生物技術(shù)制藥-課件

生物技術(shù)制藥

1醫(yī)學資源一、課程內(nèi)容第一章緒論第二章基因工程制藥第三章動物細胞工程制藥第四章抗體制藥第五章植物細胞工程制藥第六章酶工程制藥第七章發(fā)酵工程制藥

2醫(yī)學資源Chapter1緒論3醫(yī)學資源第一節(jié)生物技術(shù)的發(fā)展史一、生物技術(shù)（biotechnology）生物技術(shù)：以生命科學為基礎，利用生物體（或生物組織、細胞及其組分）的特性和功能，設計構(gòu)建具有預期性狀的新物種或新品系，并與工程相結(jié)合，利用這樣的新物種（或品系）進行加工生產(chǎn)，為社會提供商品和服務的一個綜合性的技術(shù)體系。包括基因工程、細胞工程、發(fā)酵工程、酶工程、生化工程以及后來衍生出來的第二代、第三代的蛋白質(zhì)工程、抗體工程、糖鏈工程和海洋生物技術(shù)等。4醫(yī)學資源⑴不可取代性（育種、制藥）⑵快速、精確（單克隆抗體檢測妊娠）⑶低耗、高效（生物酶催化：化學催化）⑷副產(chǎn)物少、副作用小、安全性好⑸高附加值性⑹符合生態(tài)型的經(jīng)濟技術(shù)發(fā)展體系生物技術(shù)的優(yōu)越性5醫(yī)學資源現(xiàn)代生物技術(shù)的基礎學科和分支分子生物學微生物學生物化學遺傳學細胞生物學化學工程

現(xiàn)代生物技術(shù)醫(yī)藥生物技術(shù)生物技術(shù)疫苗生物技術(shù)診斷農(nóng)業(yè)生物技術(shù)家畜生物技術(shù)海洋生物技術(shù)6醫(yī)學資源二、生物技術(shù)發(fā)展簡史傳統(tǒng)生物技術(shù)的技術(shù)特征是釀造技術(shù)公元前6000年古代巴比倫人釀造啤酒公元前4000年埃及人發(fā)酵面包我國殷朝制醬周朝制醋特點:自然發(fā)酵、全憑經(jīng)驗１傳統(tǒng)生物技術(shù)階段7醫(yī)學資源近代生物技術(shù)的技術(shù)特征是微生物發(fā)酵技術(shù)1674年荷蘭布商列文虎克自制了高倍顯微鏡(300倍左右)觀察到了微生物。1865年法國科學家巴斯德證明了發(fā)酵原理。1928年英國Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素1940年英國弗洛里、錢恩分離出青霉素２近代生物技術(shù)階段8醫(yī)學資源近代生物技術(shù)時期的特點：1.產(chǎn)品類型多

初級（氨基酸、酶、有機酸）；次級（抗生素）；生物轉(zhuǎn)化（甾體）等；2.生物技術(shù)要求高（純種、無菌、通氣、產(chǎn)品質(zhì)量要求也高）；3.生產(chǎn)設備規(guī)模巨大

500立方米，2000立方米

；4.技術(shù)發(fā)展速度快。

青霉素初期發(fā)酵效價為200U/ml,現(xiàn)在為80000U/ml。9醫(yī)學資源現(xiàn)代生物技術(shù)的技術(shù)特征就是以基因工程為首要標志1953年Watson、Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)1973年建立DNA重組技術(shù)（Boyer&Cohen，美國）1975年建立單克隆抗體技術(shù)（雜交瘤細胞）1978年大腸桿菌表達出胰島素1997年英國克隆多利羊３現(xiàn)代生物技術(shù)10醫(yī)學資源現(xiàn)代生物技術(shù)包括:⑴重組DNA技術(shù)⑵細胞和原生質(zhì)體融合技術(shù)⑶酶和細胞的固定化技術(shù)⑷植物脫毒和快速繁殖技術(shù)⑸動物和植物細胞的大量培養(yǎng)技術(shù)⑹動物胚胎工程技術(shù)11醫(yī)學資源⑻現(xiàn)代生物反應工程和分離工程技術(shù)⑼蛋白質(zhì)工程技術(shù)⑽海洋生物技術(shù)⑺現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)12醫(yī)學資源

不能忘記的人JDWatsonFHCCrick1953年4月25日，英國《自然》雜志發(fā)表了沃森和克立克的文章“核酸的分子結(jié)構(gòu)—DNA的一個結(jié)構(gòu)模型”。標志著DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的建立，從此，遺傳學和生物學的歷史從細胞階段進入了分子階段。13醫(yī)學資源

不能忘記的人FSangerWGilbert

Sanger（英國化學家）最早測定胰島素的氨基酸順序獲得1958年諾貝爾化獎。22年后，他因測定了一種噬菌體的一級結(jié)構(gòu)獲1980年的諾貝爾化學獎。

Gilbert在DNA測序領域，因其卓越的工作獲得1980年諾貝爾化學獎。14醫(yī)學資源

不能忘記的人

PaulBerg

Berg

（美國生物化學家）通過把兩個不同來源的DNA連結(jié)在一起并發(fā)揮其應有的生物學功能，證明了完全可以在體外對基因進行操作。他作為“重組DNA技術(shù)之父”于1980年獲諾貝爾化獎。15醫(yī)學資源

不能忘記的人KaryBMullis1985年穆利斯發(fā)明了高效復制DNA片段的聚和酶鏈式反應（PCR）技術(shù)，利用該技術(shù)可從極其微量的樣品中大量生產(chǎn)DNA分子，使基因工程獲得了革命性發(fā)展。16醫(yī)學資源第二節(jié)生物技術(shù)藥物生物技術(shù)制藥：生物技術(shù)藥物：生物藥物：采用現(xiàn)代生物技術(shù)，按照人的設想，借助動植物微生物來生產(chǎn)所需的醫(yī)藥品。一般來說,采用DNA重組技術(shù)或其他生物新技術(shù)研制的蛋白質(zhì)或核酸類藥物。生物技術(shù)藥物、生化藥物、微生物藥物、海洋藥物、生物制品的統(tǒng)稱。17醫(yī)學資源生物技術(shù)藥物分類重組蛋白質(zhì)藥物治療性抗體藥物核酸藥物干擾素、生長激素、胰島素、集落刺激因子等Panorex單抗用于結(jié)腸直腸炎治療Zenapax用于治療急性腎移植排斥反應反義核酸、核酶、脫氧核酶、抗基因寡核苷酸、裸DNA疫苗與基因藥物18醫(yī)學資源生物技術(shù)藥物的特性1.分子結(jié)構(gòu)復雜2.具有種屬特異性3.治療針對性強、療效高4.穩(wěn)定性差5.基因穩(wěn)定性6.免疫原性7.體內(nèi)的半衰期短8.受體效應9.多效性和網(wǎng)絡性效應10.檢驗的特殊性19醫(yī)學資源第三節(jié)生物技術(shù)制藥一、生物技術(shù)制藥的特征高技術(shù)高知識層次的人才和高新的技術(shù)手段高投入

一個新的生物醫(yī)藥的平均費用為1～3億美元，有的高達6億。高風險

成功率為5%－10%，研制時間卻需8－10年。高收益

利潤率回報可高達10倍,上市后2－3便可收回投資。20醫(yī)學資源二、生物技術(shù)在制藥中的應用1.基因工程制藥（1）基因工程藥物品種的開發(fā)生長激素抑制素1mg傳統(tǒng)法：10萬只羊的下丘腦，現(xiàn)：10L大腸桿菌培養(yǎng)液，0.3美元/mg（2）基因工程疫苗（3）基因工程抗體（4）基因診斷與基因治療21醫(yī)學資源（5）應用基因工程技術(shù)建立新藥的篩選模型（6）應用基因工程技術(shù)改良菌種，產(chǎn)生新的微生物藥物（7）基因工程技術(shù)在改進藥物生產(chǎn)工藝中的應用

將血紅蛋白基因克隆進菌種后可提高菌種對缺氧環(huán)境的耐受力。（8）利用轉(zhuǎn)基因動、植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物

人體蛋白AAT10萬美元/g，轉(zhuǎn)基因羊羊奶中20g/L22醫(yī)學資源2.細胞工程制藥（1）單克隆抗體技術(shù)（2）動物細胞培養(yǎng)（3）植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物3.酶工程制藥4.發(fā)酵工程制藥工藝改進、新藥研制和菌種改造23醫(yī)學資源三、我國生物技術(shù)制藥現(xiàn)狀和發(fā)展前景開始于20世紀70年代初，先是進行固定化酶的研究，以后固定化酶和固定化細胞的研究與應用得到發(fā)展。70年代后期，開始跟蹤國外基因工程技術(shù)的某些基礎性工作。80年代初期，開始乙型肝炎基因工程疫苗、基因工程干擾素的研究，生物技術(shù)方面的項目得到了國家的支持，其中-1b型干擾素為我國首創(chuàng)。24醫(yī)學資源目前我國生物制藥技術(shù)申報貌似“活躍”，實際上都是在圍繞僅有的幾個老品種進行改進或改制，完全創(chuàng)新技術(shù)很少。與發(fā)達國家相比，我國生物技術(shù)實驗室技術(shù)差距不大，但在產(chǎn)業(yè)化方面與世界的差距正在逐漸加大：當今世界有20多種暢銷生物藥時，我國能生產(chǎn)10種；而現(xiàn)在世界上有140多種時，我國卻只能生產(chǎn)20多種。由于我國醫(yī)藥生物技術(shù)成果缺乏自主知識產(chǎn)權(quán)，而目前我國生物制藥公司中技術(shù)和產(chǎn)業(yè)發(fā)展比較成熟的也僅有北京天壇生物、深圳康泰生物、深圳科興、長春金賽等少數(shù)幾家企業(yè)，產(chǎn)業(yè)規(guī)模較小；而一些傳統(tǒng)型的制藥企業(yè)由于受技術(shù)條件等影響而難以迅速進入生物制藥領域。25醫(yī)學資源醫(yī)藥生物技術(shù)發(fā)展展望

21世紀是醫(yī)藥生物技術(shù)快速發(fā)展的時期,生物制藥、化學藥物、中藥形成三足鼎立,有效的為人類健康服務。

1.利用新發(fā)現(xiàn)的人類基因開發(fā)新型藥物。人類基因組計劃已完成。1986年美國科學家達爾貝科提出的人類基因組計劃，1990年啟動該計劃。23對染色體30億對堿基，3.5萬個基因進行測序。美國承擔54%，英33%，日7%，法2.8%,德2.2%,中國1%。1999年中國加入人類基因組計劃，投資3億元，負責測定3號染色體3000萬對堿基，2000年4月完成。26醫(yī)學資源2.新型疫苗的研制

艾滋病疫苗和基因型癌疫苗等。

3.基因工程活性肽的生產(chǎn)

基因藥物:淋巴因子、生長因子、激素和酶

4.其它醫(yī)藥業(yè)將得到不斷改造和發(fā)展轉(zhuǎn)基因藥材（利用轉(zhuǎn)基因的煙草來生產(chǎn)人造血漿將成為現(xiàn)實）27醫(yī)學資源5.新型生物反應器和新型生物技術(shù)不斷出現(xiàn)

新型生物反應器有:

氣升式生物反應器流化床式生物反應器固定床式生物反應器袋式或膜式生物反應器中空纖維生物反應器等。28醫(yī)學資源四、我國的醫(yī)藥生物技術(shù)

已上市的基因工程藥物和疫苗

1995年白細胞介素-21996年α1b-干擾素α2a-干擾素

α2b-干擾素

1997年粒細胞集落因子紅細胞生成素

1992年乙型肝炎疫苗29醫(yī)學資源作業(yè)：1、生物技術(shù)制藥的概念。2、生物技術(shù)藥物分為哪些類型？3、生物技術(shù)制藥有哪些特征？30醫(yī)學資源31醫(yī)學資源Chapter2

基因工程制藥32醫(yī)學資源用途：主要用于癌癥、人類免疫缺陷病毒性疾病、心血管疾病、糖尿病、貧血和許多遺傳疾病的治療。獲取方式：生化提取基因工程表達

成本高產(chǎn)量低質(zhì)量難以保證成本低產(chǎn)量高活性強性質(zhì)優(yōu)實例：人生長激素（侏儒癥）50

具新鮮尸體腦下垂體中提取采用基因工程從1～2

升細菌培養(yǎng)液中提取獲得=33醫(yī)學資源1982年世界上第一個基因工程藥物―重組人胰島素獲準生產(chǎn)銷售，至今已有100多個生物技術(shù)藥物上市;促紅細胞生成素（EPO）以全球銷售額38億美元的業(yè)績，居全球最暢銷10種藥物的第6名；美國是現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)源地，一直穩(wěn)居生物技術(shù)藥物研發(fā)榜首,其2002年產(chǎn)值和銷售額已超過200億美元;1989年我國第一個擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因工程藥物--重組人干擾素（IFN–α1b）上市以來，目前，世界上銷售額排前10位的生物技術(shù)藥物我國已能生產(chǎn)8種。國際生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展動態(tài)34醫(yī)學資源第一節(jié)概述生物技術(shù)的核心就是基因工程，20世紀70年代基因工程誕生,最先應用在醫(yī)藥科學領域。傳統(tǒng)生物藥物由于來源及制備上的困難、價格等因素的影響，此外在制備過程可能受到的病毒、衣原體、支原體等的感染等問題，促使人們尋求安全、實用、療效可靠的新方法來制備生物藥物。（如：生長激素抑制素1mg傳統(tǒng)法：10萬只羊的下丘腦，現(xiàn)：10L大腸桿菌培養(yǎng)液，0.3美元/mg；尿激酶從男性尿中提??；胎盤丙種球蛋白從胎盤中提取。35醫(yī)學資源應用基因工程技術(shù)可十分方便且有效地解決傳統(tǒng)生物制藥所遇到的問題，從量、質(zhì)上都可以得到改進，且可以創(chuàng)造全新物質(zhì)。如今，癌癥、病毒性疾病、心血管疾病以及內(nèi)分泌等方面的預防、治療和診斷已可通過基因工程技術(shù)獲得。36醫(yī)學資源利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點：（1）可以大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽（如胰島素、干擾素、細胞因子等），為臨床使用提供有效的保障；（2）可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理、生化和結(jié)構(gòu)進行深入的研究，從而擴大這些物質(zhì)的應用范圍；（3）利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；37醫(yī)學資源（4）內(nèi)源性生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時存在的不足之處，可通過基因工程和蛋白質(zhì)工程進行改造和去除。如白細胞介素-2的半胱氨酸改為絲氨酸或丙氨酸，白細胞介素-2的活性以及熱穩(wěn)定性均有提高；（5）利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點：38醫(yī)學資源第二節(jié)基因工程藥物生產(chǎn)的過程

基因工程技術(shù)是將所要重組對象的目的基因插入載體、拼接、轉(zhuǎn)入新的宿主細胞，構(gòu)建成工程菌(或細胞），實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌(或細胞），內(nèi)進行復制和表達的技術(shù)。39醫(yī)學資源基因工程藥物生產(chǎn)的上游和下游上游階段：主要指的是目的基因分離、工程菌（或細胞）構(gòu)建。上游階段的工作主要在實驗室內(nèi)完成；下游階段：主要指的是從工程菌（或細胞）的大規(guī)模培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化、質(zhì)量控制等。40醫(yī)學資源獲得目的基因組建重組質(zhì)粒培養(yǎng)工程菌構(gòu)建基因工程菌或細胞產(chǎn)物分離純化除菌過濾半成品檢定包裝成品檢定基因工程藥物制備的一般過程41醫(yī)學資源基因工程基本過程切接轉(zhuǎn)增檢42醫(yī)學資源工程菌（或細胞）構(gòu)建中重要的工具工具：酶限制性內(nèi)切酶連接酶逆轉(zhuǎn)錄酶Klenow酶大片段（DNA聚合酶I）核酸酶S143醫(yī)學資源第三節(jié)目的基因的獲得

克隆真核基因常用方法：逆轉(zhuǎn)錄法和化學合成法。（不能直接分離？）一、逆轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進行cDNA的克隆表達。cDNA與模板mRNA序列嚴格互補，而不含內(nèi)含子。44醫(yī)學資源逆轉(zhuǎn)錄法的步驟

1、mRNA的純化

2、cDNA第一鏈的合成

3、cDNA第二鏈的合成

4、cDNA克隆

5、將重組體導入宿主細胞

6、cDNA文庫的鑒定

7、目的cDNA克隆的分離和鑒定45醫(yī)學資源cDNA克隆示意圖mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶ss-DNADNA聚合酶IKlenow片段ds-cDNAds-cDNA核酸酶S146醫(yī)學資源1、mRNA的純化真核細胞mRNA3’-polyA（20～250)采用OligodT-纖維素，以親和層析法將mRNA從細胞總RNA中分離出來。2、cDNA第一鏈的合成

可用寡聚dT作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，開始cDNA鏈的合成。47醫(yī)學資源3、cDNA第二鏈的合成除去cDNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈(堿解或RNaseH酶解)然后以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈。由于第一鏈cDNA鏈3’-末端往往形成一個發(fā)夾形結(jié)構(gòu)，所以，可以從這一點開始合成cDNA第二鏈(常用Klenow酶或DNA聚合酶I)切除發(fā)夾結(jié)構(gòu)（核酸酶S1，專一性切除單鏈DNA）48醫(yī)學資源4、cDNA克隆用于cDNA克隆的載體有三類：

細菌質(zhì)粒（如pBR322、pUC等）插入片段<10kb

噬菌體（如gt10、gt11等）>10kb

動植物病毒

根據(jù)重組后插入的cDNA能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì)非表達型載體（pBR322及gt10）表達型載體（pUC及gt11）有利于目的基因的篩選49醫(yī)學資源5、將重組體導入宿主細胞1、轉(zhuǎn)化：指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導入細菌的過程。

2、轉(zhuǎn)染：指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導入真核細胞的過程。

脂質(zhì)體介導：原生質(zhì)體融合：電穿孔：顯微注射：基因槍：病毒介導：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染：50醫(yī)學資源6、cDNA文庫的鑒定1、表型改變：

抗生素抗性（抗性基因失活和菌落或噬菌斑顏色改變）

a互補：報告基因：缺陷恢復：2、結(jié)構(gòu)特征：

DNA大?。好盖袌D譜：雜交（核酸、蛋白）：

PCR檢測：

DNA序列分析3、免疫化學檢測：表達產(chǎn)物分析51醫(yī)學資源7、目的cDNA克隆的分離和鑒定從cDNA文庫中分離特異的cDNA克隆，主要采用：（1）核酸探針雜交法。根據(jù)目的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，人工合成相應的單鏈寡核苷酸作為探針，從cDNA文庫中分離特異cDNA克隆。（2）免疫反應鑒定法。用表達型載體構(gòu)建的cDNA文庫，可用免疫學方法分組逐一鑒定各cDNA的表達產(chǎn)物，即以某種蛋白質(zhì)的抗體尋找相應的特異cDNA克隆。52醫(yī)學資源分離得到含有目的基因的陽性克隆后，必須對其作進一步的驗證和鑒定（限制酶圖譜、基因測序等）。

不需合成第二鏈mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶ss-DNAPCR特異引物目的cDNA鏈1985，PCR發(fā)明以后，RT-PCR得到了廣泛的應用。二、逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應法（RT-PCR）53醫(yī)學資源

三、化學合成法較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以用化學合成法合成。必須知道目的基因的核苷酸順序或目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序。人工化學合成的限制：一不能合成太長的基因，50～60bp；二是人工合成時，遺傳密碼的簡并性可導致中性突變；三是費用較高。54醫(yī)學資源第四節(jié)基因表達

基因表達：是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。

基因高效表達：將外源基因片段拼接到另一個基因表達體系中，使即獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達產(chǎn)物。

最佳的基因表達體系：生物活性高、表達產(chǎn)量高、表達產(chǎn)物穩(wěn)定、表達產(chǎn)物容易分離純化。55醫(yī)學資源一、宿主細胞的選擇

1、培養(yǎng)容易、生長快速：

2、容易獲得較高濃度的細胞：

3、能利用易得廉價原料：

4、不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素：

5、發(fā)熱量低、需氧低、適當?shù)陌l(fā)酵溫度：

6、容易進行DNA重組技術(shù)操作：

7、產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高：

8、產(chǎn)物容易提取純化：56醫(yī)學資源宿主細胞常用兩大類：

原核細胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等；

真核細胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。57醫(yī)學資源原核細胞⑴大腸桿菌：基因工程研究中采用最多的原核表達體系。

優(yōu)點：生長快速、代謝簡單、遺傳體系清楚、容易操作、細胞破碎容易。

缺點：①不存在導向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號序列，分泌能力不足，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難；②蛋白表達后不能修飾加工（糖基化等）；③產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個蛋氨酸殘基，能引起免疫反應；④內(nèi)毒素存留。58醫(yī)學資源⑵枯草芽胞桿菌：分泌能力強，蛋白質(zhì)不形成包含體。產(chǎn)物蛋白質(zhì)不能糖基化。有很強的胞外蛋白酶對產(chǎn)物降解。⑶鏈霉菌：作為外源性基因表達受到重視。不致病、使用安全、分泌能力強、表達產(chǎn)物可糖基化。59醫(yī)學資源真核細胞⑴酵母是研究基因表達最有效的單細胞真核微生物。其基因組小，世代時間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無毒性。能外分泌，產(chǎn)物可糖基化。已有不少真核基因成功表達。60醫(yī)學資源⑵絲狀真菌

優(yōu)點：分泌能力強，能正確進行翻譯后加工（肽剪切、糖基化）有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。⑶哺乳動物細胞

優(yōu)點：表達產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化細胞分泌到培養(yǎng)液中，純化容易。產(chǎn)物是糖基化的接近天然物。

缺點：生長慢，生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費用高，培養(yǎng)液濃度稀。61醫(yī)學資源二、大腸桿菌體系中的基因表達（一）表達載體表達載體必須具備的條件（1）載體能獨立地進行復制(復制起點，ori)（2）應具有靈活的克隆位點和方便的篩選標記，以利于外源基因的克隆、鑒定和篩選，且克隆位點位于啟動子序列后，以便外源基因表達。（3）應具有很強的啟動子，能為大腸桿菌的RNA聚合酶所識別。62醫(yī)學資源（4）應具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當誘導時才進行轉(zhuǎn)錄。外源基因的高效表達往往會抑制宿主細胞的生長、增殖，而阻遏子可使宿主細胞免除此不良影響（5）應具有很強的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄其他無關的基因，同時，很強的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。（6）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號，即起始密碼AUG和SD序列,以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。如：在大腸桿菌中表達非融合蛋白的操縱子必須改建成：細菌啟動子—細菌SD序列—起始密碼子—結(jié)構(gòu)基因—終止子。

63醫(yī)學資源常用表達載體pBV220系統(tǒng)

啟動子多克隆位點終止子阻遏子P23復制起始位點它已成功地表達了人白細胞介素2，γ干擾素和腫瘤壞死因子等外源基因。

氨芐青霉素抗性基因

限制性內(nèi)切酶

SD序列64醫(yī)學資源pBV220系統(tǒng)國內(nèi)使用最多的載體,其組成:①來源于pUC8多克隆位點②核糖體rrnB基因終止信號③pBR322第4225～3735位④pUC18第2066～680位⑤λ噬菌體cIts857阻遏子基因及PR啟動子⑥pRC23的PL啟動子及SD序列65醫(yī)學資源

pBV220系統(tǒng)優(yōu)點：

①cIts857阻遏子基因與PL啟動子同在一個載體上，可以轉(zhuǎn)化任何菌株，以便選用蛋白酶活性較低的宿主細胞，使表達產(chǎn)物不易降解。②SD序列緊跟多克隆位點，便于插入帶起始ATG的外源基因，可表達非融合蛋白；③強的轉(zhuǎn)錄終止信號可防止出現(xiàn)“通讀”現(xiàn)象，有利于質(zhì)粒-宿主系統(tǒng)的穩(wěn)定；66醫(yī)學資源④整個質(zhì)粒僅為3.66kb，有利于增加其拷貝數(shù)及容量，可以插入大片段外源基因；⑤PR和PL啟動子串聯(lián)，可以增強啟動作用；本系統(tǒng)為溫度誘導，外源基因表達量可達細胞總蛋白的20%～30%；產(chǎn)物以包含體形式存在不易降解均一性好。67醫(yī)學資源PR

和PL啟動子選用溫度敏感突變體cIts857的基因產(chǎn)物來調(diào)控PL、PR

啟動子的轉(zhuǎn)錄。

在較低溫度（30℃）時以活性形式存在

在較高溫度（42℃）時失活脫落

PL、PRcIts85768醫(yī)學資源PL

和PR表達系統(tǒng)存在的問題

PL和

PR表達系統(tǒng)誘導時不加化學誘導劑，成本又低廉。

缺陷1.在熱脈沖誘導過程中，大腸桿菌熱休克蛋白的表達也會被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表達的重組蛋白。2.在大體積發(fā)酵培養(yǎng)菌體時，通過熱平衡交換方式把培養(yǎng)溫度從30℃提高到42℃需要較長的時間，這種緩慢的升溫方式影響誘導效果，對重組蛋白表達量有一定的影響。3.pBV220系統(tǒng)表達的外源蛋白以包含體的形式存在，不易純化。69醫(yī)學資源

pBG-2是由pBV220系統(tǒng)衍生的便于產(chǎn)物純化的融合表達載體。該質(zhì)粒在PRPL啟動子下游插入G蛋白中與IgGFc段結(jié)合的結(jié)構(gòu)域基因片段180個核苷酸，下游是多克隆位點，引入了剪切融合蛋白的切點，具有與IgG結(jié)合的活性，可用親和層析。簡化下游工藝。pBG-270醫(yī)學資源（二）影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素

外源基因表達產(chǎn)量與細胞濃度和單個細胞平均表達產(chǎn)量呈正相關。單個細胞產(chǎn)量取決于：⑴外源基因的拷貝數(shù)質(zhì)粒的擴增過程通常發(fā)生在受體細胞的對數(shù)生長期內(nèi)，而此時正是細菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達勢必會影響受體細胞的生長代謝，進而導致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達水平的下降解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴增納入可控制的軌道71醫(yī)學資源⑵外源基因的表達效率外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理

啟動子終止子核糖體結(jié)合位點密碼子

轉(zhuǎn)錄翻譯72醫(yī)學資源

①啟動子和終止子的強弱；

大腸桿菌高效表達需要強的啟動子和終止子。外源基因在強啟動子的控制下表達，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達。

對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強其轉(zhuǎn)錄終止作用。

73醫(yī)學資源

外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關。

mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘端的結(jié)構(gòu)序列（消除二級結(jié)構(gòu)）所決定，稱為核糖體結(jié)合位點（RBS）。②核糖體結(jié)合位點的有效性74醫(yī)學資源③SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離

SD序列與起始密碼子AUG之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG

正好處于核糖體復合物結(jié)構(gòu)中的P位，這是翻譯啟動的前提條件。在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個堿基處，在此間隔中少一個堿基或多一個堿基，均會導致翻譯起始效率不同程度的降低。

75醫(yī)學資源由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細胞中獲得最佳表達：

外源基因全合成同步表達相關tRNA編碼基因④密碼子組成生物體對密碼子的偏愛性76醫(yī)學資源⑶表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性①組建融合蛋白；②利用大腸桿菌的信號肽或真核多肽中自身的信號肽；③采用位點突變的方法；④選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細胞，可能會減弱表達產(chǎn)物的降解。77醫(yī)學資源⑷細胞代謝負荷①宿主細胞的生長與重組質(zhì)粒的復制分開②細胞的生長和外源基因的表達分成兩個階段⑸工程菌的培養(yǎng)條件

除宿主、載體和克隆基因三者之間的關系影響外源基因的高水平表達外，培養(yǎng)條件亦是非常值得研究的因素。以后會對其進行詳細的介紹。78醫(yī)學資源（三）真核基因在大腸桿菌中的表達形式

⑴以融合蛋白的形式表達藥物基因以原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起稱融合蛋白。優(yōu)點：操作簡便，表達蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實現(xiàn)高效表達；缺點：只能作抗原用。79醫(yī)學資源

⑵以非融合蛋白的形式表達藥物基因

非融合蛋白指在大腸桿菌中表達的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細菌多肽序列。

優(yōu)點：保持原有蛋白活性；

缺點：易被蛋白酶破壞。80醫(yī)學資源⑶分泌型表達蛋白藥物基因

優(yōu)點：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不含蛋氨酸殘基；

缺點：產(chǎn)量不高，信號肽不被切割。81醫(yī)學資源三、酵母中的基因表達（一）表達載體

酵母載體是可以攜帶外源基因在酵母細胞內(nèi)保存和復制，并隨酵母分裂傳遞到子代細胞的DNA或RNA單位。1.載體的復制序列

①酵母附加體質(zhì)粒（yeastepisomalplasmid，Yep類）②酵母復制型質(zhì)粒（yeastreplicationplasmid，Ypp類）③酵母著絲粒質(zhì)粒（yeastcentromericplasmid，YCp類）④酵母整合型質(zhì)粒（yeastinteegrativeplasmid，YIp類）

82醫(yī)學資源

(1)克隆載體

從大腸桿菌中制備質(zhì)粒比從酵母中容易得多，因此酵母質(zhì)粒的加工和制備大部分是通過大腸桿菌進行的，只有在最后階段才轉(zhuǎn)入酵母中，這就要求酵母載體也同時具有在大腸桿菌中復制和增殖的能力。

(2)表達載體

將酵母菌的啟動子和終止子等有關控制序列引入載體的適當位點后，就構(gòu)成了酵母菌的表達載體。83醫(yī)學資源①普通表達載體，只能方便地引入外源基因并進行表達，對表達產(chǎn)物的組成，特別是對其N末端氨基酸是否增減并無嚴格要求。②精確表達載體，要求在啟動子或信號肽編碼序列的適當部位有內(nèi)切酶點，以利于接入外源基因，并使他在表達后加工后N末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無多余的氨基酸，也無缺失的氨基酸。84醫(yī)學資源⒉影響目的基因在酵母菌中表達的因素⑴外源基因的劑量

高穩(wěn)定的高拷貝數(shù)的質(zhì)?？墒雇庠椿蚋咝П磉_，但高拷貝數(shù)通常會引起細胞生長量的降低；而單拷貝數(shù)的質(zhì)粒對細胞的最大生長沒有影響，因而也能達到高效表達。⑵外源基因的表達效率

①啟動子(組成型和誘導型)

②分泌信號的效率

③終止序列的影響

外源基因表達產(chǎn)量與細胞濃度和單個細胞平均表達產(chǎn)量呈正相關。單個細胞產(chǎn)量取決于：85醫(yī)學資源⑶外源蛋白的糖基化

外源蛋白經(jīng)釀酒酵母糖基化后，可靠有效地以活性型分泌到培養(yǎng)基中；某些蛋白質(zhì)糖基化后更加穩(wěn)定，便于分離精制。⑷宿主菌株的影響

①菌體生長力強②菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱③菌體性能穩(wěn)定常用的幾乎是突變株，避免使用回復突變率高的不穩(wěn)定體系；最好使用二倍體或多倍體菌株；④分泌能力強(5)培養(yǎng)條件86醫(yī)學資源四、動物中的基因表達優(yōu)點：產(chǎn)物類似于天然產(chǎn)物，容易分離純化缺點：動物細胞生長慢，培養(yǎng)條件苛刻，費用高培養(yǎng)液濃度較小。87醫(yī)學資源主要基因工程表達體系比較表達體系產(chǎn)物產(chǎn)生部位培養(yǎng)方式提純產(chǎn)物活性潛在危性大腸桿菌多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易一般對原核好不大融合蛋白質(zhì)部分高產(chǎn)對真核差酵母多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易菌體內(nèi)真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高產(chǎn)稍復雜天然產(chǎn)物哺乳動物完整外分泌較難成本高簡單可達天然需注意糖基化蛋白可高產(chǎn)產(chǎn)物致癌88醫(yī)學資源第五節(jié)基因工程菌生長代謝的特點

菌體的生長通常用比生長速率來表示。

比生長速率:菌體生長速率與培養(yǎng)基中菌體濃度之比。工程菌培養(yǎng)可通過選用不同的碳源、控制補料和稀釋速率等方法來控制菌體的生長?？刂凭w的生長對提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物積累、提高外源蛋白產(chǎn)率有重要意義。89醫(yī)學資源

大腸桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒定的，因而菌體的生長速度反映了蛋白質(zhì)的合成速度。培養(yǎng)條件的改變，都會改變菌體的能量代謝和小分子前體的供應，影響生物大分子的和成和菌體的生長。90醫(yī)學資源一、菌體的生長與能量的關系

碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。

碳源物質(zhì)為細胞提供能量，當菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時，菌體會產(chǎn)生乙酸，導致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長。適當提高pH，可減少乙酸的抑制作用91醫(yī)學資源

分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生。92醫(yī)學資源

大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的透明顫菌血紅蛋白（VHB蛋白）的基因可提高菌體生長速率。采用磷酸乙?；溉毕葜曜鳛樗拗骷毎?，阻止乙酰輔酶A

乙酸產(chǎn)生，可提高產(chǎn)量。93醫(yī)學資源二、菌體生長與前體供應的關系

在基礎培養(yǎng)基中加入氨基酸（小分子前體）能使菌體蛋白合成增加，比生長率提高。

基因工程菌質(zhì)粒的表達需與宿主細胞競爭共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，致工程菌生長速率降低。94醫(yī)學資源質(zhì)粒存在對菌體代謝的影響：

中等拷貝質(zhì)粒（56拷貝）的工程菌中與前體合成有關的酶增加，其質(zhì)粒對工程菌的生長影響不大。

高拷貝質(zhì)粒的工程菌（240拷貝），生長速率和菌體總蛋白合成均減少。這與工程菌大量前體被利用引起前體不足，從而產(chǎn)生“嚴緊反應”有關。

95醫(yī)學資源嚴緊反應當細菌發(fā)現(xiàn)它們處于很差的生長環(huán)境，沒有足夠的氨基酸來維持蛋白質(zhì)合成時，它們就會停止大部分活動，這種現(xiàn)象稱為嚴緊反應。嚴緊反應產(chǎn)生兩種非正常的核酸堆積物，即ppGpp和pppGpp，統(tǒng)稱(P)PPGPP。96醫(yī)學資源嚴緊反應機制

產(chǎn)生鳥苷四磷酸鳥苷五磷酸激活核糖體RelA蛋白（嚴緊因子）抑制rRNA基因表達核糖體與mRNA結(jié)合抑制其翻譯氨基酸饑餓

GTPATP97醫(yī)學資源

(p)ppGpp的產(chǎn)生機制應急因子RelA是一種(p)ppGpp合成酶，約與5%的核糖體結(jié)合在一起。當核糖體A位被空載tRNA占據(jù)時，RelA被激活。一個空載tRNA進入A位就生成一個(p)ppGpp98醫(yī)學資源

(p)ppGpp的作用應急應答使得rRNA和tRNA的合成量大幅減少（10-20%），一些mRNA的合成也減少（1/3）。蛋白質(zhì)的降解速率增加，許多代謝調(diào)節(jié)作用開始發(fā)生。99醫(yī)學資源基因工程菌的不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：一、質(zhì)粒的不穩(wěn)定性

分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。

結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。第六節(jié)基因工程菌的不穩(wěn)定性100醫(yī)學資源影響質(zhì)粒分裂不穩(wěn)定的因素：⑴含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；⑵這兩種菌比生長速度率差異的大小。

101醫(yī)學資源質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法樣品不含抗性標記抗生素

平板培養(yǎng)基10-12h100個菌落含抗性標記抗生素平板培養(yǎng)基

10-12h統(tǒng)計生長菌落數(shù)重復三次,計算比值

(穩(wěn)定性stability)102醫(yī)學資源二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法1.選擇合適的宿主菌受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解2.選擇合適的載體低拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率高，增加工程菌質(zhì)?？截悢?shù)可提高穩(wěn)定性；

高拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率低，但如果提高質(zhì)粒拷貝數(shù)，可能抑制菌體生長，對穩(wěn)定性不利。103醫(yī)學資源3.施加選擇壓力

根據(jù)載體上的抗藥性標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應的抗生素

藥物和食品生產(chǎn)時禁止使用抗生素

加入大量的抗生素會使生產(chǎn)成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素，只能維持一定時間添加抗生素選擇壓力對質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定無能為力載體上的營養(yǎng)缺陷型標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應的營養(yǎng)組份培養(yǎng)基復雜，成本較高104醫(yī)學資源4.分階段控制培養(yǎng)

因外源基因表達造成質(zhì)粒不穩(wěn)定時，可以考慮將發(fā)酵過程分階段控制。在生長階段使外源基因處于阻遏狀態(tài)，避免因表達造成不穩(wěn)定性問題的發(fā)生；在獲得需要的菌體密度后，再去阻遏或誘導外源基因表達。連續(xù)培養(yǎng)時可以考慮采用多級培養(yǎng)，如在第一級進行生長，維持菌體的穩(wěn)定性，在第二級進行表達。105醫(yī)學資源5.控制培養(yǎng)條件

工程菌的培養(yǎng)條件對其質(zhì)粒的穩(wěn)定性和表達效率影響很大可調(diào)控的環(huán)境參數(shù)為：培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)溫度、pH和溶解氧濃度。有些含質(zhì)粒的菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒的菌反應慢，因而采用間隙改變培養(yǎng)條件的方法以改變這兩種菌的比生長速率，從而改善質(zhì)粒的穩(wěn)定性。通過間隙供氧的方法和通過改變稀釋速率的方法都可提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定

培養(yǎng)溫度：較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定106醫(yī)學資源

6.固定化

固定化可以提高基因重組大腸桿菌的穩(wěn)定性

基因重組大腸桿菌進行固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性及目的產(chǎn)物的表達率都有了很大提高。在游離重組菌系統(tǒng)中常用抗生素，氨基酸等選擇性壓力穩(wěn)定質(zhì)粒的手段，往往在大規(guī)模生產(chǎn)中難以應用。而采用固定化方法后，這種選擇壓力則可被省去。不同的宿主菌及質(zhì)粒在固定化系統(tǒng)中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。107醫(yī)學資源中試是上游技術(shù)與工業(yè)化生產(chǎn)的連接環(huán)節(jié)，其目的在于考察一個上游構(gòu)建成功的重組菌種是否適合未來的產(chǎn)業(yè)化。另外，通過中試還可以獲得大量的產(chǎn)品供臨床試驗，同時中試所得的相關培養(yǎng)、發(fā)酵、純化等工藝參數(shù)可以做為生產(chǎn)設計時的參考。

第七節(jié)基因工程菌的中試108醫(yī)學資源中試應考慮的問題：工程菌是否適宜商品化發(fā)酵反應器設計反應過程選擇發(fā)酵培養(yǎng)條件生產(chǎn)工藝最佳方法優(yōu)化工藝監(jiān)測方法工藝控制方法工藝自動化使用方法生物催化劑使用方法（如果有的話）產(chǎn)品提取方法分離精制技術(shù)等。109醫(yī)學資源一、工程菌選擇：

用于中試的工程菌需具備的條件：

1、能用一般基因重組技術(shù)獲得

2、有高產(chǎn)潛力

3、能以工業(yè)原料為培養(yǎng)基，主要是碳源

4、生產(chǎn)工藝不復雜，能一般化

5、能產(chǎn)生和分泌蛋白質(zhì)（細胞外分泌）

6、不致病、無毒性

7、能安全生產(chǎn)、符合國家衛(wèi)生部門規(guī)定

8、代謝可控性，產(chǎn)品有特異性

9、發(fā)酵液粘度小等110醫(yī)學資源二、反應器（發(fā)酵罐）設計

符合生物反應和化學工程需要。設計基礎：5種生物數(shù)據(jù)－培養(yǎng)細胞系特性、細胞生長率、發(fā)酵罐消毒方法、溫度pH溶氧二氧化碳及代謝產(chǎn)物、后處理效果。設計中應考慮的問題：根據(jù)實驗條件需要，能連續(xù)發(fā)酵（也可分批發(fā)酵），并附有加料管取料管及測量儀表，易安裝及移動，儀表所得數(shù)據(jù)可靠，數(shù)據(jù)重復性好，可任意安裝附件，罐體材質(zhì)好并打光，避免殘渣積存。111醫(yī)學資源三、發(fā)酵培養(yǎng)基組成：

1、化學元素：細胞生長必需的碳、氮、氧、氫、磷及一些微量元素和金屬離子。

2、特殊營養(yǎng)源：氨基酸、維生素等。

3、能源：葡萄糖等。

4、代謝控制物：生物活性物質(zhì)，或者改變溫度、pH值、誘導菌種改變生長速度或代謝途徑等，目的為增加產(chǎn)量。注意：工業(yè)化生產(chǎn)用培養(yǎng)基以工業(yè)原料為主，以降低生產(chǎn)成本，所以中試時就要進行培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件探索。112醫(yī)學資源四、工藝最佳化與參數(shù)監(jiān)測控制

1、工藝最佳化：指最快周期、最高產(chǎn)量、最好質(zhì)量、最低能耗、最大安全性、最周全的廢物處理效果、最佳化速度、最低失敗率等。只有在掌握菌種生物特性和發(fā)酵工藝參數(shù)了如指掌，才能設計出最佳生產(chǎn)工藝。

2、參數(shù)監(jiān)測控制：四種需要監(jiān)測的參數(shù)主要參數(shù)－pH、溫度、溶氧、二氧化碳生物量－渾濁度、細胞組分、總氮量及菌絲干重。碳源－糖、有機酸、乙醇、淀粉、脂質(zhì)產(chǎn)品－形成時間、形式、性狀等全自動化控制

113醫(yī)學資源五、計算機的應用：全自動化控制的基礎

熱電耦電極－－溫度離子敏感電極－離子

pH電極－－－－pH

氧化還原電極－還原電位熱量計－－－－熱平衡可以儲存于計算機－通過計算機計算、對比、優(yōu)化選擇－提高產(chǎn)品產(chǎn)量與質(zhì)量、降低原材料與能源消耗、降低成本－最終模擬出一個高產(chǎn)、高質(zhì)、低成本生產(chǎn)工藝最佳化的控制微生物數(shù)學公式并實際運用。114醫(yī)學資源

培養(yǎng)工藝是發(fā)酵工藝的重要組成部分，對外源蛋白的表達至關重要，直接影響產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，從而影響產(chǎn)品成本及市場競爭力。最佳的培養(yǎng)工藝還要考慮對純化工藝的影響。第八節(jié)基因工程菌的培養(yǎng)115醫(yī)學資源一、基因工程菌的培養(yǎng)方式：

1、分批培養(yǎng)：培養(yǎng)基的量一次性加入，產(chǎn)品一次性收獲,分批培養(yǎng)操作簡單，但因不能控制生長，獲得的菌體密度也有限。

2、補料分批培養(yǎng)：在一次投料發(fā)酵的基礎上，流加一定量的營養(yǎng)，使細胞進一步的生長，可得到更多的代謝產(chǎn)物。

3、連續(xù)培養(yǎng)：不斷地流加營養(yǎng)，并不斷地取出發(fā)酵液。連續(xù)培養(yǎng)則多用于動力學特性和穩(wěn)定性等研究。

4、透析培養(yǎng)：

5、固定化培養(yǎng)：116醫(yī)學資源補料分批培養(yǎng)

補料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應器中進行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的培養(yǎng)方法。在分批培養(yǎng)中，為保持基因工程菌生長所需的良好微環(huán)境，延長其生長對數(shù)期，獲得高密度菌體，通常把溶氧控制和流加補料措施結(jié)合起來，根據(jù)基因工程菌的生長規(guī)律來調(diào)節(jié)補料的流加速率?；蚬こ叹囵B(yǎng)方式117醫(yī)學資源連續(xù)培養(yǎng)

連續(xù)培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應器中，攪拌培養(yǎng)至菌體濃度達到一定程度后，開動進料和出料蠕動泵，以一定稀釋率進行不間斷培養(yǎng)。但是由于基因工程菌的不穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)比較困難。為了解決這一問題，人們將工程菌的生長階段和基因表達階段分開，進行兩階段連續(xù)培養(yǎng)。基因工程菌培養(yǎng)方式118醫(yī)學資源透析培養(yǎng)

透析培養(yǎng)技術(shù)是利用膜的半透性原理使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離，其主要目的是通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌的不利影響?；蚬こ叹囵B(yǎng)方式發(fā)酵液透析過的發(fā)酵液透析膜乙酸養(yǎng)分代謝產(chǎn)物119醫(yī)學資源固定化培養(yǎng)

基因工程菌培養(yǎng)的一大難題是如何維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。有人將固定化技術(shù)應用到這一領域，發(fā)現(xiàn)基因工程菌經(jīng)固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高，便于進行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對分泌型菌更為有利。由于這一優(yōu)點，基因工程菌固定化培養(yǎng)研究已得到迅速開展。基因工程菌的培養(yǎng)方式120醫(yī)學資源二、選擇培養(yǎng)方式必須考慮的因素：

1、培養(yǎng)基

2、溶解氧

3、溫度

4、pH5、蛋白表達相關因素－表達時機、表達程序等121醫(yī)學資源三、基因工程菌的培養(yǎng)設備基因工程菌培養(yǎng)是為了獲得最大量的基因表達產(chǎn)物。由于這類物質(zhì)是相對獨立于細胞染色體之外的重組質(zhì)粒上的外源基因所合成的、細胞并不需要的蛋白質(zhì)，因此，培養(yǎng)設備以及設備控制應滿足獲得高濃度的受體細胞和高效的表達基因產(chǎn)物。

122醫(yī)學資源發(fā)酵罐的組成部分有：

發(fā)酵罐體保證高傳質(zhì)作用的攪拌器、精細的溫度控制和滅菌系統(tǒng)、空氣無菌過濾裝置殘留氣體處理裝置參數(shù)測量與控制系統(tǒng)（如pH、O2、CO2

等）培養(yǎng)液配制及連續(xù)操作裝置等。

基因工程菌的培養(yǎng)設備123醫(yī)學資源基因工程菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中要求

環(huán)境條件恒定，不影響其遺傳特性，更不能引起所帶質(zhì)粒丟失。對發(fā)酵罐有特殊要求

如要提供菌體生長的最適條件培養(yǎng)過程不得污染保證純菌培養(yǎng)培養(yǎng)及消毒過程中不得游離出異物，干擾細菌代謝活動基因工程菌的培養(yǎng)設備124醫(yī)學資源1.發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)材料的穩(wěn)定性要好，一般要應用不銹鋼制成2.罐體表面光滑易清洗，滅菌時沒有死角3.所有的連接接口均要用密封圈封閉，不留“死腔”，不得有泄漏4.發(fā)酵罐的排氣口須有蒸汽滅菌或微孔濾器除菌后才將廢氣放出。5.攪拌器轉(zhuǎn)速和通氣應適當6.與發(fā)酵罐連接的閥門要用膜式閥，不用球形閥7.空氣過濾系統(tǒng)要采用活性碳和玻璃纖維棉材料8.培養(yǎng)液要經(jīng)化學處理或熱處理后才可排放9.軸封可采用磁力攪拌或雙端面密封基因工程菌的培養(yǎng)設備125醫(yī)學資源

第十節(jié)

基因工程藥物的分離純化基因工程藥物大部分為多肽或蛋白質(zhì)，其分離、純化非常重要。特點：①目的產(chǎn)物在初始物料中含量較低；②含有大量細胞及代謝產(chǎn)物；③表達產(chǎn)物穩(wěn)定性差，易失活變性；④表達產(chǎn)物的種類繁多、結(jié)構(gòu)不一；⑤成品要求純度高、無菌、無熱原。126醫(yī)學資源一、建立分離純化工藝的依據(jù)⒈含目的產(chǎn)物的起始物料的特點基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物其上游過程的各種因素對分離、純化工藝有影響。包括：

①菌種的類型及其代謝特性。

②原材料和培養(yǎng)基的來源及其質(zhì)量。

③生產(chǎn)工藝及條件。

④初始物料的物理、化學、生物學性質(zhì)

⒉物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)⒊目的產(chǎn)物特性⒋產(chǎn)品質(zhì)量的要求127醫(yī)學資源二、分離純化的基本過程

發(fā)酵液細胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細胞破碎固液分離

可溶性蛋白包含體細胞碎片分離變性復性濃縮初步分離

高度純化

制劑產(chǎn)品128醫(yī)學資源三、分離純化的技術(shù)分離純化的技術(shù)要求：①技術(shù)條件溫和能保持產(chǎn)物生物活性。②選擇性好，能從復雜的混合物中有效的將目的產(chǎn)物分離，達到較高的純化倍數(shù)。③收率高、成本低。④兩個技術(shù)間能直接銜接，不需要對物料加以處理。⑤純化過程要快，滿足高生產(chǎn)率的要求。129醫(yī)學資源⒈細胞破碎與固液分離

⑴細胞收集：離心法、生物膜分離法。⑵細胞破碎：是否加外力：機械破碎法、非機械破碎法。所用方法屬性：物理法、化學法、生物法。⑶固液分離：高速離心、膜過濾、雙相萃取130醫(yī)學資源

目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進行分離純化。蛋白質(zhì)分離純化方法的設計根據(jù)其分子的理化性質(zhì)和生物學特性來決定。

五、重組蛋白的分離純化131醫(yī)學資源產(chǎn)物特性作用等電點決定離子交換種類及條件相對分子量選擇不同孔徑的介質(zhì)疏水性與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度生物特異性決定親和配基溶解性決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性決定工藝采用溫度及流程時間

產(chǎn)物的特性：分離純化方法132醫(yī)學資源層析(chromatography)

A離子交換層析

B疏水層析

C親和層析

D凝膠過濾層析

133醫(yī)學資源A離子交換層析離子交換層析的基本原理離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)離子交換介質(zhì)的選擇原則

外源基因表達產(chǎn)物的分離純化方法134醫(yī)學資源離子交換層析的基本原理

離子交換層析是以離子交換劑為固定相，以特定的含離子溶液為流動相，利用離子交換劑對待分離的各種離子結(jié)合力的差異，而將混合物中不同離子進行分離的層析技術(shù)。

135醫(yī)學資源↙共價結(jié)合平衡離子離子交換劑，通常是一種不溶性高分子化合物如纖維素，葡聚糖，瓊脂糖等；離子交換劑中所含的可解離基團在水溶液中能與溶液中的其它陽離子或陰離子起交換作用。離子交換劑－－－－136醫(yī)學資源陽離子交換劑：強酸型和弱酸型可電離的基團磺酸基（-SO3H）磷酸基（-PO3H2）羧酸基（-COOH）酚羥基（-OH）陰離子交換劑：強堿型和弱堿型可電離的基團 伯胺基（-NH2）仲胺基（-NHCH3

）叔胺基（-N(CH3)2）季胺基（-N+(CH3)3

）離子交換劑的分類137醫(yī)學資源常用的離子交換劑離子交換纖維素：

離子交換纖維素是攜帶功能基團纖維素衍生物，具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及較大的表面積，大分子可以自由通過，因而對生物大分子（如蛋白質(zhì)）的交換容量比離子交換樹脂大。陽離子型離子交換纖維素包括羥甲基纖維素（CM纖維素）等陰離子型離子交換纖維素包括二乙基氨基乙基纖維素（DEAE纖維素）138醫(yī)學資源常用的離子交換劑離子交換葡聚糖：

離子交換葡聚糖是葡聚糖經(jīng)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)后形成的具有多孔三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和離子交換功能基團的多糖衍生物（SephadexG）。常用的離子交換葡聚糖包括：

陽離子交換劑

CM-SephadexC-25CM-SephadexC-50

陰離子交換劑

DEAE-SephadexA-25DEAE-SephadexA-50139醫(yī)學資源常用的離子交換劑離子交換瓊脂糖：離子交換瓊脂糖是攜帶DEAE或CM基團的SepharoseCL-6B

DEAE-Sepharose（陰離子型）和CM-Sepharose（陽離子型）的離子交換介質(zhì)具有硬度大、性質(zhì)穩(wěn)定，流速好，分離能力強等優(yōu)點。140醫(yī)學資源離子交換介質(zhì)的選擇原則一般而言：酸性物質(zhì)用陰離子交換劑分離

堿性物質(zhì)用陽離子交換劑分離氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)，可根據(jù)其pI值及離子化曲線來選擇141醫(yī)學資源離子交換介質(zhì)的選擇原則12346789105pH+-蛋白質(zhì)凈電荷等電點吸附陰離子交換劑吸附陽離子交換劑pH<pI（+）pH=pI（0）pH>pI（-）

對pI=5的某酸性蛋白質(zhì)當pH5.5-9.0的范圍內(nèi)時，蛋白質(zhì)為陰離子，應首選DEAE纖維素；當pH3.5-4.5的范圍內(nèi)時，蛋白質(zhì)為陽離子，應首選CM纖維素142醫(yī)學資源B疏水層析

疏水層析（HIC）是根據(jù)分子表面疏水性差別來分離蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法。疏水性弱的物質(zhì)，在較高離子強度的溶液時被洗脫下來，當離子強度降低時，疏水性強的物質(zhì)才隨后被洗脫下來。

143醫(yī)學資源疏水配基

烷基鏈配基芳基配基

高分子配基

144醫(yī)學資源疏水基質(zhì)人工合成聚合物類瓊脂糖纖維素聚苯乙烯聚丙烯酸甲酯類多糖類殼聚糖

應用最廣泛

良好的生物相容性和化學穩(wěn)定性

145醫(yī)學資源基本操作

平衡Equilibration上樣

Sampleapplication洗雜Washing洗脫Elution146醫(yī)學資源

C親和層析親和層析的原理親和層析載體的性質(zhì)與選擇親和層析配基的性質(zhì)與選擇147醫(yī)學資源親和層析的原理親和層析：利用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用。配基：在親和層析中起可逆性結(jié)合的特異性物質(zhì)。載體：與配基結(jié)合的支撐物。148醫(yī)學資源親和層析的特點：1.純化過程簡單、迅速，且分離效率高；2.特別適用于分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子;3.純化倍數(shù)大，產(chǎn)物純度高;4.必須針對某一分離對象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件,因此應用范圍受到一定的限制。149醫(yī)學資源常用的親和層析載體纖維素葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠其它新型載體150醫(yī)學資源親和層析配基的選擇：

純化對象和配基之間必須有較強的親和力。但親和力太高也是有害的，因為在解離配基復合物時所需的條件就要強烈，這樣可能使生物分子變性配基必須具有適當?shù)幕瘜W基團，這種基團不參與配基與生物分子之間特異結(jié)合，但可用于和載體相連，同時又不影響配基與生物分子之間的親和力。151醫(yī)學資源D凝膠層析凝膠層析的基本原理凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì)凝膠介質(zhì)的選用原則152醫(yī)學資源凝膠層析的基本原理

凝膠過濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動，而大分子不能進入孔內(nèi)，快速移動，利用這種移動差別可使大分子與小分子分開。

根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子量和蛋白質(zhì)分子的動力學體積的大小差異，可以利用凝膠過濾來分離純化目的蛋白。153醫(yī)學資源常用的凝膠葡聚糖凝膠（Sephadex）

葡聚糖凝膠的種類有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。G表示葡聚糖，G后面的阿拉伯數(shù)為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克。G值越小，交聯(lián)度越大，吸水性越小。

SephadexLH是羥丙基化的Sephadex，這類層析介質(zhì)的流動相既可使用緩沖水溶液，也可使用極性有機溶劑，因此適用于非水溶性溶質(zhì)的凝膠過濾。154醫(yī)學資源常用的凝膠瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠是由瓊脂中分離出來的天然凝膠，常見的有Sepharose和Bio-Gel-A等。瓊脂糖凝膠是一種大孔凝膠，因而適合于分離分子量較大的生物大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)和DNA）。

155醫(yī)學資源常用的凝膠聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠是一種以丙烯酰胺為單位由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成的人工合成凝膠，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號的凝膠，交聯(lián)劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品名為Bio-Gel，型號從P-2至P-300共10種（數(shù)字X1000就相當于該凝膠的排阻限度）156醫(yī)學資源E膜分離膜分離的基本原理分離膜的主要性能影響膜分離的因素157醫(yī)學資源膜分離的基本原理膜分離的基本定義膜分離是利用膜的選擇性，以膜的兩側(cè)存在一定量的能量差作為推動力，由于溶液中各組分透過膜的遷移速率不同而實現(xiàn)的分離。158醫(yī)學資源膜分離的基本原理膜分離的主要類型透析（DialysisDS）反滲透（ReverseosmosisRO）超濾（UitrfiltrationUF）微濾（MicrofitrationMF）電滲析（ElectrodialysisEI）159醫(yī)學資源透析（DialysisDS）利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。160醫(yī)學資源分離膜的基本性能膜的分類按膜的孔徑大小分類：微濾膜 0.025-14mm

超濾膜 0.001-0.02mm

反滲透膜 0.0001-0.001mm

納米過濾膜 平均孔徑2nm161醫(yī)學資源分離膜的基本性能膜的分類按膜的孔徑大小分類：天然高分子膜醋酸纖維素、硝酸纖維素、再生纖維素合成聚合物膜聚砜、聚酰胺、聚烯、含氟聚合物無機材料膜陶瓷、微孔玻璃、不銹鋼、碳素162醫(yī)學資源蛋白質(zhì)的其它純化方法：

離心、鹽析、有機溶劑沉淀、等電點沉淀雙水相萃取、結(jié)晶，等。

注意：一種方法很難達到完全純化或者產(chǎn)物符合標準，要聯(lián)合幾種方法。163醫(yī)學資源六、非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除⑴DNA的去除：DNA在pH4.0以上呈陰離子，蛋白質(zhì)的pI在6.0以上,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質(zhì)為強酸性，可選擇條件使其吸附在陽離子交換劑上，而DNA不吸附。親和層析和疏水層析也有效。⑵熱原質(zhì)的去除：熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素（脂多糖）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質(zhì)中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。⑶病毒的去除：層析或過濾可將病毒去除。164醫(yī)學資源七、選擇分離純化方法的依據(jù)

⒈根據(jù)產(chǎn)物表達形式來選擇

&:分泌型表達產(chǎn)物的發(fā)酵液體積很大但濃度較低純化前必須濃縮可用沉淀和超濾法。

&:周質(zhì)表達為了獲得周質(zhì)蛋白，經(jīng)低濃度溶菌酶處理后,可采用滲透壓休克的方法來獲得。165醫(yī)學資源&:可溶性表達產(chǎn)物破菌后的細胞上清，首選親和分離方法，或離子交換層析。&:不可溶性表達包含體對蛋白質(zhì)分離純化有兩方面的影響，一是它可以很容易地與胞內(nèi)可溶性蛋白雜質(zhì)分離，蛋白純化較容易完成，另一方面產(chǎn)物經(jīng)過了一個變性復性過程，較易形成產(chǎn)物的錯誤折疊和聚合體。166醫(yī)學資源⒉根據(jù)分離單元之間的銜接選擇

在進行重組蛋白的純化時，通常需要綜合使用多種技術(shù)，一般來說，在選擇分離純化方法時應遵循下列原則：應選擇不同分離純化機理的方法聯(lián)合使用應首先選擇能除去含量最多雜質(zhì)的方法應盡量選擇高效的分離方法應將最費時、成本最高的分離純化方法安排在最后階段167醫(yī)學資源⒊分離純化過程的規(guī)?；?/p>

蛋白質(zhì)分離純化的實驗室工藝、技術(shù)、方法在大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化過程未必合適，如：實驗室方法在工程上可能難以實現(xiàn)（超聲波破細胞壁）實驗室方法在大規(guī)模生產(chǎn)中可能成本過高（超速離心）

因此，在很多情況下，實驗室的技術(shù)路線不等于生產(chǎn)工藝。

簡單、快速、經(jīng)濟、回收率高168醫(yī)學資源第十二節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制

&:是利用活細胞作為表達系統(tǒng)，產(chǎn)物的分子量較大，并有復雜的結(jié)構(gòu)，還參與生理功能的調(diào)節(jié)，用量極微，任何質(zhì)和量的偏差都可貽誤病情造成嚴重危害。

&:宿主細胞中表達的外源基因，在轉(zhuǎn)錄、翻譯、精制工藝、放大過程中都可能發(fā)生變化，故從原料以及制備全過程都必須嚴格控制條件和鑒定質(zhì)量。169醫(yī)學資源確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。原材料的質(zhì)量控制還包括：培養(yǎng)基成份、發(fā)酵過程中所用的試劑、提取純化過程中用到的試劑等等。

一、原材料的質(zhì)量控制170醫(yī)學資源根據(jù)質(zhì)量控制要求應了解以下特性：⒈目的基因明確目的基因的來源、克隆經(jīng)過，并以限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和核苷酸序列予以確證；⒉表達載體

應提供表達載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及各組成部分（如復制子、啟動子）的來源與功能，構(gòu)建中所用位點的酶切圖譜，抗生素抗性標記物；171醫(yī)學資源⒊宿主細胞應提供宿主細胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學特性；⒋須闡明載體引入宿主細胞的方法及載體在宿主細胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；⒌提供插入基因與表達載體兩側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細敘述在生產(chǎn)過程中啟動與控制基因在宿主細胞中表達的方法及水平等。172醫(yī)學資源二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制在工程菌的貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；在重復生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。173醫(yī)學資源

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