加2%NaOH溶液，觀察顏色。b：Mg(Ac)2試劑：取試液1ml，滴加5%Mg(Ac)2溶液2—3滴，觀察顏色。七、實驗安排本試驗共分4.5次完成。第一次：乙醇總提取物的制備第二次：總游離蒽醌的提??；游離蒽醌的分離第三次：白藜蘆醇苷的分離（開始至“殘留物用適量80%乙醇溶解”）；大黃素的重結(jié)晶第四次：白藜蘆醇苷的分離（殘留物乙醇液經(jīng)Al2O3柱凈化至放置結(jié)析晶）；大黃素結(jié)晶的過濾、洗滌、稱重；定性反應；層析板的涂鋪（2塊）第五次：游離蒽醌、白藜蘆醇苷的層析鑒識；（實驗二蘆丁的提?。┌?、思考題1．pH梯度萃取法的原理是什么？適用