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文檔簡(jiǎn)介
生物分離工程電泳1第一頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三電泳在生化分離中的應(yīng)用分離和純化手段(實(shí)驗(yàn)室)
蛋白、酶、核酸純化基礎(chǔ)理論研究
醋酸纖維薄膜電泳分析血清蛋白
瓊脂對(duì)流免疫電泳分析病人血清,早期診斷肝癌
高壓電泳分離肽段,研究蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu);
凝膠電泳技術(shù)分離分析酶,蛋白質(zhì),核酸2第二頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三電泳原理指帶電粒子在電場(chǎng)中朝與自身帶相反電荷的電極移動(dòng)的現(xiàn)象CATHODEANODE+--+3第三頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三帶電顆粒小離子:Cl-,甘氨酸離子
生物大分子:蛋白質(zhì)、核酸等
蛋白質(zhì)分子是由氨基酸組成的,而氨基酸帶有可解離的氨基和羧基,是典型的兩性電解質(zhì),在一定的pH條件下就會(huì)解離而帶電
4第四頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三用支持體的電泳技術(shù)1.濾紙電泳2.醋酸纖維薄膜電泳3.薄層電泳4.非凝膠性支持體區(qū)帶電泳(淀粉,纖維素粉,玻璃粉,硅膠等)5.凝膠支持體區(qū)帶電泳(聚丙烯酰胺凝膠,瓊脂糖凝膠)不用支持體的電泳技術(shù)Tiselius或微量電泳
操作形式:1.區(qū)帶電泳2.等速電泳3.等電點(diǎn)電泳電泳形式分類5第五頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三電泳速度v=EZe/(6пrη)+--Z,rEf’fE:電場(chǎng)強(qiáng)度,V/cmZ:
溶質(zhì)的荷電荷數(shù)η:溶液粘度e:1.610-19C1.粒子在電場(chǎng)中所受的力:
f=EZe2.粒子在液體中泳動(dòng)所受的阻力:根據(jù)Stoke定律f′=6пrηv平衡時(shí):f=f’恒定泳動(dòng)速度:溶質(zhì)的遷移率:u0=v/E=Ze/(6пrη)6第六頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三區(qū)帶電泳7第七頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三影響泳動(dòng)速度的因素FrictionCharge外加電流電壓分子量分子形狀分子的等電點(diǎn)Voltage+--+8第八頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三影響泳動(dòng)速度的因素-1
帶電顆粒的性質(zhì)
所帶凈電荷的數(shù)量
顆粒大小
形狀
v=EZe/(6пrη)恒定泳動(dòng)速度:9第九頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三影響泳動(dòng)速度的因素-2
粒子的pI和溶液pH值
protein白蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白pI4.05.065.17.1白蛋白
>
α2球蛋白
>β球蛋白
>γ球蛋白血清中的四種蛋白pH8.6的電泳緩沖液中電泳,泳動(dòng)速度:10第十頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三影響泳動(dòng)速度的因素-3
外加電流電壓
U,E,v(1)常壓電泳:
U=100~500V,E=2~10V/cm
t=幾小時(shí)至數(shù)天
適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)(2)高壓電泳:U=500~1000V,E=50~200V/cm
t=幾分鐘
分離氨基酸,肽,核苷酸,糖類等小分子物質(zhì)
由于電壓升高,電流也隨之增大,故需冷卻裝置
v=EZe/(6пrη)恒定泳動(dòng)速度:11第十一頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三影響泳動(dòng)速度的因素-4
溶液的離子強(qiáng)度I=(∑cizi2)/2
—保持足夠緩沖能力前提下,離子強(qiáng)度要最小—溶液的離子強(qiáng)度越高,帶電顆粒泳動(dòng)速度越慢,反之越快
—最適離子強(qiáng)度0.02–0.2
12第十二頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三影響泳動(dòng)速度的因素-5
電滲作用
在電場(chǎng)中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)濾紙電泳CellulosepH=8.6電泳血清蛋白+-γ球蛋白-濾紙的纖維間具有大量孔隙帶有負(fù)電荷與帶電顆粒一樣可以吸引正離子介質(zhì)向陰極移動(dòng)γ球蛋白:顆粒大,凈電荷少13第十三頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三電滲作用—石英毛細(xì)管電泳
CapillaryElectrophoresis
pH>3內(nèi)表面帶負(fù)電毛細(xì)管管壁分布有
大量的硅烷醇(Si-OH)陽(yáng)離子被吸附在管壁而形成了雙電層
V=V(電滲流)+V(電泳)V(正)>V(中)>V(負(fù))14第十四頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三影響泳動(dòng)速度的因素-6
對(duì)支持物的選擇
支持物均勻,吸附力小,否則電場(chǎng)強(qiáng)度不均勻,影響區(qū)帶的分離
瓊脂糖和淀粉在電場(chǎng)作用下易電離帶負(fù)電荷,產(chǎn)生電滲流,應(yīng)用范圍受限制。聚丙烯酰胺凝膠常用。15第十五頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三Example1
計(jì)劃在0.82v/cm的電位梯度下,用凝膠電泳的方法將兩種胞外蛋白質(zhì)分離開(kāi)來(lái),這兩種蛋白質(zhì)的遷移率分別為4.110-5和5.110-5cm2/V.s。如果開(kāi)始時(shí)混合物在凝膠上寬度為0.2cm,估計(jì)把這兩種蛋白質(zhì)分開(kāi)需多長(zhǎng)時(shí)間?在估算時(shí),可忽略擴(kuò)散的影響。
u0=v/E=eZ/(6пrη)解:溶質(zhì)的遷移率為:16第十六頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三凝膠電泳17第十七頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三
凝膠電泳法鑄膠電泳染色脫色凝膠電泳樣本處理Trypsin濃縮層膠體分離層膠體取出膠體染色脫色18第十八頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三Pierce商品供應(yīng)預(yù)鑄膠片梯度或固定濃度膠體10,12.15樣本槽中性pH緩沖液拋棄式塑料外殼膠體1mm厚度19第十九頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)組成1電泳系統(tǒng)pH膠體濃度緩沖液上層(負(fù)極)緩沖液2樣本溶液3濃縮層膠體6.84分離層膠體膠體5下層(正極)緩沖液Tris-HClTris-HClTris-glycineTris-glycineTris-glycine8.38.38.38.35%7.5~20%---●膠體不連續(xù)性有濃縮樣品的作用20第二十頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三濃縮層內(nèi)的等速電泳21第二十一頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三濃縮層膠體中的三個(gè)主要作用角色Glycine:Negativecharged
Nonetcharge
Chlorideion:Proteins:小分子大分子22第二十二頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三SDSGelElecrtophoresis23第二十三頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三SDS測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量PAGE凝膠電泳分離、檢測(cè)蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小、形狀及凈電荷
在PAGE中加入一定量的SDS
蛋白質(zhì)分子的遷移速度主要取決于分子量大小24第二十四頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三SDS測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量SDS:陰離子去污劑、水溶液中以單體和分子團(tuán)存在。能破壞蛋白質(zhì)分子之間及與其他分子間的非共價(jià)鍵,形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物,使蛋白質(zhì)喪失了原有電荷狀態(tài),形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)。25第二十五頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三SDS測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量操作:分離膠12%濃縮膠5%加樣電泳染色、脫色凝膠干燥確定分子量26第二十六頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三樣品分子量的確定M為蛋白質(zhì)分子量、m相對(duì)遷移率、b為斜率、K為截距。一定條件下K和b為常數(shù),根據(jù)遷移率可求得分子量。lgMw=b*mR+K
蛋白質(zhì)分子量在15000-200000之間時(shí),電泳遷移率與分子量的對(duì)手呈線性關(guān)系:27第二十七頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三樣品分子量的確定相對(duì)遷移距離=蛋白質(zhì)遷移距離/燃料遷移距離
以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)(lgMr)為縱座標(biāo),相對(duì)遷移距離為橫座標(biāo)作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。28第二十八頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三三種不同性質(zhì)蛋白質(zhì)的電泳比較MolecularWeightpINativePAGESDS-PAGEMobilityProteinQuaternaryStructureXYZTetramer(40,000)x4Monomer88,000Monomer60,0005.85.29.3FastSlowMediumSlowUpwardFastXYZ--+29第二十九頁(yè),共三十頁(yè),編輯于2023年,星期三單元體分子量的測(cè)定:SDS
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