人促紅細胞生成素在細胞上的表達

人促紅細胞生成素在細胞上的表達第一頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六促紅細胞生成素的理化性質(zhì)

EPO是由165個氨基酸組成的高糖基化蛋白質(zhì)，去唾液酸或去糖基化不影響重組人EPO的體外生物活性，但卻縮短了在體內(nèi)的半衰期，使其完全喪失了在體內(nèi)的活性，說明糖基對其生物活性是至關(guān)重要的，因此基因工程的EPO不能利用原核表達系統(tǒng)，只能利用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)（如CHO細胞）生產(chǎn)第二頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六關(guān)于EPO人促紅細胞生成素是一種由腎臟產(chǎn)生的高度糖基化蛋白,是紅系細胞發(fā)育過程中最重要的調(diào)節(jié)因子。天然存在的EPO藥源極為匱乏,須從貧血病人尿中提取,不能滿足社會的需要。1985年Jacob等成功地從胎兒肝中克隆出EPO基因,使通過基因工程手段大量生產(chǎn)重組EPO成為可能。第三頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六關(guān)于EPO國外用人促紅細胞生成素gDNA(genomicDNA)在哺乳動物細胞中已獲得高效表達,而在我國雖也有重組產(chǎn)品問世,但存在表達水平偏低,生產(chǎn)成本偏高的問題,不能滿足大規(guī)模工廠化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用的需要,因此迫切需要提高EPO在細胞中的表達量。為此,我們開展了EPO在CHO細胞中的表達研究,希望能獲得比較理想的效果。第四頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六實驗?zāi)康模韩@得人促紅細胞生成素(EPO)的高效表達第五頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六三、實驗儀器及耗材實驗試劑與器材氨甲喋呤(MTX)、煌焦油藍購于Sigma公司;rHuEPO體內(nèi)生物學活性測試工作標準品為Amgen公司產(chǎn)品;Lipofectamine、犢牛血清、F12與D-MEM細胞培養(yǎng)基購自Gibco/BRL公司;EPOELISAkit購自BoehringerMannheim公司;96孔與24孔細胞培養(yǎng)板為Costar產(chǎn)品。第六頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六三、實驗儀器及耗材實驗材料菌株DH5α,JM109均由本實驗室保存。質(zhì)粒質(zhì)粒pD、p38(內(nèi)含EPOgDNA)由本實驗室保存,pcDNA3購自Invitrogen公司,pSV40dhfr由PaulBerg實驗室構(gòu)建,本實驗室保存。工具酶各種限制性內(nèi)切酶均購自華美生物工程公司,T4DNA連接酶與牛小腸堿性磷酸酶購自Gibco/BRL公司,DNA聚合酶I大片段(Klenow)購自Promega公司第七頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六三、實驗儀器及耗材細胞株CHO-dhfr-細胞由本室保存。實驗動物雌性BALB/c小鼠,6~8周齡。第八頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六方法以EPOgDNA為基礎(chǔ)構(gòu)建了兩個真核表達載體pDE、pCE,將它們分別經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細胞,其48h瞬時表達量分別為27·5ng/ml與88·90ng/ml。然后用氨甲喋呤(MTX)對轉(zhuǎn)染細胞進行加壓并挑選細胞克隆,共獲得3株高效表達EPO的工程細胞株A,B,C,其中A來自質(zhì)粒pCE,B和C來自pDE,在2×10-6mol/L的MTX的壓力下,它們48h的最高表達水平分別為A:8·7μg/mlB:10·76μg/ml,C:16·44μg/ml。經(jīng)網(wǎng)織紅細胞法測得它們均具有體內(nèi)生物活性。第九頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六網(wǎng)織紅細胞計數(shù)

(一)原理網(wǎng)織紅細胞是晚幼紅細胞脫核后但尚未完全成熟的紅細胞,胞質(zhì)中尚有核糖體、核糖核酸等嗜堿性物質(zhì)殘存,經(jīng)煌焦油藍或新亞甲藍活體染包后,胞質(zhì)中可見藍或藍綠色枝點狀甚至網(wǎng)織狀結(jié)構(gòu)。

(二)方法活體染色法.近年來還可通過某些血液自動分析儀及流式細胞術(shù)檢測法進行網(wǎng)織紅細胞計數(shù)。第十頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六四·實驗步驟質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、酶切、去磷、連接、重組子質(zhì)粒的鑒定等基因操作

細胞的轉(zhuǎn)染按lipofectamine使用說明書進行,在此過程中質(zhì)粒要經(jīng)特定的內(nèi)切酶線性化,在pCE中采用BglⅡ,pDE則采用EcoRⅠ,其中質(zhì)粒pCE要與經(jīng)EcoRⅠ線性化的質(zhì)粒pSV40-dhfr共轉(zhuǎn)染。細胞克隆的篩選CHO-dhfr-細胞在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48h后,經(jīng)胰蛋白酶消化后進行細胞計數(shù),用F12培養(yǎng)液將其稀釋成1×104cells/ml,置37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當細胞形態(tài)恢復正常后,換用D-MEM培養(yǎng)液置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),約15d后出現(xiàn)肉眼可第十一頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六實驗步驟見的細胞克隆此時可用彎頭吸管挑取細胞克隆至96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),同時在培養(yǎng)液中添加MTX,其初濃度為1×10-8mol/L,以每10d為一個周期,倍比地提高MTX的濃度。在適當?shù)臅r候?qū)?6孔板內(nèi)的細胞轉(zhuǎn)入24孔細胞培養(yǎng)板中,然后再轉(zhuǎn)入30ml細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),至此細胞克隆工作即告完成。在挑選克隆的過程中,應(yīng)挑取加壓后表達水平提高較明顯的細胞株,而非一開始表達量較高的細胞。細胞表達上清中EPO含量的檢測采用BoehringerMannheim公司的EPOELISAkitEPO生物活性的測定采用網(wǎng)織紅細胞計數(shù)法第十二頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六五·實驗結(jié)果1·真核表達載體pDE、pCE的構(gòu)建

將質(zhì)粒p38經(jīng)SalⅠ酶切后,回收長為2·4kb的EPOgDNA片段,除EPO蛋白編碼區(qū)外,其5’非翻譯區(qū)長120bp,3’非翻譯區(qū)長200bp。同時將真核表達載體pD、pcDNA3分別用SalⅠ、HindⅢ線性化,線性化的pD經(jīng)CIP去磷后與EPO基因片段按適當?shù)谋壤郎睾线B接,獲得重組質(zhì)粒pDE;將線性化的質(zhì)粒pcDNA3與EPO基因片段均經(jīng)Klenow補平,并且將線性化的pcDNA3經(jīng)CIP去磷,兩者按適當比例混合后用T4DNA連接酶連接,得重組質(zhì)粒pCE。質(zhì)粒pCE與pDE的物理圖譜如下。第十三頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六實驗結(jié)果第十四頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六·2瞬時表達結(jié)果將質(zhì)粒用lipofectamine轉(zhuǎn)染CHO細胞后48h,收集細胞上清,經(jīng)PBS稀釋100倍后,用ELISA測定其EPO的濃度,結(jié)果見表1。第十五頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六3穩(wěn)定表達·經(jīng)MTX篩選后得到的三個高表達細胞株A、B、C,在MTX的濃度為2×10-6mol/L時,測定它們48h細胞上清中EPO的濃度,樣品均用PBS稀釋10000倍,結(jié)果見表2。第十六頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六4EPO體內(nèi)生物活性的測定

經(jīng)過網(wǎng)織紅細胞法,測得工程細胞株A,B,C48h穩(wěn)定表達上清中的EPO含有體內(nèi)生物活性,其體內(nèi)活性值分別為A:848·3IU/ml,B:1049·1IU/ml,C:1602·9IU/ml。第十七頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六六·討論真核基因表達不僅可以生產(chǎn)大量的感興趣蛋白,而且在細胞遺傳學與生物學中具有廣泛的應(yīng)用,因此研究基因在真核細胞中的表達具有極其重要的理論及實踐意義。外源基因在哺乳動物細胞中的表達受許多因素的影響,如轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后處理、翻譯水平以及翻譯后加工等方面,其中尤以轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)最為重要。在細胞中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是由基因的順式作用元件與細胞內(nèi)存在的反式作用因子之間的相互作用來實現(xiàn),由于在特定的細胞內(nèi),反式作用因子是固定的,不可改變的,因此基因的表達主要取決于其順式作用元件的作用。第十八頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六對外源基因而言,也就是決定于特定的表達載體中的啟動子,一個合適的啟動子可將外源基因的表達水平提高幾倍甚至幾十倍。但是對于特定的基因和細胞,各啟動子起始轉(zhuǎn)錄的效率有很大的差別,因此我們認為在進行外源基因的表達研究中,應(yīng)考慮選用幾種不同的強啟動子,才有可能獲得較為理想的表達效果。目前外源蛋白在真核細胞中的穩(wěn)定表達均采用了選擇擴增系統(tǒng),其中以二氫葉酸還原酶基因擴增系統(tǒng)研究最為清楚,應(yīng)用最為廣泛?？梢酝ㄟ^MTX的漸次加壓選擇而進行極大地增加外源基因的拷貝數(shù),從而提高外源蛋白的產(chǎn)量。第十九頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六有關(guān)文獻報道認為與dhfr基因共轉(zhuǎn)染的DNA傾向于同它一起整合于細胞染色體的共同區(qū)域,當用MTX進行加壓篩選時,它們將同時進行擴增。但我們的研究表明共轉(zhuǎn)染時加壓效果不明顯,這可能是由于它們并未整合于染色體的相同位點所致。因此我們認為最好選用dhfr基因與目的基因串聯(lián)在一起的載體來進行表達,加壓效果較為明顯。我們的表達結(jié)果明顯高于國內(nèi)報