細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法第一頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三一、基本概念細(xì)菌內(nèi)毒素與熱原的關(guān)系熱原(Progen)

指臨床上能使哺乳類(lèi)動(dòng)物產(chǎn)生熱原反應(yīng)的物質(zhì)。關(guān)于熱原的定義在學(xué)術(shù)上還有爭(zhēng)論。細(xì)菌內(nèi)毒素(Endotxin)

革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的構(gòu)成成分，具有多種生物活性，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是脂多糖(LPS)。熱原與內(nèi)毒素的關(guān)系在學(xué)術(shù)上仍有爭(zhēng)論，但在GMP的條件下，在藥檢的范疇里，內(nèi)毒素是主要的熱原物質(zhì)，可以說(shuō)無(wú)內(nèi)毒素就無(wú)熱原，控制內(nèi)毒素就控制熱原。第二頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三一、基本概念細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法系利用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中的細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方式，即凝膠法和光度測(cè)定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測(cè)時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測(cè)定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法為準(zhǔn)。第三頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三一、基本概念細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(EU或IU)表示。細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)，用于試驗(yàn)中的鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)及各種陽(yáng)性對(duì)照。第四頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三一、基本概念細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝膠法）或0.005EU/ml（用于光度測(cè)定法）且對(duì)內(nèi)毒素試驗(yàn)無(wú)干擾的滅菌注射用水。試驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性?xún)?nèi)毒素。常用的方法是在250℃干烤30分鐘以上，也可以采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。試驗(yàn)操作過(guò)程應(yīng)防止微生物的污染。第五頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三二、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(凝膠限量法)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（凝膠法）實(shí)驗(yàn)程序如下：一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：試劑、儀器、及用具等二、確定藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）三、計(jì)算供試品的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）或最低有效濃度（MVC）四、鱟試劑靈敏度復(fù)核五、藥品與鱟試劑相容性的初篩試驗(yàn)六、供試品干擾試驗(yàn)以及干擾試驗(yàn)的驗(yàn)證七、供試品日常的內(nèi)毒素限量檢查。第六頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1.儀器、設(shè)備

37±1℃恒溫水浴或適宜的恒溫器具2.器具：凡與供試品或試劑直接接觸的器具必須經(jīng)除熱原處理（250℃干烤30min以上）;塑料用具須確證不干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果.3.試劑內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑、鱟試驗(yàn)用水、

PH調(diào)節(jié)劑。

第七頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三四、確定藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）L=K/ML:供試品的內(nèi)毒素限值,可從《藥典》上查詢(xún)或按以上公式計(jì)算,以EU/ml、EU/mg、EU/U表示K:按照規(guī)定的給藥途徑,人體每公斤體重每小時(shí)可接受的最大內(nèi)毒素劑量,以EU/(kg.h)表示;M:人體每公斤體重每小時(shí)最大用藥劑量,以ml／(kg.h)、mg／(kg.h)或U／(kg.h)表示，中國(guó)人均體重按60公斤計(jì)算，人體表面積按1.62m2計(jì)算。按注射時(shí)間若不足1小時(shí)，按1小時(shí)計(jì)算。供試品每平方米體表劑量乘以0.027即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑量（M)。第八頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三五、鱟試劑靈敏度復(fù)核

1.鱟試劑靈敏度定義：在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，用EU/ml表示。2.目的

2.1考察鱟試劑靈敏度和細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)是否準(zhǔn)確，

2.2考察試驗(yàn)人員操作方法是否正確和試驗(yàn)條件是否符合規(guī)定。3.鱟試劑靈敏度復(fù)核的條件

3.1使用新批號(hào)的鱟試劑，

3.2試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)。第九頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三五、鱟試劑靈敏度復(fù)核4.溶液配制

注：A為內(nèi)毒素水溶液系列；B為陰性對(duì)照編號(hào)內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A2λ/檢查用水檢查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ

4

444B無(wú)／檢查用水---------------2第十頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三五、鱟試劑靈敏度復(fù)核5.反應(yīng)加樣6.結(jié)果判斷：反應(yīng)管倒轉(zhuǎn)180°

陽(yáng)性(+)：凝膠不變形，不從管壁滑脫者陰性(-)：無(wú)凝膠或凝膠不能保持完整，從管壁滑脫者內(nèi)毒素濃度(EU／ml)2λλ0.5λ0.25λNC0.1ml鱟試劑○○○○○○○○○○○○○○○○○○反應(yīng)條件37±1℃，60min±2min第十一頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三五、鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)有效性判斷

NC管必須全部為陰性(--)TAL與內(nèi)毒素水溶液系列：

2λ管均為陽(yáng)性(++++)，

0.25λ管均為陰性(----)

符合以上條件試驗(yàn)有效第十二頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三五、鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果計(jì)算鱟試劑靈敏度的測(cè)定值(λc)計(jì)算：

λc=antilg(∑X／4)X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值(lg)。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度。當(dāng)0.5λ≤λc≤2λ時(shí)，以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。第十三頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三六、鱟試劑靈敏度的選擇

一般為了試驗(yàn)的方便，選擇靈敏度低的鱟試劑，若供試品的限值很小，則應(yīng)選擇靈敏度高的鱟試劑，方便供試品溶液的稀釋和PPC（供試品陽(yáng)性對(duì)照）的制備。

第十四頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三七、供試品溶液的制備供試品溶液的最大稀釋倍數(shù)的計(jì)算

MVD＝CL/λL:供試品的內(nèi)毒素限值；

C：供試品溶液的濃度；當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，C為1ml/ml;當(dāng)L以EU/mg或EU/u表示時(shí)，C的單位為mg/ml或u/ml(注意：當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，C的值不是樣品的濃度，就是1)。第十五頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三七、供試品溶液的制備某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的PH值在6.0～8.0的范圍內(nèi)。(USP、EP一般要求供試品溶液與鱟試劑的混合液的PH值在6.0～8.0的范圍內(nèi)。）

對(duì)于過(guò)酸、過(guò)堿或本身有緩沖能力的供試品，需要調(diào)節(jié)被測(cè)溶液(或其稀釋液)的PH值。第十六頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

八、藥品與鱟試劑相容性初篩試驗(yàn)1.目的：通過(guò)一系列濃度的試驗(yàn)，篩選出對(duì)鱟試驗(yàn)無(wú)干擾的濃度2.作用：確定以后對(duì)樣品作BET常規(guī)檢查的兩個(gè)主要參數(shù)：樣品的有效稀釋范圍或有效濃度范圍，可選擇的鱟試劑的靈敏度范圍。減少干擾試驗(yàn)的盲目性節(jié)省時(shí)間以及成本。第十七頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三九、供試品的干擾試驗(yàn)1.目的：判斷某種檢品在某種濃度下是否適合作內(nèi)毒素檢查。2.原理：比較鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)在水溶液中進(jìn)行和在檢品中進(jìn)行的差異,也即是比較反應(yīng)在不同介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)的差異,無(wú)差異即無(wú)干擾,有差異即有干擾。若沒(méi)有干擾，該濃度可以進(jìn)行日常檢查；若有干擾，則必須排除干擾后才能進(jìn)行日常檢查。第十八頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三九、供試品的干擾試驗(yàn)3.在何種情況下需做干擾試驗(yàn)：新品種建立方法鱟試劑的來(lái)源改變鱟試劑的配方、生產(chǎn)工藝改變供試品的來(lái)源改變供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變?cè)囼?yàn)環(huán)境中發(fā)生了其它有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化。第十九頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三九、供試品的干擾試驗(yàn)編號(hào)內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無(wú)/檢查用水---------------2B2λ/檢查用水檢查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ4444C2λ/供試品溶液供試品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ4444D無(wú)/供試品溶液---------------2①注：A為陰性對(duì)照；B為干擾試驗(yàn)系列；C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列；D為供試品溶液①

USP、EP規(guī)定為4支平行管凝膠法干擾試驗(yàn)溶液的制備第二十頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三九、供試品的干擾試驗(yàn)加樣反應(yīng)NCB溶液(PC系列)C溶液(PPC系列)供試品管內(nèi)毒素濃度(Eu／ml)----2λλ0.5λ0.25λ2λλ0.5λ0.25λ----平行管○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○反應(yīng)條件37±1℃，60min±2min第二十一頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析

試驗(yàn)有效性判斷

---NC管必須全部為陰性

---供試品管必須為陰性

---TAL與內(nèi)毒素水溶液系列：

2λ管均為陽(yáng)性(++++)，

0.25λ管均為陰性(----)

即0.5λ≤Es≤2λ

符合以上條件試驗(yàn)有效。

λ

第二十二頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析按下式計(jì)算系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值(Es和Et)Es=antilg(∑Xs／4)Et=antilg(∑Xt／4)Xs和Xt分別為系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值(lg)。當(dāng)0.5λ≤Es≤2λ且0.5Es≤Et≤2Es

時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無(wú)干擾作用。USP、EP規(guī)定當(dāng)0.5λ≤Es≤2λ且0.5λ≤Et≤2λ時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無(wú)干擾作用。第二十三頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果1(SD表示供試品溶液)E0.5

E0.25

E0.125

E0.06NCEs

++++++++----------0.25Eu／mlSDE0.5

SDE0.25

SDE0.125

SDE0.06NPCEt

++++++++----------0.25Eu／ml

0.5λ≤Es≤

2λ且Es=Et,干擾成立第二十四頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果2：E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++++++------0.125Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt++++++++----------0.25Eu／ml

0.5λ≤Es≤

2λ且Et=2Es,干擾成立第二十五頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果3：E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++----------0.25Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt++++++++++++------0.125Eu／ml

0.5λ≤Es≤

2λ且

Et

=0.5Es,干擾成立第二十六頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果4：增強(qiáng)E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++----------0.25Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt+++++++++++++-----0.104Eu／ml按中國(guó)藥典判斷：試驗(yàn)有效，但內(nèi)毒素供試品溶液系列不符合0.5Es≤Et≤2Es

，則認(rèn)為干擾試驗(yàn)不成立，即供試品在試驗(yàn)濃度下有干擾作用。

按USP、EP判斷:內(nèi)毒素供試品溶液系列0.25λ管（SDE0.5）中有一管呈陽(yáng)性,不符合0.5λ≤Et≤2λ的要求,則認(rèn)為干擾試驗(yàn)不成立，即供試品在試驗(yàn)濃度下有干擾作用。第二十七頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果5：增強(qiáng)E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++++++------0.125Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt+++++++++++++-----0.104Eu／ml按中國(guó)藥典判斷:試驗(yàn)有效，符合0.5λ≤Es≤2λ且0.5Es≤Et≤2Es

，則認(rèn)為干擾試驗(yàn)成立,即供試品在試驗(yàn)濃度下無(wú)干擾作用。按USP、EP判斷:

內(nèi)毒素供試品溶液系列0.25λ管（SDE0.5）中有一管呈陽(yáng)性,不符合0.5λ≤Et≤2λ的要求，則認(rèn)為干擾試驗(yàn)不成立,即供試品在試驗(yàn)濃度下有干擾作用。第二十八頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果6：抑制E0.5

E0.25

E0.125

E0.06NC

++++++++----------SDE0.5

SDE0.25

SDE0.125

SDE0.06NPC

+++---------------

內(nèi)毒素供試品溶液系列2λ管（SDE0.5）中有一管呈陰性，供試品在該濃度下對(duì)凝膠反應(yīng)有抑制作用。第二十九頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果7：抑制E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++++++------0.125Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt

++++--------------0.5Eu／ml按中國(guó)藥典:0.5λ≤Es≤

2λ但

Et

＞2Es,干擾不成立。認(rèn)為供試品在試驗(yàn)濃度下對(duì)凝膠反應(yīng)有抑制作用.按USP、EP:0.5λ≤Es≤

2λ且0.5λ≤

Et≤

2λ

干擾成立。認(rèn)為供試品在試驗(yàn)濃度下對(duì)凝膠反應(yīng)無(wú)干擾作用.第三十頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三十一、舉例：某產(chǎn)品的干擾試驗(yàn)1.試劑試劑名稱(chēng)廠家規(guī)格靈敏度或效價(jià)數(shù)量鱟試劑湛江安度斯0.1ml/支0.25Eu/ml36支工作標(biāo)準(zhǔn)品中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所-------150EU/支1支BET水湛江安度斯50ml/瓶-------------PH調(diào)節(jié)劑湛江安度斯2ml/支-------1支某產(chǎn)品-------100ml:0.4g-------1瓶第三十一頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三十一、舉例：某產(chǎn)品的干擾試驗(yàn)2.制備某產(chǎn)品供試品溶液某產(chǎn)品內(nèi)毒素限值L≤0.6EU/mg最大有效稀釋倍數(shù)MVD=(4mg/ml×0.6EU/mg)/0.25EU/ml=9.6選擇稀釋倍數(shù)為8倍,則其供試液的濃度為0.5mg/ml。供試液(S8)的制備

2.0ml供試品+13.4mlBET水+0.6mlOH-,PH=7.0第三十二頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三十一、舉例：某產(chǎn)品的干擾試驗(yàn)3.內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和內(nèi)毒素供試品溶液的制備：分別用鱟試劑和供試品溶液將同一支內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品按以下步驟稀釋?zhuān)?/p>

0.2ml0.2ml1.0ml

150EU/ml15EU/ml1.5EU/ml0.5EU/ml1.8ml1.8ml2.0ml1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml1.0ml1.0ml第三十三頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三十一、舉例：某產(chǎn)品的干擾試驗(yàn)4.反應(yīng)結(jié)果NCB溶液(PC系列)反應(yīng)終點(diǎn)濃度C溶液(PPC系列)反應(yīng)終點(diǎn)濃度供試品管內(nèi)毒素濃度(Eu╱ml)---0.50.250.1250.060.50.250.1250.06----平行管-++--0.25++--0.25--++--0.25++--0.25-／++--0.25+---0.5／／++--0.25++--0.25／反應(yīng)條件37±1℃，60min±2min第三十四頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三十一、舉例：某產(chǎn)品的干擾試驗(yàn)

5.結(jié)果分析試驗(yàn)有效性判斷：

NC管必須全部為陰性

NPC管必須全部為陰性

TAL與內(nèi)毒素水溶液系列：

2λ管均為陽(yáng)性(++++)，0.25λ管均為陰性(----)

試驗(yàn)結(jié)果符合以上條件，試驗(yàn)有效。

λ

第三十五頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三十一、舉例：某產(chǎn)品的干擾試驗(yàn)按下式計(jì)算系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值(Es和Et)

Es=antilg(∑Xs／4)=antilg［(lg0.25Eu／ml×4)／4］=0.25Eu／mlEt=antilg

(∑Xt／4)=antilg［(lg0.25Eu／ml×3+lg0.5Eu／ml)／4］=0.297Eu／ml0.5λ≤Es≤2λ且0.5Es≤Et≤2Es

，供試品在0.5mg／ml濃度下無(wú)干擾作用。第三十六頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三十二、消除干擾的方法

供試品若經(jīng)干擾試驗(yàn)證實(shí)存在干擾因素，可采用適宜的方法來(lái)消除干擾。消除干擾的一個(gè)重要原則是不能影響供試品中的內(nèi)毒素生物活性。

1.供試品稀釋法

MVD=CL/λ

鱟試劑靈敏度(λ)越高(數(shù)值越小)，供試品的稀釋倍數(shù)越大，干擾越小。第三十七頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三十二、消除干擾的方法

2.物理方法如加熱法(血液制品)、冷析法(甘露醇)3.化學(xué)方法如調(diào)節(jié)PH值(奎諾酮類(lèi))、調(diào)節(jié)金屬離子(血液保養(yǎng)液、FDP)4.生物方法如抗增液的使用，阻斷G因子反應(yīng)，防止假陽(yáng)性；

5.其它方法如過(guò)濾法、溶劑抽提等第三十八頁(yè)，共四十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三十三、檢品的日常檢查

1.經(jīng)過(guò)干擾試驗(yàn)的驗(yàn)證后，則可進(jìn)行檢品的日常內(nèi)毒素檢查，檢查法的反應(yīng)管按以下設(shè)置：

注：A為供試品溶液；B供試品陽(yáng)性對(duì)照(PPC)；C為陽(yáng)性對(duì)照(PC)；D為陰性對(duì)照(NC)編