1 常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)課件

常規(guī)PCR技術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳

生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)掌握：1、PCR的基本操作方法。2、瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的基本原理和方法。理解：1、PCR儀的使用方法。了解：1、PCR體外擴(kuò)增的原理及其引物設(shè)計(jì)原則。2、擴(kuò)增過程中各因素對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響。教學(xué)目的：1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)1、PCR反應(yīng)體系的建立。2、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。教學(xué)重點(diǎn)：教學(xué)難點(diǎn)：

1、PCR反應(yīng)程序的設(shè)計(jì)方法。1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)一、基本原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）：體外DNA酶促擴(kuò)增技術(shù)，能特異高效地在體外擴(kuò)增目的DNA片段。1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)PCR反應(yīng)的基本步驟變性94?C雙鏈DNA模板被加熱變性成兩條單鏈退火45~60?C（Tm-5?C）寡聚核苷酸引物按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與單鏈模板DNA特異結(jié)合延伸72?CDNA聚合酶作用下，以引物為起始，合成與模板DNA互補(bǔ)的新鏈1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)Cycle255555Primer15Primer2Cycle155TemplateDNAPCR技術(shù)的工作原理555555551常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)Cycle355

5555555

5

55555

525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳原理把DNA樣品加入到瓊脂糖凝膠的樣品孔中，并置于靜電場上。由于DNA分子的雙螺旋骨架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根殘基，因此在電場中向正極移動(dòng)。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，因而可依據(jù)DNA分子的大小來使其分離。在電泳前向凝膠或樣品中預(yù)加示蹤染料，電泳過程中染料同DNA結(jié)合，電泳后在紫外光照射下，可觀察到熒光，從而對(duì)分離的DNA進(jìn)行檢測。1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)二、操作步驟1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)?zāi)０錎NA特異性引物耐熱DNA聚合酶(如Taq酶)dNTPs反應(yīng)緩沖液（含Mg2+）PCR反應(yīng)的基本組分1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)10×PCR緩沖液（Mg2+

Plus）

5μldNTP混合物（2.5mM）

4μl上游引物（10μM）

2μl

下游引物（10μM）

2μlDNA模板

4μlTaqDNA聚合酶（2.5U/μl）

1μl去離子水

32μl實(shí)驗(yàn)步驟一：PCR反應(yīng)體系的建立（重點(diǎn)）50μl2345671加樣順序1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)PCR反應(yīng)程序的設(shè)計(jì)（難點(diǎn)）預(yù)變性：94℃5min變性：94℃30sec退火：55℃30sec延伸：72℃40sec(60sec)最終延伸：72℃5min保存：4℃forever25cycles實(shí)驗(yàn)步驟二：PCR反應(yīng)程序的設(shè)計(jì)1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)PCR程序設(shè)計(jì)的主要因素循環(huán)溫度和時(shí)間Tm的概念：在雙鏈DNA解鏈過程中，紫外吸光度的變化ΔA260達(dá)到最大變化值的一般時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度。Tm計(jì)算方法堿基數(shù)小于20：Tm=4×(GC%)+2×(AT%)堿基數(shù)大于20：Tm=81.5+0.41×(GC%)–

(675/引物長度)1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)主要實(shí)驗(yàn)儀器PCR儀1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)主要實(shí)驗(yàn)儀器PCR儀1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)步驟三：結(jié)果檢測瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物1.試劑：50×TAE電泳緩沖液：Tris242g，乙酸57.1ml，0.5mol/LEDTA（pH8.0）100ml，定容至1L，高壓滅菌后備用。1×TAE電泳緩沖液：20ml50×TAE電泳緩沖液加入雙蒸水，定容至1L。2.1％瓊脂糖凝膠的配制：

100mlTAE電泳緩沖液中加入1g瓊脂糖，搖勻后放入微波爐中，小火加熱幾分鐘至溶液透明位置，取出后冷卻至56℃左右時(shí)，加入微量（3.5μL）的EB（溴化乙錠），混勻后倒入槽中，冷卻后待用。1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)不同類型瓊脂糖分離DNA片段大小的范圍瓊脂糖/％標(biāo)準(zhǔn)高強(qiáng)度低熔點(diǎn)0.30.5700bp～25kb0.8500bp～15kb800bp～10kb800bp～10kb1.0250bp～12kb400bp～8kb400bp～8kb1.2150bp～6kb300bp～7kb300bp~7kb1.580bp~4kb200bp~4kb200bp~4kb1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)3.上樣反應(yīng)結(jié)束后取5μL反應(yīng)產(chǎn)物，加入1μL上樣緩沖液（6×loadingbuffer），用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

指示劑：溴酚藍(lán)Marker：DL2000。注意：加樣孔位于負(fù)極，DNA由負(fù)極向正極泳動(dòng)40~60°1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)4.電泳

電泳100V，10min左右。5.觀察凝膠成像系統(tǒng)或紫外燈下觀察結(jié)果

（手套拿取凝膠）1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)三、注意事項(xiàng)1、注意移液槍的正確使用方法。2、按順序逐一加入PCR反應(yīng)體系各組分，切勿遺漏。3、取用各組分時(shí)，應(yīng)避免污染和貼槍頭壁損失。4、按操作步驟正確設(shè)置使用PCR儀。5、帶手套操作實(shí)驗(yàn)。1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)四、影響PCR反應(yīng)的因素1、模板

任何來源的各種構(gòu)型的含量極低的DNA樣品都可作PCR的模板。

輕微的污染都會(huì)影響PCR的最終結(jié)果。2、脫氧核苷三磷酸（dNTPs）

4種dNTP在反應(yīng)中濃度應(yīng)相等，過高會(huì)抑制Taq酶活性，增加錯(cuò)配的幾率。

1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)3、引物(引物的好壞是整個(gè)PCR反應(yīng)的關(guān)鍵)引物濃度一般為0.1～0.5mmol/L，濃度太高，會(huì)增加非特異性擴(kuò)增，形成引物二聚體；濃度太低，影響擴(kuò)增效率和產(chǎn)率。*引物設(shè)計(jì)的原則長度15

～

30bpGC含量45

～

55%兩條引物退火溫度一致或接近，Tm差值小于5℃無連續(xù)核苷酸引物內(nèi)部及引物間無互補(bǔ)，以免形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)特異性的引物：特異性的產(chǎn)物1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)4、Mg2+濃度Mg2+是DNA聚合酶發(fā)揮作用的必須成分；最適濃度一般為0.5-2.5mmol/L,濃度過低則無法啟動(dòng)反應(yīng)，過高則影響產(chǎn)物特異性。

1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)5、TaqDNA聚合酶

具有5’→3’DNA聚合活性外，還具有5’→3’DNA外切活性。因此，在某些時(shí)候可選擇具有校讀活性的聚合酶例如Pfu；可以根據(jù)需要選擇擴(kuò)增長片段的Taq酶，高速擴(kuò)增的Taq酶等反應(yīng)終濃度以2～2.5U/100μl為最佳1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)五、問題分析1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)問題1：無擴(kuò)增產(chǎn)物現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無M樣品A樣品B正對(duì)照1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)純度：含有抑制物濃度：含量低質(zhì)量：全長結(jié)構(gòu)：二級(jí)結(jié)構(gòu)

原因?qū)Σ呒兓０寤蛘呤褂脙?yōu)質(zhì)試劑盒提取模板DNA加大模板的用量用好的反轉(zhuǎn)錄酶用溫度高的反轉(zhuǎn)錄酶(1)無擴(kuò)增產(chǎn)物之模板原因1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)引物錯(cuò)誤引物設(shè)計(jì)不好引物降解引物合成、純化不好

原因?qū)Σ吆铣汕皺z查評(píng)價(jià)、重新設(shè)計(jì)引物換一管新引物免費(fèi)重新合成(2)無擴(kuò)增產(chǎn)物之引物原因1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)退火溫度延伸時(shí)間循環(huán)次數(shù)

原因?qū)Σ哌f度PCR聚合酶的延伸速度適當(dāng)增加循環(huán)數(shù)(3)無擴(kuò)增產(chǎn)物之PCR條件原因1常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)

現(xiàn)象：條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致或者非特異性擴(kuò)增帶問題2：非特異性擴(kuò)增M121常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多

原因?qū)Σ咧匦略O(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少酶量降低鎂離子濃度適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法減少