北中大中藥化學(xué)實驗指導(dǎo)02基本實驗項目-2槐花米黃酮苷及苷元的提取和鑒定

實驗二槐花米黃酮苷及苷元的提取和鑒定槐花米系豆科槐屬植物（Sophorajaponica.L）的花蕾。歷來作為止血藥物治療痔、子宮出血、吐血、鼻衄等。其所含主要成分為蘆?。≧utin，亦稱蕓香苷），其含量高達(dá)12～16%。藥理試驗證明蘆丁有調(diào)節(jié)毛細(xì)血管滲透作用，臨床用于治療毛細(xì)血管性止血藥，作為高血壓癥的輔助藥物。蘆丁廣泛存在于植物中，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)含蘆丁的植物達(dá)70種以上。一、主要黃酮類成分的物理性質(zhì)（1）蘆?。ㄊ|香苷，Rutin）淡黃色針狀結(jié)晶，熔點：含三分子結(jié)晶水物174℃—178℃；無水物為188℃。蘆丁溶解度見下表：水甲醇乙醇吡啶冷0.00431.00.368.5熱0.5511.23.5易溶不溶于乙醚、氯仿、石油醚、乙酸乙脂、丙酮等溶劑。易溶于堿液且呈黃色，酸化后復(fù)析出。可溶于濃硫酸和濃鹽酸且呈棕黃色，加水稀釋復(fù)又析出。UV：λMeOHmaxnm（logε）259，266sh，299sh，359(2)槲皮素（Quercetin）：黃色結(jié)晶，熔點：含兩分子結(jié)晶水物313℃—314℃，無水物316℃。溶解度：乙醇1:290，無水乙醇1:23(沸時)，可溶于甲醇、乙酸乙脂、冰醋酸、吡啶、丙酮等溶劑，不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚。UV：λEtOHmaxnm（logε）255，269sh，301sh，370二、實驗?zāi)康?．了解黃酮類化合物的一般性質(zhì)。2．學(xué)習(xí)聚酰胺TLC法在黃酮類化合物中的應(yīng)用。3．掌握由黃酮苷水解制取黃酮苷元的方法及糖的檢識方法。。4．通過測定蘆丁及槲皮素的紫外光譜，進(jìn)一步了解如何利用紫外光譜對黃酮類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定。三、實驗原理1．利用蘆丁可溶于熱水，難溶于冷水的性質(zhì)進(jìn)行提取、精致。2．黃酮苷可通過酸水解得到苷元和糖，并可通過TLC、PC及乙?；衔镏苽溥M(jìn)行檢識。3．不同黃酮類化合物對紫外光有特定吸收，可利用此對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定。四、提取精致流程五、溶劑、試劑、展開劑及顯色劑1.原料：槐花米30g2.試劑：1%H2SO4100ml，BaCO3，甲醇50ml，醋酐，濃H2SO4，95%乙醇，層析紙，聚酰胺薄膜（3×10cm），硅膠3.標(biāo)準(zhǔn)品：葡萄糖，鼠李糖，蘆丁，槲皮素4.展開劑：（1）80%乙醇（2）n-BuOH-HAc-H2O(4:1:5)上層液15ml（3）n-BuOH-HAc-Alc-H2O(4:1:1:0.25)5.顯色劑：苯胺—鄰苯二甲酸鹽試劑，濃氨水，1%AlCl36.定性試劑：10%α-萘酚溶液，濃H2SO4，濃HCl，鎂粉，F(xiàn)eCl3乙醇液，1%Mg（Ac）2甲醇液，1%AlCl3乙醇液，2%ZrOCl2甲醇液，2%檸檬酸甲醇液。六、實驗方法1.蘆丁的提取稱取槐花米30g，研碎后，置燒杯中，加熱水（50℃以上）300ml，煮沸15分鐘，趁熱過濾，濾渣再分別用200ml熱水煮提兩次，每次10分鐘，趁熱過濾，放置過夜，可析出大量沉淀，等沉淀完全，濾取沉淀，放置自然干燥，即得蘆丁粗品。2.蘆丁的精制上述沉淀稱重后加入100倍量的熱水溶解，趁熱過濾，放冷析出結(jié)晶，結(jié)晶自然干燥（或在紅外燈下干燥），得蘆丁水精制品。3.蘆丁的水解稱取蘆丁水精制品0.5g，置250ml圓底燒瓶中加1%H2SO4（V/V）50ml，直火回流30分鐘（注意觀察現(xiàn)象），放冷過濾（濾液留作糖的鑒識），沉淀物為蘆丁苷元—槲皮素的粗品，水洗至中性用60%乙醇（70～80倍量）重結(jié)晶，干燥稱重，得槲皮素精品。4.糖的檢識（PC和TLC）取水解濾液20ml，水浴上加熱，加固體BaCO3中和至中性（不斷攪拌下進(jìn)行），濾除白色BaSO4沉淀，濾液蒸干后加2～3ml甲醇溶解，作層析檢識樣品溶液。

對照品：葡萄糖，鼠李糖TLC吸附劑：硅膠

展開劑：PC：n-BuOH-HAc-H2O(4:1:5)上層液TLC：n-BuOH-HAc-Alc-H2O(4:1:1:0.25)顯色劑：苯胺-鄰苯二甲酸鹽試劑，噴霧后，105℃加熱5～10分鐘至顯棕色或棕紅色斑點。5.蘆丁及槲皮素的聚酰胺TLC吸附劑：聚酰胺-6薄膜

對照品：蘆丁、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的甲醇溶液

樣品：1%蘆丁、槲皮素的甲醇溶液展開劑：80%乙醇顯色劑：1%AlCl3乙醇液顯色后，紫外光（365nm）下觀察。6.槲皮素乙酰化物的制備稱取精制槲皮素5mg置10ml干燥三角瓶中，加5ml醋酐和一滴H2SO4振搖，完全溶解后放置24h，傾入30ml冷水中，不斷攪拌，則析出白色結(jié)晶。濾取沉淀洗滌，以90～95%乙醇重結(jié)晶，得槲皮素五乙?；锏陌咨Y(jié)晶。7.蘆丁及苷元的的定性反應(yīng)

（1）樣品制備：取蘆丁及槲皮素精品約10mg（豆粒大）用5mlMeOH溶解。（2）定性反應(yīng)A：Molish反應(yīng)加10%α-萘酚溶液1ml，振搖后斜置試管，沿管壁滴加0.5ml濃H2SO4，靜置觀察液面交界處顏色變化。B：鹽酸鎂粉反應(yīng)取蘆丁（槲皮素）溶液少許，分別置于試管中，加濃鹽酸，再各加入鎂粉，觀察顏色變化。C：FeCl3反應(yīng)取蘆?。ㄩ纹に兀┤芤荷僭S，分別置于試管中，分別加FeCl3乙醇溶液1～2滴，觀察顏色變化。D：Mg（Ac）2紙片反應(yīng)取2張濾紙片，分別滴2滴蘆丁，槲皮素甲醇液，然后各加1%Mg（Ac）2甲醇溶液2滴，于紫外燈下觀察熒光變化。E：AlCl3紙片反應(yīng)取2張濾紙片，分別滴2滴蘆丁，槲皮素甲醇液，然后各加1%AlCl3乙醇溶液2滴，于紫外燈下觀察熒光變化。F：鋯鹽—檸檬酸反應(yīng)分別加入2%ZrOCl2甲醇溶液3～4滴，觀察顏色。然后加入檸檬酸甲醇溶液3～4滴，觀察顏色。8.蘆丁及槲皮素的的紫外光譜測定（1）試液的配制

A.無水甲醇：用分析純甲醇加入10%氧化鈣放置24h。然后蒸餾，即得。B.甲醇鈉溶液：取0.25g金屬鈉切碎，小心加入10ml無水甲醇（此液置玻璃瓶中，用橡皮塞密封）。C.AlCl3溶液：取1g無水AlCl3小心加入甲醇20ml，放置24h，全溶即得。D.醋酸鈉：采用試劑級無水粉末醋酸鈉。E.硼酸飽和溶液：將試劑級無水硼酸加入適量無水甲醇制成飽和溶液。（上述各溶液可貯存6個月）（2）測定方法精密稱取蘆丁、槲皮素各10mg，分別用甲醇溶解，并稀釋至100ml，從中吸取5ml，置50ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度（10μg/ml）。A.樣品甲醇溶液光譜去樣品液置石英杯中，在200～400nm內(nèi)掃描。重復(fù)操作一次，觀察紫外光譜。B.甲醇鈉光譜取樣品液置石英杯中，加入甲醇鈉溶液3滴，立即測定。放置5min后再測一次。C.AlCl3光譜在盛有樣品液的石英杯中滴加6滴AlCl3溶液，放置1min后測定，然后加入3滴HCl溶液（HCl-H2O=1:1），再進(jìn)行測定。D.醋酸鈉光譜取樣品溶液3ml，加入過量的無水醋酸鈉固體，搖勻（杯底剩有約2mm厚的醋酸鈉）。加入醋酸鈉后2min采用試劑級無水粉末醋酸鈉。E.NaAc/H3BO3方法Ⅰ.在測定用的盛有檢品及NaAc液的石英杯中加入足夠量的無水硼酸粉末,使成飽和溶液進(jìn)行測定(本法適用于在加入NaAc5min后無分解現(xiàn)象的樣品)方法Ⅱ.于樣品液（約3ml）中加入5滴H3BO3溶液，然后迅速加入無水NaAc粉末飽和，立即測定。七、實驗安排本實驗共分2.5次完成。第一次:蘆丁的提取；（實驗一游離蒽醌、白藜蘆醇苷的層析鑒識）第二次:蘆丁的精致；蘆丁的水解，槲皮素乙?；锏闹苽涞谌?糖的層析檢識；蘆丁及槲皮素的聚酰胺TLC；蘆丁及槲皮素的定性反應(yīng)；蘆丁及槲皮素的的紫外光譜測定八、思考題1.一般提取液需經(jīng)過適當(dāng)濃縮，分離凈化才能得到化合物的粗品，為什么蘆丁不經(jīng)過這些處理就能得到粗品？2.酸水解常用什么酸，為什么用H2SO4