詳細介紹抗體的生產(chǎn)制備

抗體的生產(chǎn)制備當(dāng)前第1頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

2特異性抗體的制備與純化技術(shù)多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體（雜交瘤技術(shù)）當(dāng)前第2頁\共有68頁\編于星期日\16點單克隆抗體與多克隆抗體6/12/2023

3當(dāng)前第3頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

4抗體發(fā)展史抗體制備技術(shù)主要經(jīng)歷了三代：第一代抗體是傳統(tǒng)的抗體制備方法即利用抗原免疫動物后獲得抗體，稱為多克隆抗體（polyclonalantibody）；第二代抗體是通過雜交瘤技術(shù)制備出針對抗原中某一抗原決定簇的抗體稱為單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）；第三代抗體是利用基因工程技術(shù)制備而來，稱為基因工程抗體（geneticengineeringantibody）。當(dāng)前第4頁\共有68頁\編于星期日\16點第一節(jié)多克隆抗體的制備與純化6/12/2023

5克?。╟lone）:是指無性繁殖細胞系，是由單一個祖先細胞分裂繁殖而形成的一簇細胞純系。在這個家族的所有成員中，如無突變發(fā)生，其基因是完全相同的。多克隆抗體（polyclonalantibody,pAb）：用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫細胞，可刺激多個B細胞克隆產(chǎn)生針對多個抗原表位的不同抗體。多獲得的免疫血清實際上是含有多種抗體的混合物，即多克隆抗體。單克隆抗體（monoclonalantibody,mAb）:由一個識別一種抗原表位的B細胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。高度均一、特異性強、效價高、少或無交叉反應(yīng)性。當(dāng)前第5頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

6多克隆抗體（抗血清）的制備流程抗原半抗原+載體佐劑免疫動物（3-5次）測效價動物采血，分離血清抗血清純化、鑒定、保存當(dāng)前第6頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

7（一）抗原的制備（二）免疫動物（三）免疫血清的收集、分離和保存（四）抗體的純化（五）免疫血清的鑒定（六）免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施當(dāng)前第7頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

8（一）抗原的制備免疫原（immunogen）指能刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細胞；抗原最重要的性質(zhì)是免疫原性（immunogenicity）免疫原—天然抗原、人工合成抗原；蛋白質(zhì)、多糖、脂類、核酸抗原；免疫原的分類：（一）細胞性抗原制備：

綿羊紅細胞（SRBC）-溶血素；

細菌-抗菌抗體（動物免疫血清）（二）可溶性抗原制備：

指蛋白質(zhì)、多糖和脂類等。當(dāng)前第8頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

9細胞性抗原：主要包括人、動物的細胞，還有細菌、螺旋體及寄生蟲等。如菌體（O）抗原的制備：選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株，接種于斜面或平板培養(yǎng)基表面；置溫箱37℃培養(yǎng)24h，用適量的無菌生理鹽水刮下菌苔，移入無菌含有玻璃珠的三角瓶中，充分搖勻菌體；100℃水浴2～2.5h殺菌并破壞鞭毛抗原。取處理過的菌液，檢測有無活菌的存在，合格后用無菌生理鹽水稀釋成每毫升8億～10億個細菌，加入苯酚（石炭酸）至最終濃度為5％，即為O抗原。

1）細胞性抗原或顆粒性抗原當(dāng)前第9頁\共有68頁\編于星期日\16點2）可溶性抗原6/12/2023

10可溶性抗原主要包括蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、酶、補體、細菌外毒素、核酸等。它們大多數(shù)來源組織細胞，成分復(fù)雜。制備這類抗原時，首先需將組織和細胞破碎，然后再從組織和細胞勻漿中提取目的成分，提純后的抗原需鑒定后才能用做免疫原。（1）組織勻漿的制備：所有的組織必須是新鮮的或低溫保存的。器官或組織獲得后立即去除表面的包膜或結(jié)締組織以及大血管，在4℃水浴或冰浴中將洗凈的組織剪成小塊，加入適量生理鹽水，裝入搗碎機破碎制成組織勻漿。

（2）細胞破碎：提取細胞可溶性抗原，需將細胞破碎，常用方法有冷熱交替法、超聲破碎法，反復(fù)凍融法、自溶法和酶處理法等。當(dāng)前第10頁\共有68頁\編于星期日\16點（3）蛋白提純6/12/2023

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①超速離心法：常用密度梯度介質(zhì)有蔗糖、甘油；②選擇性沉淀法（鹽析沉淀法）：其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)理化特性的差異，采用各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質(zhì)抗原成分沉淀，從而達到純化的目的。如選用33～50％飽和度的硫酸胺收集沉淀物；

當(dāng)前第11頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

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③凝膠層析法（分子篩層析）：蛋白質(zhì)分子按大小被分離；

④離子交換層析；帶電的生物大分子和離子交換色譜填料上的離子基團進行交換而被分離純化。以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進行分離；

⑤親和層析：利用生物大分子的生物特異性如抗原抗體、激素受體、IgG和葡糖球菌蛋白A（SPA）；

⑥制備電泳技術(shù)。當(dāng)前第12頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

13⑦其它聚丙烯酰胺凝膠膠內(nèi)蛋白可將抗原所在的電泳條帶（或蛋白點）切下,研磨后直接用以動物免疫。NC膜結(jié)合蛋白將含目的分子的蛋白進行SDS電泳，轉(zhuǎn)移至NC膜上，麗春紅顯色至清晰顯示目的條帶，取目的條帶置于加有PBS的1.5ml離心管中，用PBS洗至無色，繼而剪碎、研磨，用于動物免疫。當(dāng)前第13頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

14分離純化方法的比較方法原理優(yōu)點缺點應(yīng)用離心分離法離心力和物質(zhì)沉降系數(shù)的差別操作簡單分辨率低蛋白質(zhì)分離鹽析法鹽析作用操作簡單，成本低，重復(fù)性較好分辨率低，純化倍數(shù)低蛋白質(zhì)的分級沉淀凝膠層析法分子篩的排阻作用分辨力強，不引起蛋白質(zhì)變性成本高分子質(zhì)量有差別的可溶性物質(zhì)離子交換法離子基團的交換作用分辨力強，分離量大費時間，酸堿用量大可電離的生化物質(zhì)親和層析法分離物與配體間的親和作用分辨力很強一種配體只分離一類物質(zhì)，局限性大生物大分子物質(zhì)電泳物質(zhì)的帶電性質(zhì)設(shè)備簡單、操作方便、分辨率高成本高生物分子的分離、定性、定量當(dāng)前第14頁\共有68頁\編于星期日\16點（4）純化抗原的鑒定6/12/2023

15含量測定：采用常規(guī)蛋白或糖類濃度測定法，一般采用分光光度計測量法；相對分子量的鑒定：一般采用SDS電泳法；純度鑒定：常用區(qū)帶電泳法鑒定。當(dāng)前第15頁\共有68頁\編于星期日\16點3）半抗原6/12/2023

16半抗原物質(zhì)多數(shù)為低分子質(zhì)量的物質(zhì)，如：多糖、多肽、甾體激素、脂肪胺、類脂質(zhì)、核酸、某些藥物及其它化學(xué)藥品；常用載體：蛋白質(zhì)類如：牛血清白蛋白、人血清清蛋白、兔血清清蛋白等。多肽聚合物：如多聚Lys（賴氨酸）

大分子聚合物：如羥甲基纖維素；半抗原－載體連接方法：常用物理法和化學(xué)法。

物理吸附的載體有羥甲基纖維素等，其借助電荷和微孔吸附半抗原；

化學(xué)法則是利用某些功能基團把半抗原連接到載體上。

當(dāng)前第16頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

17某些物質(zhì)與抗原一起或先于抗原注入機體，可增強機體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型，此類物質(zhì)稱為免疫佐劑(immunoadjuvant)，簡稱佐劑。四）免疫佐劑良好的佐劑應(yīng)當(dāng)具備以下條件：增加抗原的表面積，并改變抗原的活性基團構(gòu)型，從而增強抗原的免疫原性；佐劑與抗原混合能延長抗原在局部組織的存留時間，降低抗原的分解速度，使抗原緩慢釋放至淋巴系統(tǒng)中，持續(xù)刺激機體產(chǎn)生高滴度的抗體；佐劑可以直接或間接激活免疫活性細胞并使之增生，從而增強了體液免疫；具有無毒性或副作用低的特點。當(dāng)前第17頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

18佐劑一般包括以下幾類：①無機佐劑：如氫氧化鋁、明釩等②生物性佐劑：如結(jié)核分枝桿菌、卡介苗、小棒狀桿菌、百日咳桿菌、革蘭陰性桿菌內(nèi)毒素、霍亂毒素的B亞單位、胞壁酰二肽和細胞因子等；③人工合成佐劑：如雙鏈多聚肌苷酸：胞苷酸（polyI：C）、雙鏈多聚腺苷酸：尿苷酸（polyA：U）；④油劑：如弗氏完全佐劑、花生油乳劑等；⑤納米佐劑1、佐劑的種類當(dāng)前第18頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

19應(yīng)用最多的是弗氏佐劑和細胞因子佐劑弗氏佐劑：不完全佐劑:液體石蠟+羊毛脂完全佐劑:液體石蠟+羊毛脂+卡介苗弗氏佐劑：抗原=1：1乳化成“油包水”乳液

（乳化方法主要有研磨法和注射器混合法）。完全佐劑一般不連續(xù)2次使用細胞因子佐劑：

IL-2IL-1IFNr（羊痘病毒γ干擾素受體）CSF（集落刺激因子）等當(dāng)前第19頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

20①增強抗原免疫原性：使無或微弱免疫原性的物質(zhì)變成持久或強的免疫原；②增強機體對抗原刺激的反應(yīng)性：提高初次應(yīng)答和再次應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體滴度；③改變抗體類型：使產(chǎn)生抗體由IgM型轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG型；④引起或增強遲發(fā)性超敏反應(yīng)。2、

佐劑的免疫生物學(xué)作用當(dāng)前第20頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

21佐劑的作用機制歸納起來主要有如下幾種：①可增強抗原的表面積和改變抗原活性基團構(gòu)型，從而增強抗原的免疫原性。②佐劑與抗原混合一起注入機體，可改變抗原的物理性狀，形成抗原儲存庫，延長抗原在局部組織的滯留時間，有利于抗原的緩慢釋放。③增強吞噬細胞的吞噬作用（被佐劑吸附的抗原易被吞噬細胞吞噬），促進對抗原的處理，刺激淋巴細胞增生，從而增強和擴大免疫應(yīng)答的效應(yīng)。3、佐劑的作用機制當(dāng)前第21頁\共有68頁\編于星期日\16點二、動物免疫6/12/2023

22選擇動物時應(yīng)考慮以下因素：①抗原來源與動物種屬的關(guān)系?？乖膩碓磁c免疫動物種屬差異越遠，其免疫源性越強，免疫效果越好，而同種系或親緣關(guān)系越近，免疫效果越差。②動物個體的選擇。適齡、健康、體重符合要求的正常動物（以雄性為佳）；抗體需要量少時，選用家兔、豚鼠和雞等小動物；抗體需要量大時，可選用綿羊、山羊、馬、驢等大動物。（一）免疫動物的選擇當(dāng)前第22頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

23選定動物后，在免疫過程中應(yīng)考慮免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)、免疫間隔等因素。1、免疫原的劑量：免疫原的接種劑量按免疫原性的強弱、動物的個體狀態(tài)和免疫時間來確定。首次免疫時，劑量不宜過大，以免產(chǎn)生免疫麻痹。（二）免疫方法免疫途徑通常有皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴結(jié)等，視不同的免疫方案而異。對于不易獲取的寶貴抗原可采用淋巴結(jié)免疫法。免疫間隔時間是影響抗體產(chǎn)生的重要因素，其中首次與第二次免疫的間隔時間尤為重要，一般以10～20天為佳，二次后間隔時間一般為7～10天，若間隔時間太長，則刺激減弱，抗體效價不高。2、免疫途徑與免疫間隔時間當(dāng)前第23頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

24（三）免疫血清的收集1）采血前測抗體效價在第2次加強免疫后2周，從兔耳緣靜脈取2～3ml血，制備血清，檢測抗體效價。如未達到預(yù)期效價，需再進行加強免疫，直到滿意時為止。當(dāng)抗體效價達到預(yù)期水平時，即可放血制備抗血清。

抗血清的效價：就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價測定的方法常用的是放射免疫法，此法對所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙向擴散等方法測定。前者測定的效價極為精確。而后者則粗糙得多。當(dāng)前第24頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

25放射免疫法：以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)標(biāo)記抗原（放射性核素標(biāo)記）混合，孵育24h后，測定其結(jié)合率（用液體閃爍計數(shù)儀測定Ag*－Ab或游離Ag*）。通常以結(jié)合率為50%的血清稀度為效價。如某抗血清的結(jié)合率為50%時的稀釋度為1：15000，則該血清的效價就是1：15000?？寡宓男r，除由抗血清本身的性質(zhì)決定外，還受標(biāo)記抗原的質(zhì)量、孵育時間，所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響，在工作中必須引起注意。

當(dāng)前第25頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

26雙向擴散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。

瓊脂板的制備：100mlpH7.1的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65℃左右時，加入疊氮鈉（NaN3），使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，完全凝固后，用打孔器打孔。中央孔內(nèi)加適量抗原（容量為50μl），周圍各孔內(nèi)分別加入50μl1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h，觀察有無沉淀線產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度。當(dāng)前第26頁\共有68頁\編于星期日\16點2）抗血清的采集6/12/2023

27采集：頸動脈放血、心臟采血、靜脈采血分離：室溫自然凝固1～2h，然后放4℃冰箱過夜，待血塊收縮后分離血清，有些血清須經(jīng)56℃30min使補體滅活。保存：4℃保存—存放3個月至半年低溫保存（-70℃～-20℃）—2至3年，忌反復(fù)凍融真空干燥保存—4-5年注意：保存前需經(jīng)除菌

保存液含防腐劑

避免反復(fù)凍融（分裝）當(dāng)前第27頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

28（四）、抗體的純化1、目的：盡量除去抗血清中與目的抗體不相關(guān)的成分2、純化方法1）單價特異性抗血清的純化單價特異性是指抗血清只與其特異性抗原發(fā)生反應(yīng)。去除雜抗體主要方法：親和層析法（將引起交叉反應(yīng)的共同抗原交聯(lián)到Sepharose4B柱上，把要處理的抗血清通過親和層析柱，共同抗體吸附在柱上，洗脫液則含有特異性抗體）；吸附法（指將非特異性抗原液與戊二醛制備成固相吸附劑按1：10直接加到免疫血清中去除雜抗體）當(dāng)前第28頁\共有68頁\編于星期日\16點2）特異性IgG類抗體的純化6/12/2023

29硫酸銨鹽析：先用50%飽和度去除白蛋白，再用2次33%飽和度沉淀免疫球蛋白。離子交換層析：常用的離子交換劑有DEAE纖維素和QAE纖維素。以QAE-Sephadex最理想。能吸附血清中多種蛋白質(zhì)，但不能吸附IgG.親和層析法：將純抗原交聯(lián)到Sepharose4B，裝柱后，將抗血清通過親和層析柱，特異性吸附IgG。凝膠過濾法：分子篩層析當(dāng)前第29頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

30（五）免疫血清的鑒定1.效價的測定：顆粒性抗原可采用凝集試驗，可溶性抗原常用雙向免疫擴散試驗、ELISA等方法。2.特異性的鑒定：抗體特異性鑒定常用雙向免疫擴散法、免疫電泳法。3.純度的鑒定：抗體純度的鑒定可采用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳（SDS）、雙向擴散試驗、免疫電泳等方法。

IgG含有重鏈和輕鏈，純IgG的SDS結(jié)果應(yīng)有兩條蛋白電泳帶（分子量約53kD和22kD），若出現(xiàn)多條電泳帶則表明制備的抗體混有雜蛋白，需進一步純化。4.親和力的鑒定：測定抗體親力的方法較多，如平衡透析法、ELISA或RIA（放射免疫技術(shù)）競爭結(jié)合試驗等。當(dāng)前第30頁\共有68頁\編于星期日\16點第二節(jié)單克隆抗體的制備和應(yīng)用6/12/2023

31當(dāng)前第31頁\共有68頁\編于星期日\16點第二節(jié)單克隆抗體的制備和應(yīng)用6/12/2023

32單克隆抗體的優(yōu)點單特異性和均一性無限供應(yīng)用混合的抗原制備出識別一個抗原決定簇的抗體McAbPcAb當(dāng)前第32頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

33雜交細胞（hybridcell）

在外界某些條件干預(yù)下（如PEG、電穿孔），當(dāng)兩個細胞緊密地接觸的時候,其細胞膜可能發(fā)生融合，產(chǎn)生具有原來兩個細胞染色體/基因的單個細胞，稱為雜交細胞。

當(dāng)前第33頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

34雜交瘤細胞（Hybridomas）若用一種腫瘤細胞與另一種體細胞（如淋巴細胞）融合，所形成的雜交細胞稱為雜交瘤細胞，簡稱雜交瘤。其既具有腫瘤細胞無限增殖的能力，也具有淋巴細胞的一些特性。

B淋巴細胞雜交瘤

骨髓瘤細胞與免疫B細胞融合所產(chǎn)生的雜交瘤細胞。當(dāng)前第34頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

35雜交瘤細胞B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)的基本原理B細胞骨髓瘤細胞當(dāng)前第35頁\共有68頁\編于星期日\16點單克隆抗體的制備6/12/2023

36當(dāng)前第36頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

37抗原制備免疫動物骨髓瘤細胞及飼養(yǎng)細胞的制備細胞融合雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng)雜交瘤細胞的篩選及克隆化單克隆抗體的鑒定單克隆抗體的制備單克隆抗體制備的主要步驟當(dāng)前第37頁\共有68頁\編于星期日\16點一、抗原6/12/2023

38細胞、細菌和病毒等，一般具有較強的免疫原性，可不加佐劑。例如，直接腹腔注射1~2×107個細胞。顆粒性抗原：可溶性抗原的來源主要是天然純化，或者用目的基因在原核或真核細胞內(nèi)表達。可溶性抗原需與弗氏完全或不完全佐劑混勻，進行免疫?？扇苄钥乖寒?dāng)前第38頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

39B淋巴細胞在目的抗原刺激下增殖、分化，形成能分泌特異性抗體的B淋巴細胞，有利于細胞融合形成分泌特異性抗體的雜交瘤細胞。多次免疫可通過抗體親和力成熟機制，使B細胞分泌高親和力抗體，由此形成的雜交瘤往往可分泌高親和力抗體，有更高的應(yīng)用價值。

二、免疫動物免疫目的：當(dāng)前第39頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

40采用與骨髓瘤供體同一品系的動物

免疫動物品系（脾細胞供體）和骨髓瘤細胞在種系發(fā)生上距離越遠則產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定，獲得的雜交瘤不能在該品系小鼠體內(nèi)誘生腹水。動物的選擇：動物對抗原刺激易產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)8~12周齡雌性小鼠（最常用BALB/c）當(dāng)前第40頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

41第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐劑第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐劑第三次免疫：可溶性抗原加生理鹽水小鼠背部皮下注射小鼠背部皮下注射4周后3周后小鼠腹腔注射10天后檢測血清效價加強免疫：可溶性抗原加生理鹽水小鼠腹腔注射細胞融合3天后免疫程序：當(dāng)前第41頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

42

脾（spleen）抗原脾（spleen）當(dāng)前第42頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

43三、骨髓瘤細胞及飼養(yǎng)細胞的制備骨髓瘤細胞系的選擇要點：自身不產(chǎn)生免疫球蛋白的重鏈與輕鏈所選擇的骨髓瘤細胞應(yīng)與提供免疫脾細胞的動物

品系相同對氨基碟呤敏感與免疫脾細胞融合后產(chǎn)生穩(wěn)定分泌Ig雜交瘤細胞當(dāng)前第43頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

44飼養(yǎng)細胞的作用：

小鼠腹腔巨噬細胞小鼠脾細胞飼養(yǎng)細胞（feedercell）：增加細胞密度，滿足新生的雜交瘤細胞對細胞密度的要求吞噬清除死亡的細胞分泌生長刺激因子促進雜交瘤細胞的生長飼養(yǎng)細胞的種類和制備方法：當(dāng)前第44頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

45四、細胞融合融合前的準(zhǔn)備工作準(zhǔn)備HAT、HT培養(yǎng)液、融合劑PEG準(zhǔn)備飼養(yǎng)細胞準(zhǔn)備骨髓瘤細胞準(zhǔn)備免疫脾細胞當(dāng)前第45頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

46拉頸處死小鼠無菌操作取出脾臟清洗、研磨收集細胞離心洗滌細胞計數(shù)脾細胞的準(zhǔn)備當(dāng)前第46頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

47收集細胞離心洗滌活細胞計數(shù)調(diào)整細胞濃度骨髓瘤細胞的準(zhǔn)備當(dāng)前第47頁\共有68頁\編于星期日\16點細胞融合6/12/2023

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骨髓瘤細胞與脾細胞按一定比例混合1:10或1:5加入促融劑PEGPEG當(dāng)前第48頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

49在聚乙二醇作用下B淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞當(dāng)前第49頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

50五、雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)HAT選擇性培養(yǎng)的原理：細胞的DNA生物合成有主要途徑和補償途徑。當(dāng)有氨基碟呤存在時，能夠阻斷DNA合成的主要途徑，需通過補償途徑合成DNA，這時就需要次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）利用次黃嘌呤合成DNA，或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用胸腺嘧啶核苷合成DNA。當(dāng)前第50頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

51當(dāng)前第51頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

52用于雜交瘤融合的骨髓細胞缺乏HGPRT和TK，在HAT培養(yǎng)液中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏HGPRT和TK，不能利用補救途徑合成DNA而死亡。未融合的B淋巴細胞雖具有HGPRT和TK，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有骨髓瘤細胞與免疫B細胞融合的雜交瘤既有骨髓瘤細胞無限增殖的能力，又從免疫B細胞得到HGPRT和TK的基因產(chǎn)物，因此，能夠克服氨基碟呤的阻斷作用，通過次黃嘌呤的補償途徑合成DNA，而在HAT選擇培養(yǎng)液中生長繁殖。當(dāng)前第52頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

53當(dāng)前第53頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

54融合后3~4天后，可見外形似骨髓瘤細胞，渾圓透亮的克隆。融合后第7~9天取培養(yǎng)上清，檢測特異性抗體。細胞生長情況

當(dāng)前第54頁\共有68頁\編于星期日\16點六、雜交瘤細胞的篩選及克隆化6/12/2023

55雜交瘤分泌單克隆抗體的檢測方法免疫酶技術(shù)——間接ELISA

包被抗原、培養(yǎng)上清、酶標(biāo)抗體、加底物顯色

陰性對照：骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清

陽性對照：免疫鼠血清

免疫熒光技術(shù)間接免疫熒光（或酶）測定法：靶細胞鋪片、固定細胞、加待測樣品、加熒光標(biāo)記抗體（或加酶標(biāo)抗體和顯色底物）、鏡檢活細胞免疫熒光技術(shù)：流式細胞術(shù)分析當(dāng)前第55頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

56雜交瘤細胞的克隆化在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化?？寺』窗雅囵B(yǎng)孔中的細胞從單個細胞進行培養(yǎng)繁殖，使之成為單克隆，其分泌的抗體達到均一性?？寺』姆椒ㄖ饕校河邢尴♂尫?、軟瓊脂培養(yǎng)法當(dāng)前第56頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

57有限稀釋法當(dāng)前第57頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

58（1）克隆前1天制備飼養(yǎng)細胞層（同細胞融合）。

（2）將要克隆的雜交瘤細胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計數(shù)。

（3）調(diào)整細胞為3～10個細胞/ml。

（4）取頭天準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細胞層的細胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

（5）在第7天換液，以后每2～3天換液1次。

（6）8～9天可見細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。

（7）將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養(yǎng)。

（8）每個克隆應(yīng)盡快凍存。

有限稀釋法克隆當(dāng)前第58頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

59軟瓊脂培養(yǎng)法以適當(dāng)濃度雜交瘤細胞加入軟瓊脂培養(yǎng)基中，形成由一個細胞增殖而成的細胞集落。當(dāng)前第59頁\共有68頁\編于星期日\16點雜交瘤細胞的克隆化篩選：6/12/2023

60當(dāng)前第60頁\共有68頁\編于星期日\16點6/12/2023

61免疫球蛋白類別及亞類的鑒定七、單克隆抗體的鑒定小鼠免疫脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合形成的雜交瘤細胞，其分泌的特異性McAb的本質(zhì)仍是小鼠的不同類型及其亞類