羊肚菌菌種質(zhì)量檢驗規(guī)程

PAGE2PAGE3羊肚菌菌種質(zhì)量檢驗規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了羊肚菌菌種質(zhì)量檢驗的術(shù)語和定義、抽樣、感觀檢驗、雜菌及害蟲檢驗、菌種鑒定、菌種活力檢驗、栽培檢驗、判定規(guī)則和檔案管理等。本文件適用于XX省境內(nèi)羊肚菌母種、原種和栽培種的質(zhì)量檢驗。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T12728食用菌術(shù)語GB/T30989高通量基因測序技術(shù)規(guī)程NY/T1284食用菌菌種中雜菌及害蟲的檢驗NY/T1846食用菌菌種檢驗規(guī)程3術(shù)語和定義食用菌術(shù)語應(yīng)符合GB/T12728的要求，下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1羊肚菌Morchellasp.隸屬子囊菌門（Ascomycota）、盤菌綱（Discomycetes）、盤菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（Morchella），因其外表凹陷狀似羊肚而得名。羊肚菌肉質(zhì)鮮美脆嫩，香味獨特，具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值。3.2菌核Sclerotium真菌生長到一定階段，菌絲體不斷地分化，相互糾結(jié)在一起形成一個顏色較深而堅硬的菌絲體組織顆粒。由擬薄壁組織和疏絲組織形成的一種堅硬的休眠體，條件合適時，菌核萌發(fā)子實體、菌絲和分生孢子等。4抽樣按照NY/T1846的規(guī)定執(zhí)行。5感官檢驗按照NY/T1846的規(guī)定執(zhí)行。6雜菌及害蟲檢驗羊肚菌母種、原種、栽培種的雜菌及害蟲檢驗按照NY/T1284的規(guī)定執(zhí)行。7菌種鑒定7.1菌絲體培養(yǎng)將活化好的羊肚菌菌絲塊接種于液體土豆培養(yǎng)基（土豆200g煮汁過濾，葡萄糖20g，自來水1000mL，pH自然），20℃靜置培養(yǎng)7~10d，紗布過濾留下菌絲體，用無菌水反復(fù)清洗干凈，再用滅菌濾紙吸干水分，－20℃保存或直接使用。7.2基因組DNA提取羊肚菌母種、原種、栽培種基因組DNA的提取按照附錄A的方法進(jìn)行，也可以選用DNA提取商業(yè)試劑盒，要求得到的DNA濃度不低于50ng/μl，1.7<A260/A280<2.0，X脂糖凝膠電泳結(jié)果條帶清晰。7.3PCR擴(kuò)增選擇ITS通用引物ITS1/ITS4：TCCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序按照附錄B的方法進(jìn)行。7.4電泳檢測采用1.0%X脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄電泳條帶，通常黑色羊肚菌類條帶大小約800bp，黃色羊肚菌類條帶大小約1200bp，條帶大小正確且無其他雜帶，送測序公司按照GB/T30989方法進(jìn)行雙向測序。7.5數(shù)據(jù)庫比對將獲得的測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blastn比對（s:///），初步分析測序菌種的分類地位。7.6系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建下載可信的羊肚菌ITS參考序列，利用軟件CLUSTAL進(jìn)行多序列比對，用軟件MEGA通過最大簡約法（maximumparsimony，MP）和鄰位相連法（neighbourjoining，NJ）分別構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，初步確定測序菌株的分類地位。8菌種活力檢驗8.1平板繼代培養(yǎng)方式在含PDA固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央接種初始菌種的菌塊，20℃避光培養(yǎng)2~3d，當(dāng)菌絲生長至距離培養(yǎng)皿邊緣約1cm處時，用打孔器取菌絲前端直徑0.5cm的圓形菌塊，轉(zhuǎn)接至新的PDA培養(yǎng)皿中繼代培養(yǎng)。8.2菌塊萌發(fā)檢驗菌塊在接種6~10h后萌發(fā)。8.3菌絲生長速率檢驗采用十字交叉法分別在培養(yǎng)1d、2d、3d時測量羊肚菌菌落直徑，羊肚菌菌絲生長速率計算公式見附錄C，不同菌種的生長速率略有差異，一般20℃恒溫培養(yǎng)的平均生長速率大于1cm/d。8.4菌絲長勢檢驗菌落邊緣整齊，長勢強勁。8.5菌核檢驗培養(yǎng)5~10d菌落上產(chǎn)生白色顆粒，培養(yǎng)14d顆粒變成黃棕色菌核；不產(chǎn)生菌核的菌種不宜用于栽培生產(chǎn)。8.6菌落顏色檢驗培養(yǎng)10~15d菌落無色素或色素較淺；色素產(chǎn)生多，時間早的菌種不宜用于栽培生產(chǎn)。8.7菌絲微觀形態(tài)檢驗培養(yǎng)2~3d后使用體視顯微鏡觀察主菌絲和二級菌絲分枝的夾角，夾角小于30°。9栽培檢驗9.1試驗場地一般在溫控房、現(xiàn)代化菇房或人工氣候培養(yǎng)箱，溫度能夠控制在4~20℃，光線可控。9.2試驗栽培方式采用塑料筐或床架進(jìn)行栽培試驗，每個菌種栽培面積不少于3m2，且至少有3個隨機小區(qū)重復(fù)，栽培管理與規(guī)模化栽培相同。9.3菌種萌發(fā)檢驗播種1~3d后菌絲萌發(fā)。9.4菌霜檢驗播種5~10d菌絲在土壤中迅速擴(kuò)延，產(chǎn)生適量的菌霜（分生孢子）。9.5外源營養(yǎng)袋利用檢驗外源營養(yǎng)袋內(nèi)充滿羊肚菌菌絲，營養(yǎng)袋變扁，重量減輕。9.6羊肚菌原基檢驗土壤表面產(chǎn)生大量原基，部分原基有分化為幼菇的趨勢。10判定規(guī)則10.1合格菌種菌種的感官檢驗、雜菌及害蟲檢驗、菌種活力檢驗、栽培檢驗等均符合標(biāo)準(zhǔn)要求的為合格菌種。10.2不合格菌種菌種的感官檢驗、雜菌及害蟲檢驗、菌種活力檢驗、栽培檢驗有任何一項不符合標(biāo)準(zhǔn)要求的為不合格菌種。10.3適宜栽培生產(chǎn)的菌種菌種鑒定為梯棱羊肚菌或六妹羊肚菌或七妹羊肚菌的為適宜栽培生產(chǎn)的菌種。11檔案管理菌種質(zhì)量檢驗檔案應(yīng)有電子檔案和紙質(zhì)檔案保存，檔案內(nèi)容包括感官檢驗、雜菌及害蟲檢驗、菌種鑒定、菌種活力檢驗、栽培檢驗的結(jié)果與記錄。附錄A羊肚菌基因組DNA提取方法將菌絲體加入液氮研磨成粉末，取約0.1g粉末轉(zhuǎn)移至無菌的2ml離心管中；加入700μl裂解液（CTAB2%，pH=8.0）65℃裂解1.5~2.0h，每隔10min顛倒混勻；12000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管；加入等體積的PCA（苯酚:氯仿:異戊醇=25:24:1），緩慢混勻；12000r/min離心10min，取上清液加入等體積CA（氯仿:異戊醇=24:1），緩慢混勻；12000r/min離心10min，取上清液加入2倍體積的無水乙醇，緩慢混勻，置－20℃靜置1h以上；12000r/min離心10min棄上清留下DNA沉淀；用1mL75%乙醇清洗DNA沉淀，離心棄上清；用含1%RNaseA的TE緩沖液（Tris-HCl10mmol/L，EDTA1mmol/L）或滅菌雙蒸水溶解沉淀。分別采用超微量分光光度計和1%X脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和質(zhì)量。附錄BPCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序PCR擴(kuò)增體系：10×PCRBuffer5μl，dNTPs5μl，引物ITS1/ITS4各1μl，Taq聚合酶0.5μl，模板DNA2μl，雙蒸水35.5μl。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸60sec，30個循環(huán)；最后72℃延伸7min。附錄C（資料性附錄）羊肚菌菌絲生長速率計算公式菌絲生長速率（V1，mm·d-1）公式：V1=（D-d）/2TD為菌落平均直徑（mm），d為接種塊直徑（mm），T為培養(yǎng)天數(shù)（d）。附錄D（資料性附錄）羊肚菌菌種質(zhì)量檢驗檔案編號：菌種名稱菌種來源菌種級別接種日期保藏條件