生物制藥工藝學思考題及答案

抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝青霉素發(fā)酵工藝的建立對抗生素工業(yè)有何意義？青霉素是發(fā)現(xiàn)最早，最卓越的一種B-內(nèi)酰胺類抗生素，它是抗生素工業(yè)的首要產(chǎn)品，蘭氏陰性菌無效。青霉素經(jīng)過擴環(huán)后，形成頭孢菌素母核，成為半合成頭孢菌素的原料。如何根據(jù)青霉素生產(chǎn)菌特性進行發(fā)酵過程控制？青霉素在深層培養(yǎng)條件下，經(jīng)歷7個不同的時期，每個時期有其菌體形態(tài)特性，在規(guī)定時間取樣，通過顯鏡檢查這些形態(tài)變化，用于工程控制。第一期：分生孢子萌發(fā)，形成芽管，原生質(zhì)未分化，具有小泡。第二期：菌絲繁殖，原生質(zhì)體具有嗜堿性，類脂肪小顆粒。第三期：形成脂肪包含體，積累儲蓄物，沒有空洞，嗜堿性很強。素。第五期：形成大空泡，有中性染色大顆粒，菌絲呈桶狀。脂肪包含體消失，青霉素產(chǎn)量提高。第六期：出現(xiàn)個別自溶細胞，細胞內(nèi)無顆粒，仍然桶狀，釋放游離氨，pH上升。子。四到五期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強，通過工藝措施，延長此期，獲得高產(chǎn)。在第六期到來之前發(fā)束發(fā)酵。青霉素發(fā)酵工程的控制原理及其關(guān)鍵點是什么？控制原理：發(fā)酵過程需連續(xù)流加葡萄糖，硫酸銨以及前提物質(zhì)苯乙酸鹽，補糖率是最關(guān)響，如培養(yǎng)基，補充碳源，氮源，無機鹽流加控制，添加前體等；控制適宜的溫度和ph，菌體濃度。最后要注意消沫，影響呼吸代謝。青霉素提煉工藝中采用了哪些單元操作？藝包括如下單元操作：后續(xù)的分離純化過程。②萃?。浩湓硎乔嗝顾赜坞x酸易溶于有機溶劑，而青霉素易溶于水。③脫色：萃取液中添加活性炭，除去色素，熱源，過濾，除去活性炭。溶液，青霉素鉀鹽可直接結(jié)晶析出。氨基酸發(fā)酵工藝如何對谷氨酸發(fā)酵工藝過程進行調(diào)控？發(fā)酵過程流加銨鹽、尿素、氨水等氮源，補充NH4+；生物素適量控制在2-5μg/L；pH控制在中性或微堿性；供氧充足；磷酸鹽適量。氨基酸生產(chǎn)菌有什么特性，為什么？L-谷氨酸發(fā)酵微生物的優(yōu)良菌株多在棒狀桿菌屬L-谷氨酸。生物素在谷氨酸發(fā)酵過程中的作用是什么？生物素是不飽和脂肪酸合成過程中所需的乙酰CoA性，解除其對谷氨酸脫氫酶的抑制，源源不斷生產(chǎn)谷氨酸。維生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝比較分析現(xiàn)行維生素C現(xiàn)行的維生素c生產(chǎn)工藝過程有：萊氏化學合成法和兩步發(fā)酵法。-葡萄糖為原料，進過催化氫化生成D為L-山梨糖，酸性液中丙酮化，對L--2-酮-L-古龍酸，除去丙酮，內(nèi)酯化和烯醇化得到4兩部發(fā)酵法：①催化氫化：催化氫化D-葡萄糖，控制壓力，在氫做還原劑、鎳做催化劑的條件下，將醛基還原成醇基，從而制備D-山梨醇。②第一部發(fā)酵：D-山梨醇C2位羥基氧化為羰基，其他基團不變，微生物轉(zhuǎn)化得L-山梨糖。③第二部發(fā)酵：L-山梨糖到2-酮基-L-古龍酸需要將C1位醇基氧化為羧基，保持其他基團不發(fā)生變化。其中兩步發(fā)酵法更具有優(yōu)勢。原因如下：①以生物氧化代替化學氧化簡化了生產(chǎn)工藝。有利于安全生產(chǎn)。③三廢和污染較小。④提高了生產(chǎn)能力。C維生素C分子中含有兩個手性碳原子，故有四個光學異構(gòu)體。其中L(+)-抗壞血酸括性最高，D（-）-異抗壞血酸活性僅為其20％，工業(yè)上將其作為食品抗氧劑。D(-)-抗壞血酸和L(+)-異抗壞血酸幾乎無活性。在未來，一步發(fā)酵能取代兩部發(fā)酵，成為維生素生產(chǎn)的主流工藝嗎，為什么？一步法發(fā)酵對工業(yè)菌株的山梨醇/糖旁路代謝途徑進行敲除。與原始菌株比較，發(fā)現(xiàn)單菌發(fā)酵24h后，培養(yǎng)基中剩余的山梨醇糖含量基本保持恒定，NSR缺失株相對于原始菌株殘?zhí)橇刻岣吡?5.9%。基因工程制藥工藝工程菌與宿主菌對培養(yǎng)基要求有何不同，為什么？類物質(zhì)為碳源。大分子有機氮源；酵母利用氨基酸為氮源。常用氨基酸營養(yǎng)缺陷型。影響工程菌培養(yǎng)工藝的主要參數(shù)是什么？如何優(yōu)化控制？pH：了解發(fā)酵過程中各個階段的適宜pH以后，進一步設(shè)法控制pH在合適的范圍內(nèi)。分階段控制pH：根據(jù)試驗結(jié)果來確定生長最適pH和產(chǎn)物最適pH，以達到最佳生產(chǎn)。溶解氧：從供應量和需要量（菌體生長、質(zhì)粒穩(wěn)定性、產(chǎn)物積累）二個方面考慮，使之需氧不超過設(shè)備的供氧能力，在臨界溶解氧濃度之上。誘導物對生長和產(chǎn)物合成有何影響，為什么？誘導物用來誘導表達型工程菌。在細胞生長到一定階段，必需添加誘導物，以解除目標基因的抑制狀態(tài)，活化基因，進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成產(chǎn)物。適宜的誘導時間非常重要。誘導物的濃度及其發(fā)酵溫度會影響表達量和產(chǎn)物存在形式。化學誘導型啟動子：lzc、tac、T7等，誘導時間為對數(shù)生長期。溫度誘導型啟動子：PL、PR等，誘導時間為對數(shù)期或稍后一些?；蚬こ讨扑幑に嚦淘硎鞘裁矗浚≒CR（酶切、鏈接（外源基因?qū)肱c培養(yǎng)（）酶切：在特異位點上催化雙鏈DNA分子的斷裂，產(chǎn)生相應的限制性片段（DNA+緩沖液+限制性內(nèi)切酶；37℃，1小時；加熱、加EDTA終止；電泳檢查酶切完整性）雙鏈上相鄰的3’羥基和5’磷酸基團共價結(jié)合形成3’-5’磷酸二酯鍵，使原來斷開的DNA缺口重新連接起來（10min）轉(zhuǎn)化：把外源基因?qū)胨拗骷毎倪^程（氯化鈣法向大腸桿菌導入外源基因）目標基因克隆的主要方法有哪些？分析其特點及其適用范圍①PCR擴增。優(yōu)點：簡便快速，高效，數(shù)kb單基因克隆。缺點：DNA聚合酶活性和保真性限制。（94℃變性→55℃退火→72℃延伸→94℃變性……）耗時，昂貴。③化學合成：簡便，準確，已知序列基因克隆，引物合成。缺點：受合成儀性能限制，長度很短。大腸桿菌中高效表達蛋白藥物著重設(shè)計哪幾個方面？為了確保工程菌構(gòu)建的有效性，必須遵循GMP及其有關(guān)生物制品研究技術(shù)指導原則，表達載體的構(gòu)建、結(jié)構(gòu)和遺傳特性。②宿主細胞:詳細記錄宿主細胞的資料，包括細胞株系名稱、來源、傳代歷史、鑒定結(jié)果及基本生物學特性等。③目標基因序列:目標基因的序列重組人干擾素生產(chǎn)工藝重組人干擾素生產(chǎn)工藝路線有哪幾條，有何缺點？①體外誘生干擾素制備工藝：仙臺病毒誘導人白細胞：血漿→人白細胞（病毒誘導）→分離純化→人白干擾素。缺點：產(chǎn)量低，1gIFNα需要105L人血白細胞，來源困難，工藝復雜，收率低，價格昂貴，潛在的血源性病毒污染的可能性。②Namalva（病毒培養(yǎng)8000L。缺點：活性低，退出臨床應用。③工程菌構(gòu)建→發(fā)酵培養(yǎng)→包涵體→復性→重組人干擾素。工藝特點：發(fā)酵過程，隨后變?nèi)粵]有擺脫潛在的傳播血源性疾病的危險。分泌表達，產(chǎn)量低，成本高，過程控制嚴格?？梢宰龅綗o血清培養(yǎng)。⑤基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝。工藝特點：發(fā)酵周期短：幾個小時，無需變性、復性過程，獲得有活性產(chǎn)品，純化過程：淘汰抗體親和層析，制劑中采用非人血清白蛋白新型保護劑，使得整個制造過程中不使用任何血液提取成分。重組人干擾素發(fā)酵工段的關(guān)鍵控制點是什么，如何實現(xiàn)最優(yōu)化過程控制？①搖瓶培養(yǎng)：搖瓶培養(yǎng)：30℃，pH7.0，250rpm，16-20h；②種子罐培養(yǎng)：接種：接入50L種子罐，接種量10%培養(yǎng)：30℃，pH7.0控制：級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。干擾素純化工藝的原理是什么？基于蛋白質(zhì)的電荷性除去雜質(zhì)，準確控制緩沖液和上樣液的pH及電導值，純化干擾素干擾素純化工藝過程中各工段的目的是什么？①溶解粗干擾素：配置緩沖液（磷酸緩沖液，濾器和10ku超濾系統(tǒng)，百級層流下收集，冷卻至②等點沉淀與疏水層析：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液（擾素。用NaOH調(diào)節(jié)上清液pH7.0，并用5MNaCl調(diào)節(jié)溶液電導值180ms/cm，上樣，進2-100.025M（pH7.0）+1.6MNaCl進行洗滌，除去非疏水性蛋白。用0.01M磷酸緩沖液進行洗脫，收集洗脫液，干擾素?；颌诘入婞c沉淀與鹽析：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5，調(diào)節(jié)電導值40ms/cm，2-10℃靜置過夜，1000ku超濾膜過濾，除去大蛋白。調(diào)整溶液pH8.0，10ku超濾膜，0.005M緩沖液。③陰離子交換層析與濃縮：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）平衡樹脂，鹽濃度線性梯度5~50ms/cm進行洗脫，2-10℃，配合SDS收集干擾素峰。把目標餾分合并，調(diào)整溶液pH和電導值，10ku超濾膜，0.05M醋酸緩沖液（5.0）中透析。④陽離子交換層析與濃縮：用0.1M醋酸緩沖液（pH0.5）平衡樹脂。上樣，相同緩沖液沖洗。鹽濃度線性梯度5-50ms/cm進行洗脫，配合SDS收集干擾素峰。合并餾分，10ku超濾膜系統(tǒng)。NaCl的0.01M⑥無菌過濾分裝：0.22μm膜過濾干擾素溶液，分裝，-20℃以下的冰箱中保存。動物細胞培養(yǎng)制藥工藝與制藥有何關(guān)系？葡萄糖代謝：糖酵解為主，生成丙酮酸和乳酸。丙酮酸經(jīng)TCA循環(huán)，氧化產(chǎn)生CO2和水，釋放能量。葡萄糖一小部分進入PPP途徑，生成4、5、7碳糖和NADPH。谷氨酰胺：作為氮源，轉(zhuǎn)氨、脫氨（為主合成代謝的前體。氨基酸在粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體上，以mRNA為模板，進行密碼翻譯，生成蛋白質(zhì)的細胞系糖基化特征不同，要根據(jù)藥物的結(jié)構(gòu)選擇適宜細胞系。制藥動物細胞系的種類和特點有哪些？e.g.2BS0代，雞胚0代，小鼠8代）合于制藥工業(yè)生產(chǎn)。人源細胞系：Namalwa，WI-38，MRC-5哺乳動物細胞系：CHO，貼壁或懸浮培養(yǎng)，對剪切力和滲透壓有較高的忍受能力。BHK-21，C127，Vero雜交瘤細胞系：脾臟B細胞與骨髓瘤細胞通過原生質(zhì)體融合，獲得的雜交細胞。無血清培養(yǎng)，高密度懸浮生長，容易轉(zhuǎn)染和生長，大量分泌和高效表達與大腸桿菌和酵母系統(tǒng)相比，哺乳動物源細胞系統(tǒng)制藥的優(yōu)缺點，如何選擇？CHO細胞：Chinesehamsterovary2n=22。特點：BHK-21細胞，貼壁生長，適合于牛乳頭病毒DNAVero細胞：多倍體核型，貼壁依賴性。Vero6最為常用，增至病毒，生產(chǎn)疫苗。它們與基因工程微生物的異同是什么？性？。氨基酸可通過生糖或生酮途徑?jīng)_PH的變化。激素對細胞的生長有刺激作用。貼附因子的作用是讓細胞的貼壁生長。生產(chǎn)用最適動物細胞培養(yǎng)基應該選擇哪種，為什么？合成培養(yǎng)基，組分穩(wěn)定，容易配置。已有幾十種合成培養(yǎng)基，大部分已商品化如何控制動物細胞培養(yǎng)基的質(zhì)量？培養(yǎng)用水質(zhì)：必須按照GMP要求進行制備，除去普通水中的各類元素、有毒或有害物質(zhì)及微生物和熱源，達到純水標準。緩沖液：H2CO3/NaCHO3；NaH2PO4/Na2HPO4；恒定pH。平衡鹽溶液：BBS，由NaCl、無機鹽和葡萄糖、緩沖劑、指示劑組成。滿足細胞對鹽離子、碳營養(yǎng)要求；pH和滲透壓要求；直觀觀察pH。、KH2PO4NaCl。培養(yǎng)物、器皿?洗滌液。倍濃縮液。使用L型氨基酸，對于DL倍。谷氨酰胺不穩(wěn)定，需單獨配置。基質(zhì)依賴性與非依賴性細胞系對培養(yǎng)條件?要求有什么不同？如何滿足？然細胞。非貼壁依賴性細胞：不依賴于生長基質(zhì)，可懸浮生長。淋巴細胞、雜交瘤細胞、腫瘤細胞。適量帶正電荷，細胞被吸附在介質(zhì)上。細胞大規(guī)模培養(yǎng)有幾種方法，有何特點，如何選擇應用？層細胞?培養(yǎng)方法，適合于貼壁依賴性細胞培養(yǎng)。貼壁性依賴性細胞，如雜交瘤細胞。壁依賴性和非貼壁依賴性細胞。④微載體培養(yǎng)。微載體是三維培養(yǎng)系統(tǒng)，有很大?比表面積，細胞貼附于載體上增值，再懸浮于細胞液中，兼具有貼壁和懸浮培養(yǎng)的雙重優(yōu)點。比較微生物發(fā)酵控制過程的異同動物細胞 微生物溫度 在線，恒溫，水套層，電熱片， 三基點，發(fā)酵熱對生長和生產(chǎn)影響加溫 變溫控制，降溫攪拌，泡沫 低轉(zhuǎn)速，加剪切保護劑，消沫劑 基于供氧與混合化學消沫劑與分散劑，機械消沫溶解氧CO2pH

臨界氧濃度需要通入，調(diào)節(jié)pH恒定，緩沖劑，通氣，補料，綜合控制

供氧與耗氧的平衡，臨界氧濃度之上尾氣，呼吸強度三基點，變pH，加酸/堿；緩沖劑，補料代謝檢測與分析 底物消耗，副產(chǎn)物生成，胞內(nèi)謝，分泌補料 補充營養(yǎng)，控制代謝過程放料 解除副產(chǎn)物，收獲產(chǎn)物

底物消耗，產(chǎn)物的生成，生物化學變化解除底物抑制，增加前體解除產(chǎn)物抑制重組人紅細胞生成素的生產(chǎn)工藝rhEPO①SV40病毒?動子的表達載體，在COS-1中瞬時表達hEPO。②昆蟲SF9細胞中桿狀病毒載體表達rhEPO。產(chǎn)率有所改善，糖基化程度較小。③家蠶系統(tǒng)表達，糖基化簡單，藥物在體內(nèi)穩(wěn)定性較低、活性較差等問題。④大腸桿菌表達，僅具體外抗原結(jié)合活性。⑤干擾素-α基因?動子的rhEPO表達載體，BALL-1細胞，產(chǎn)生較高量的rhEPO。⑥CHO、BHK細胞中穩(wěn)定表達，rhEPO與天然EPO結(jié)構(gòu)、活性相似。CHOrhEPO①復蘇：液氮凍存的CHO細胞系在37℃中水浴快速融化。無菌離心，棄上清。②培養(yǎng)：加適量小牛血清，37℃2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)傳三代。③消化：用胰蛋白酶消化貼壁細胞后，制成細胞濃度約為2.5×106個/ml。用于接種。④反應器滅菌：加纖維素載體片及pH7.0的PBS緩沖液，高壓滅菌。⑤接種：排出S緩沖液，加M培養(yǎng)基（含％血清，接入種子細胞。⑥貼壁培養(yǎng)：pH7，<50r/min，37℃，DO50-80%。⑦擴增培養(yǎng)：80－100r/min。pH7，37℃。⑧灌流培養(yǎng)：控制溫度、DO、pH值等培養(yǎng)條件，進行無血清培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)。⑨收獲培養(yǎng)物：連續(xù)收獲，4℃－8℃保存。控制點：①攪拌控制：接種后,攪拌速度緩慢，使細胞貼附于載體上，隨著細胞數(shù)量的增加逐漸提高攪拌速度。②溫度控制：較為嚴格，恒定37℃③pH值控制：7.2-7.4,輸入CO2和碳酸氫鹽溶液維持其恒定。④溶解氧控制：在50-80％的范圍內(nèi)，通入氧氣、空氣、氫氣或氮氣的比例混合氣體。⑤葡萄糖控