抗體的檢測(cè)和純化詳解演示文稿

抗體的檢測(cè)和純化詳解演示文稿當(dāng)前第1頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)優(yōu)選抗體的檢測(cè)和純化當(dāng)前第2頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)純化步驟當(dāng)前第3頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)抗體純化的步驟當(dāng)前第4頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)一飽和硫酸銨沉淀法

飽和硫酸氨沉淀是從溶液中分離蛋白質(zhì)的常用方法。這是一種比較原始，非特異性分離技術(shù)。

飽和硫酸氨沉淀法難以得到高純度的抗體。其它大分子蛋白和混入絮狀沉淀中的蛋白會(huì)造成對(duì)抗體的污染。因此把它作為抗體純化的第一步。當(dāng)前第5頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)1，基本原理

高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來(lái)。各種蛋白質(zhì)的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來(lái)沉淀不同的蛋白質(zhì)。這種方法稱之為鹽析。鹽濃度通常用飽和度來(lái)表示。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數(shù)小和不易使蛋白質(zhì)變性而應(yīng)用最廣。當(dāng)前第6頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)2，操作步驟

以腹水或組織培養(yǎng)上清液為例來(lái)介紹抗體的硫酸銨沉淀。各種不同的免疫球蛋白鹽析所需硫酸銨的飽和度也不完全相同。通常用來(lái)分離抗體的硫酸銨飽和度為33%—50%（一）配制飽和硫酸銨溶液（SAS）

1.將767g（NH4）2SO4邊攪拌邊慢慢加到1升蒸餾水中。用氨水或硫酸調(diào)到硫酸pH7.0。此即飽和度為100%的硫酸銨溶液（4.1mol/L,25°C）.。

2.其它不同飽和度銨溶液的配制。當(dāng)前第7頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)（二）沉淀

1.樣品（如腹水）20000′g離心30min，除去細(xì)胞碎片；

2.保留上清液并測(cè)量體積；

3.邊攪拌邊慢慢加入等體積的SAS到上清液中，終濃度為1：14.將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6小時(shí)或攪拌過(guò)夜（4°C），使蛋白質(zhì)充分沉淀。當(dāng)前第8頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)（三）透析

1.蛋白質(zhì)溶液10000′g離心30min（4°C）。棄上清保留沉淀；

2.將沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L疊氮鈉中。沉淀溶解后放入透析袋對(duì)PBS-0.2g/L疊氮鈉透析24-48小時(shí)（4°C），每隔3-6小時(shí)換透析緩沖液一次，以徹底除去硫酸氨；

3.透析液離心，測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量。當(dāng)前第9頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)ProteinA/G親和層析

親和層析是一種快速有效的生物活性物質(zhì)的純化方法,它通過(guò)偶聯(lián)蛋白對(duì)目的蛋白選擇性的吸收和分離,可取得較高的純化效果,且操作簡(jiǎn)便,廣泛地應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室抗體純化。由于產(chǎn)品價(jià)格昂貴,使用成本較高,限制了它的運(yùn)用當(dāng)前第10頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)ProteinA

A蛋白是金黃色葡萄球菌的表面蛋白,分子量為42KD,有6個(gè)不同的IgG結(jié)合位點(diǎn)。其中有5個(gè)位點(diǎn)對(duì)IgG的Fc片段顯示很強(qiáng)的特異性親和力,不同的位點(diǎn)獨(dú)立地與抗體結(jié)合。但I(xiàn)gA,IgM,IgE也可能結(jié)合在配體上,當(dāng)達(dá)到飽和時(shí),一個(gè)A蛋白分子至少可以結(jié)合兩個(gè)IgG分子。A蛋白對(duì)IgG有高親和力和特異性,這一特點(diǎn)使之非常適合用于純化腹水或細(xì)胞培養(yǎng)上清中的單克隆抗體當(dāng)前第11頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)ProteinGG蛋白是一種源自鏈球菌G族的細(xì)胞表面蛋白，一種三型Fc受體。其通過(guò)類似于A蛋白的非免疫機(jī)制與抗體的Fc段結(jié)合。像A蛋白一樣，G蛋白與IgG的Fc區(qū)域特異性結(jié)合，不同的是，ProteinGSepharose還可以特異性低親和地與重鏈的CH1及輕鏈的Cκ結(jié)合而用于純化Fab及F(ab’)2。另外，ProteinG可以廣泛、更強(qiáng)地結(jié)合許多類型的IgG，多克隆IgG及人IgG，同時(shí)血清蛋白結(jié)合水平更低，純度更高，配體脫落也相對(duì)更低。當(dāng)前第12頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)ProteinA-SepharoseCL2-4B親和層析柱分離提純IgG

ProteinA--SepharoseCL24B親和層析法的原理是,A蛋白可與IgG上的Fc段特異性地結(jié)合,與小鼠IgG的各亞類表現(xiàn)為不同的結(jié)合力,結(jié)合的強(qiáng)弱程度依次是:IgG2a>IgG2b>IgG3>IgG1。A蛋白的這種結(jié)合也是具有pH依賴性的,即可利用改變pH及離子強(qiáng)度,純化與其結(jié)合較弱的IgG1。當(dāng)前第13頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)方法腹水的處理取腹水,在4℃,12000g條件下離心15min,以除去較大的凝塊。裝柱將1.5gProteinA-SepharoseCL-4B干粉用6～7ml三蒸水溶解,再用0.02M,pH7.4的磷酸鹽緩沖液(上樣緩沖液)浸泡15min,然后裝入層析柱中。平衡用10倍柱床體積的上樣緩沖液過(guò)柱,流速為1ml/min,pH試紙測(cè)試流出液體的pH為7.4。當(dāng)前第14頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)上樣取預(yù)處理過(guò)的腹水5ml,用上樣緩沖液稀釋至50ml,用0.45μm的濾膜過(guò)濾,上樣,流速為1ml/min。洗脫用上樣緩沖液進(jìn)行流洗,10倍柱床體積,流速為1ml/min。隨后用0.02M,pH4.0的檸檬酸緩沖液洗脫抗體,同時(shí)應(yīng)用AKTAexplorer100進(jìn)行監(jiān)測(cè),當(dāng)觀察到基線開(kāi)始上升,即出現(xiàn)洗脫峰時(shí),取干凈的4ml離心管收集,每收集3ml后,立即用1M,pH9.0的TRis2Hcl緩沖液調(diào)整pH值至7.0。當(dāng)前第15頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)平衡收集洗脫液至洗脫峰回到基線后,繼續(xù)用上樣緩沖液平衡5～10倍柱床體積,流速調(diào)至1ml/min。再用三蒸水平衡10倍柱床體積。7電泳鑒定

采用SDS不連續(xù)丙烯酰胺凝膠電泳(SDS2PAGE),濃縮膠和分離膠濃度分別為120g/L和50g/L,每槽加樣10μl,考馬斯亮藍(lán)R250染色。當(dāng)前第16頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)層析圖及電泳結(jié)果當(dāng)前第17頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)MabSelect系列——大規(guī)?？贵w純化親和層析介質(zhì)MabSelect是一系列最新的大規(guī)模純化抗體的親和層析介質(zhì)。它們的特點(diǎn)包括：更高的流速和動(dòng)態(tài)載量

更低的宿主雜蛋白吸附，抗體純度更高更低的蛋白A脫落更易于工藝的線性放大MabSelect易于清洗與除菌，壽命更長(zhǎng)、更經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)過(guò)程無(wú)動(dòng)物血清成分當(dāng)前第18頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)精度純化目的：保證最終抗體產(chǎn)品純度，能有效對(duì)潛在的污染物，如宿主細(xì)胞蛋白(HCP)、免疫球蛋白、宿主DNA；對(duì)用于腹水生產(chǎn)抗體的刺激物、內(nèi)毒素、其它熱原物質(zhì)、培養(yǎng)液成分、層析凝膠析出成分(脫落的蛋白A配基)進(jìn)行去除；并能有效的去除/滅活病毒。當(dāng)前第19頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)建議的工藝首先采用0.2-0.45m的中空纖維膜技術(shù)進(jìn)行澄清(Cellremoval)；然后用protein-A或protein-B捕獲，酸性條件洗脫后直接pH4.0病毒滅活；澄清過(guò)濾后再穿透方式上CaptoAdhere；這一步離子交換之前或之后會(huì)有一步20nm納濾去病毒；最后50K膜超濾濃縮和洗濾進(jìn)行緩沖液置換。有些抗體如果通過(guò)優(yōu)化結(jié)果不甚滿意，通過(guò)增加一步CaptoQ也基本上可以達(dá)到要求當(dāng)前第20頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)中空纖維膜技術(shù)進(jìn)行澄清對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液，可以將高密度的培養(yǎng)液直接用中空纖維微濾膜(0.22或0.45m)進(jìn)行澄清，而無(wú)需事先經(jīng)過(guò)離心和預(yù)過(guò)濾，步驟少，速度快，收率高，成本低。和離心機(jī)比較，具有極高的澄清度，因此中空纖維澄清后的細(xì)胞培養(yǎng)液可直接進(jìn)蛋白A親和層析進(jìn)行純化。當(dāng)前第21頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)層析精細(xì)純化技術(shù)：目的：去除特定的雜質(zhì)，如HCP、DNA、聚集體和變體等。常用的層析技術(shù)：CaptoAdhere、離子交換、疏水層析等。當(dāng)前第22頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)CaptoAdhere

目的：使抗體分子流穿而聚集體、宿主蛋白、脫落的蛋白A配基等雜質(zhì)結(jié)合在Adhere柱上加以去除去。原理：CaptoAdhere介質(zhì)專為治療用抗體的分離純化而設(shè)計(jì)，其配基(N-Benzyl-N-methylethanolamine）綜合了陰離子交換、氫鍵和疏水等多種復(fù)雜的作用方式，因此對(duì)于抗體的聚集體具有非常獨(dú)特而高效的去除能力；此外，通過(guò)有效的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(DesignofExperiment，DoE)，CaptoAdhere介質(zhì)還可以同時(shí)有效去除泄漏的蛋白A配基、宿主蛋白、核酸、內(nèi)毒素和潛在的病毒，并使得結(jié)合MabSelectSuRe的抗體的兩步層析純化工藝成為現(xiàn)實(shí)步驟：首先，需要優(yōu)化抗體在CaptoAdhere上的結(jié)合條件。（確定的主要影響因素和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍為：電導(dǎo)：2-15mS/cm，每毫升凝膠上樣載量為75-300mg/ml(流穿模式)，pH范圍需要做起始結(jié)合條件確定：通常在低電導(dǎo)條件下(如2mS/cm時(shí))樣品完全不結(jié)合到有少量樣品結(jié)合的pH條件）當(dāng)前第23頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)CaptoAdhere其次（HTPDPredictor）：確定好實(shí)驗(yàn)條件后，可以同時(shí)平行做所有不同的結(jié)合條件，將試驗(yàn)結(jié)果相應(yīng)于響應(yīng)因子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析合并分析結(jié)果可以得到滿足實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)的操作范圍。結(jié)果和優(yōu)勢(shì)：流穿模式的CaptoAdhere將宿主蛋白、脫落的蛋白A和聚集體降低到很低的水平，載量可達(dá)100-200mg/ml介質(zhì)，單步收率>90%。此外，CaptoAdhere還具有很強(qiáng)的病毒去除的能力，如MVM病毒的去除能力可達(dá)5.9個(gè)Log。。當(dāng)前第24頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)將MabselectSuRe和CaptoAdhere相結(jié)合進(jìn)行兩步層析純化。MabselectSuRe可以達(dá)到>99%的抗體純度，親和洗脫峰使用Captoadhere的流穿模式進(jìn)行精純:使抗體分子流穿而聚集體、宿主蛋白、脫落的蛋白A配基等雜質(zhì)結(jié)合在Adhere柱上加以去除。這樣僅用兩步層析就可以得到符合藥用級(jí)質(zhì)量要求的高純度抗體產(chǎn)品，大大縮短了工藝時(shí)間，提高生產(chǎn)效率，同時(shí)增加了收率，降低了生產(chǎn)成本。兩步層析工藝當(dāng)前第25頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)

完善工藝整合中的其它問(wèn)題1，核酸和內(nèi)毒素的去除。2，脫落親和配基(蛋白A)的去除。a,陰離子交換層析是去除蛋白A-IgG復(fù)合物。b,陽(yáng)離子交換層析也可以去除蛋白A配基。3,抗體制品的病毒去除/滅活及驗(yàn)證。低pH孵育、加熱、S/D(溶劑/去污劑)、納濾等當(dāng)前第26頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)1，核酸和內(nèi)毒素的去除。當(dāng)前第27頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)2，脫落親和配基(蛋白A)的去除。a,陰離子交換層析是去除蛋白A-IgG復(fù)合物。b,陽(yáng)離子交換層析也可以去除蛋白A配基。3,抗體制品的病毒去除/滅活及驗(yàn)證。低pH孵育、加熱、S/D(溶劑/去污劑)、納濾等當(dāng)前第28頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)特異雜質(zhì)含量驗(yàn)證DNA含量：DNA分子雜交法測(cè)定。（<100pg/一劑量）熱原（內(nèi)毒素）：家兔法等試劑。（<5EU/Kg）病毒含量：Scale-down。（工藝除病毒能力需達(dá)到10log以上）當(dāng)前第29頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)單克隆抗體的濃縮目的方法：凍融濃縮法原理：凍融處理后的樣品，其溶質(zhì)集中在濃縮管的下端，越近管底濃度越高當(dāng)前第30頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)ELISA------

徐順

胡堅(jiān)

李靜一當(dāng)前第31頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)1.

ELISA的原理2.

ELISA的類型3.試劑準(zhǔn)備：免疫吸附劑結(jié)合物酶底物的準(zhǔn)備4.對(duì)照設(shè)定5.標(biāo)本的采取和保存6.結(jié)果判斷

當(dāng)前第32頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)ELISA（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)是一種免疫測(cè)定試驗(yàn)。

基礎(chǔ):抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。1.

ELISA的原理當(dāng)前第33頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)酶免疫測(cè)定類型

這種固相酶免疫測(cè)定方法在1971年最初建立時(shí)稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定，簡(jiǎn)稱ELISA。酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測(cè)定均相酶免疫測(cè)定非均相酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定當(dāng)前第34頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)1.1抗原抗體反應(yīng)

可逆性

抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一種動(dòng)態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+Ab→Ag·Ab

抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab],Ag·Ab的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。當(dāng)前第35頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)特異性

抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。

測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。

當(dāng)前第36頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)最適比例

當(dāng)前第37頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)敏感性化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5-10μg/ml免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。當(dāng)前第38頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)2.1雙抗原夾心法測(cè)抗體

用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。2

ELISA的類型當(dāng)前第39頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)2.2間接法測(cè)抗體

傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。當(dāng)前第40頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)2.3競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體

當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。

當(dāng)前第41頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)2.4捕獲包被法測(cè)抗體IgM的檢測(cè)常用于傳染病的診斷。用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期診斷。當(dāng)前第42頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)3.ELISA的試劑(A、B、C三部分)ELISA中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液當(dāng)前第43頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)ELISA的試劑準(zhǔn)備A

固相載體聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。當(dāng)前第44頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)當(dāng)前第45頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)3.1.2包被的方式

將抗原或抗體固定在過(guò)程稱為包被(coating)。

蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。當(dāng)前第46頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)當(dāng)前第47頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)3.1.3包被用抗體IgG對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液.須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗(yàn)的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。當(dāng)前第48頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)包被的條件 pH9.6碳酸鹽緩沖液

pH7.2的磷酸鹽緩沖液

pH7-8的Tris-HCL緩沖液。加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過(guò)夜，37℃中保溫2小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。當(dāng)前第49頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)3.1.5封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。所有的ELISA固相均需封閉？當(dāng)前第50頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)3.1.6洗滌液在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液。當(dāng)前第51頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)

ELISA的試劑準(zhǔn)備B

3.2結(jié)合物

即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISA中關(guān)鍵的試劑1酶的催化活性

2抗體（或抗原）的免疫活性

3含有或少含有游離的抗體（或抗原）

4結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。當(dāng)前第52頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)當(dāng)前第53頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)3.2.1結(jié)合物用的抗原和抗體

制備結(jié)合物時(shí)所用純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。當(dāng)前第54頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)酶純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。當(dāng)前第55頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)3.2.3結(jié)合物的制備酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和重復(fù)性好。交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。（2）過(guò)碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過(guò)碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成chiff氏堿而結(jié)合。簡(jiǎn)便有效.當(dāng)前第56頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)

結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測(cè)定。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè)，效果更好。制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的最佳靈敏度，達(dá)到最合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。當(dāng)前第57頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)結(jié)合物的保存

酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉）。當(dāng)前第58頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)3.2.5結(jié)合物的稀釋液

用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上：0.1%牛血清白蛋白，0.05%吐溫20。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時(shí)不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達(dá)6個(gè)月。當(dāng)前第59頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)試劑準(zhǔn)備

C酶的底物當(dāng)前第60頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)當(dāng)前第61頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)3.3酶的底物3.3.1

HRP的底物OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。DH2+H2O2

D+2H2O

上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS。E當(dāng)前第62頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為450nm。ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。HRP對(duì)氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過(guò)氧化物和尿素過(guò)氧化物(ureaperoxide)。當(dāng)前第63頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。當(dāng)前第64頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)3.5酶反應(yīng)終止液常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。當(dāng)前第65頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)4對(duì)照設(shè)定

陽(yáng)性對(duì)照品(positivecontrol)和陰性對(duì)照品(negativecontrol)是檢驗(yàn)