過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題及處理方法演示文稿

過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題及處理方法演示文稿當(dāng)前第1頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題及處理方法當(dāng)前第2頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)WB的簡(jiǎn)介WB即蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlot）。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。

當(dāng)前第3頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)

基本原理通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。當(dāng)前第4頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)

應(yīng)用1.目的蛋白的表達(dá)特性分析2.目的蛋白與其它蛋白的互作3.目的蛋白的組織定位4.目的蛋白的表達(dá)量分析當(dāng)前第5頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)當(dāng)前第6頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)當(dāng)前第7頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)當(dāng)前第8頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)三、WB的影響因素步驟較多，任何一步都可能影響結(jié)果1、電泳分離蛋白蛋白抽提；蛋白定量；樣品制備變性；上樣量；電泳（電壓、電流的大小，膠濃度、制膠）當(dāng)前第9頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)2、轉(zhuǎn)膜膜的選擇；膜的確認(rèn)；特殊處理；……當(dāng)前第10頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)3、封閉封閉液的選擇；封閉條件優(yōu)化；……當(dāng)前第11頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)4、漂洗漂洗液的配制與選擇漂洗時(shí)間及次數(shù)當(dāng)前第12頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)5、抗體孵育抗體及稀釋液選擇；抗體稀釋倍數(shù)優(yōu)化；抗體孵育時(shí)間；……當(dāng)前第13頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)6、曝光曝光時(shí)間的掌控當(dāng)前第14頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)四、注意事項(xiàng)1.蛋白樣品的提取盡可能新鮮組織或蛋白避免反復(fù)凍融對(duì)于有些蛋白，加去磷酸化的（NaF）盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子（通過(guò)加入核酸酶或采取不同提取策略）

選擇合適的裂解液準(zhǔn)確定量（BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白）

當(dāng)前第15頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)當(dāng)前第16頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)2、制膠根據(jù)不同的蛋白大小，選擇不同的濃度制膠。當(dāng)前第17頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)

制膠的時(shí)候一定要注意玻璃板一定要干凈，不能有殘留的膠。玻璃板底部放平，盡量不能漏膠灌膠的時(shí)候，不能太快，容易產(chǎn)生旋窩水或異丙醇?jí)旱臅r(shí)候，不能太久當(dāng)前第18頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)

3、轉(zhuǎn)膜a泡膜：轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移液浸泡20min；

凝膠若是沒(méi)在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜buffer中浸泡，就會(huì)在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中出現(xiàn)凝膠皺縮，導(dǎo)致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形bPVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡，活化當(dāng)前第19頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)c膜順序：陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽(yáng)極碳板，不能放反d轉(zhuǎn)膜過(guò)程產(chǎn)生大量的熱，注意冷卻e具體轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，反之則短f避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因?yàn)槭稚系牡鞍缀陀椭瑫?huì)影響轉(zhuǎn)膜效率并會(huì)使膜臟掉。當(dāng)前第20頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)g夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒(méi)有氣泡存在，否則會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全h保證膜和濾紙的大小和凝膠完全一樣，過(guò)大和過(guò)小都會(huì)影響轉(zhuǎn)膜效率i一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景當(dāng)前第21頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)4、封閉

a脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標(biāo)記的抗體一起使用，因?yàn)槊撝谭酆刑堑鞍缀蜕锼?/p>

b如果封閉劑中含磷酸酶，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響，因?yàn)榱姿崦概c印記膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化c檢測(cè)磷酸化抗體時(shí)，不能使用酪蛋白/脫脂奶粉作為封閉劑當(dāng)前第22頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)5、孵育a洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；b注意一抗二抗的匹配c一抗二抗的效價(jià)問(wèn)題當(dāng)前第23頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)五、常見(jiàn)問(wèn)題及解決電泳中的問(wèn)題︶條帶呈笑臉狀——凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好;——電泳系統(tǒng)溫度偏高當(dāng)前第24頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)︵條帶呈皺眉狀

可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全當(dāng)前第25頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)

拖尾樣品溶解不好當(dāng)前第26頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)紋理（縱向條紋）樣品中含有不溶性顆粒當(dāng)前第27頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)條帶偏斜電極不平衡或者加樣位置偏斜當(dāng)前第28頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)條帶兩邊擴(kuò)散加樣量過(guò)多當(dāng)前第29頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)

Westernblot結(jié)果曝光問(wèn)題

背景過(guò)高且不均勻1、封閉不充分——延長(zhǎng)封閉時(shí)間；——更換合適的封閉劑（脫脂奶粉，BSA，血清等）

2、一抗?jié)舛冗^(guò)高——增加一抗稀釋倍數(shù)；

3、抗體孵育溫度過(guò)高——4℃孵育當(dāng)前第30頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)4、二抗非特異性結(jié)合或與封閉劑交叉反應(yīng)——設(shè)置二抗對(duì)照(不加一抗),降低二抗?jié)舛?、洗膜不充分——增加洗滌次數(shù)，增加洗膜次數(shù)當(dāng)前第31頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)沒(méi)有陽(yáng)性條帶或很弱1、一抗、二抗等不匹配訂購(gòu)試劑時(shí)認(rèn)真選取一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物?？赏ㄟ^(guò)設(shè)置內(nèi)參可以驗(yàn)證二級(jí)測(cè)系統(tǒng)的有效性更換更好的一抗二抗當(dāng)前第32頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)2、一抗或/和二抗?jié)舛鹊驮黾涌贵w濃度；長(zhǎng)孵育時(shí)間；當(dāng)前第33頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)3、封閉劑與一抗或二抗有交叉反應(yīng)封閉時(shí)使用溫和的去污劑，如TWEEN20更換封閉劑（常用的脫脂奶、BSA、血清或明膠）當(dāng)前第34頁(yè)\共有36頁(yè)\編于星期一\15點(diǎn)4、樣本中無(wú)靶蛋白或靶蛋白含量過(guò)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，如果陽(yáng)性對(duì)照有結(jié)果，但標(biāo)本沒(méi)有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加標(biāo)本上樣量至少