中藥制劑的藥理、毒理學(xué)試驗(yàn)技術(shù)要求

中藥制劑的藥理、毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求一、概述（一）安全性評(píng)價(jià)目的安全、有效是藥物制劑必要具備的兩大要素，因此正確評(píng)價(jià)藥物的安全性和有效性，具有同等重要的意義。毒理學(xué)研究是保證藥物安全性評(píng)價(jià)的重要一環(huán)，是藥物開發(fā)研究中以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)客觀地反映其安全性的科學(xué)方法，符合臨床需要。中藥制劑毒理學(xué)研究的目的，在于揭示藥物固有的毒性，認(rèn)識(shí)毒性的性質(zhì)及程度，了解毒性反映的靶器官（特別是首先出現(xiàn)毒性的靶器官）及毒性反應(yīng)的可逆性。它一方面為臨床安全用藥提供導(dǎo)向，如藥物的毒性大小，中藥的先兆癥狀是什么？如何監(jiān)測？毒性產(chǎn)生后的可逆程度及恢復(fù)時(shí)間等；另一方面為確定臨床治療劑量提供依據(jù)，如通過對(duì)動(dòng)物的最小致死量（或最大耐受量）與藥效學(xué)有效劑量的比值，估算出藥物的安全范圍，為臨床用藥的可變動(dòng)范圍提供重要參考；最后，它為確定藥物臨床禁忌癥提供參考。（二）安全性評(píng)價(jià)必要性1、由于歷史條件的限制，絕大多數(shù)中藥或傳統(tǒng)成方制劑沒有進(jìn)行過系統(tǒng)的現(xiàn)代毒理學(xué)研究。2、藥用有效組分或單體成分中藥制劑的研制，其安全性不容忽視。3、采用新的給藥途徑的中藥制劑，如中藥注射劑或氣霧劑，更應(yīng)注意進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。4、新資源的開發(fā)，如人工制劑、代用品等，也需進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。（三）安全性評(píng)價(jià)的范圍除新藥五類制劑外，所有新藥都應(yīng)該作毒性試驗(yàn)。毒性試驗(yàn)分急毒性試驗(yàn)、長期毒性試驗(yàn)和特殊毒性試驗(yàn)三大類。其中新藥藥材一類和新藥制劑一類需進(jìn)行上述三項(xiàng)試驗(yàn)，藥材和制劑二、四類僅需作前兩項(xiàng)毒性試驗(yàn)。此外還有一些特殊規(guī)定，如：中藥注射劑應(yīng)進(jìn)行必要的制劑安全性試驗(yàn)（如熱原試驗(yàn)、刺激性試驗(yàn)、過敏試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)等）；新藥制劑四類僅改變劑型及制劑工藝，提取工藝未改變者，可視情況免作毒性試驗(yàn)。（四）安全性評(píng)價(jià)的基本要求《中藥新藥研究指南》（藥學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)）中，規(guī)定了中藥新藥毒理學(xué)研究的基本要求，包括以下幾方面內(nèi)容：（1）試驗(yàn)人員及承擔(dān)科研單位應(yīng)符合規(guī)定條件；（2）受試物的穩(wěn)定與臨床用藥的一致性；（3）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從業(yè)人員應(yīng)具資格，持證上崗，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)符合國家規(guī)定的等級(jí)動(dòng)物要求；（4）實(shí)驗(yàn)條件設(shè)施及組織管理應(yīng)基本上符合規(guī)范化要求；（5）試驗(yàn)設(shè)計(jì)要有針對(duì)性；（6）試驗(yàn)記錄應(yīng)采用先進(jìn)、科學(xué)、可靠的儀器，標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，并注意原始資料的保存；（7）資料整理及符合形式審查要點(diǎn)。二、急性毒性試驗(yàn)（一）試驗(yàn)?zāi)康挠^察受試物一次或一天內(nèi)2~3次給予動(dòng)物后產(chǎn)生的急性毒性反應(yīng)和死亡情況；或觀察動(dòng)物在最大給受試物體積和濃度的條件下，不產(chǎn)生死亡的最大耐受量。（二）試驗(yàn)材料1、動(dòng)物選用體重18?22克，6?8周齡的健康小鼠（同次試驗(yàn)體重相差不超過2克）。大鼠6?8周齡；體重120?150克，同次試驗(yàn)體重相差不超過10g。2、受試物溶于水的做成溶液，不溶于水的可用0.5%較甲基纖維素鈉，或10%阿拉伯膠制成混懸劑。（三）試驗(yàn)方法1、半數(shù)致死量（LD50）的測定（1）劑量選擇：一般選用4?5個(gè)劑量組，各劑量組間間距應(yīng)根據(jù)受試物毒性大小和預(yù)試結(jié)果而定，一般以0.65?0.86為宜。（2）給受試物途徑及體積：給藥途徑：三、四、五類新藥制劑可選擇與臨床試驗(yàn)的途徑相一致。一、二類新藥應(yīng)采用兩種途徑給藥，其中一種應(yīng)為推薦臨床研究的給藥途徑。水溶性好的藥物還應(yīng)測定靜脈給藥的急性毒性?？诜幬飸?yīng)灌胃給藥。給藥體積：小鼠禁食（12?16h），不禁水；大鼠禁食（12?16h），不禁水，其給藥體積見表1。表1大、小鼠給藥體積灌胃^） 靜脈內(nèi)（iv） 腹腔內(nèi)（ip） 皮下（sc）小鼠給藥體積 W0.4ml/10g W0.5ml/只 W0.5ml/只 W0.5ml/只大鼠給藥體積 W3ml/只 W1.0ml/只 W1.5ml/只 W1.0ml/只（3）實(shí)驗(yàn)分組和觀察：試驗(yàn)時(shí)，將動(dòng)物按體積隨機(jī)分成4?5組，每組至少10只動(dòng)物（雌雄各半），給受試物后即刻觀察動(dòng)物反應(yīng)情況，每天觀察一次，連續(xù)觀察7-14天。記錄動(dòng)物毒性反應(yīng)情況及死亡動(dòng)物分布。觀察毒性反應(yīng)，應(yīng)注意記錄動(dòng)物的外觀、行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、食欲（飼料消耗

量）、大小便及其顏色、被毛、膚色、呼吸、鼻、眼、口腔無異常分泌物，體重變化及死亡情況，見表2,表3。死亡動(dòng)物應(yīng)及時(shí)進(jìn)行尸檢，記錄病變情況。若有肉眼可見變化時(shí)則需進(jìn)行病理檢查。（4）結(jié)果處理、實(shí)驗(yàn)報(bào)告和結(jié)果評(píng)價(jià)表2嚙類動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)中應(yīng)注意出現(xiàn)癥狀和檢查方法器官系統(tǒng) 檢查方法 毒性表現(xiàn)中樞和動(dòng)物 行為神經(jīng)系統(tǒng)異常運(yùn)動(dòng)中樞和動(dòng)物 行為神經(jīng)系統(tǒng)異常運(yùn)動(dòng)對(duì)刺激的反應(yīng)神經(jīng)反射（含翻正反射）肌張力植物神經(jīng)系統(tǒng)瞳孔分泌物呼吸系統(tǒng) 鼻呼吸及其頻率心血管系統(tǒng) 心前區(qū)觸診胃腸系統(tǒng) 大便腹部形態(tài)泌尿生殖系統(tǒng)陰唇、乳腺會(huì)陰部皮膚和皮毛顏色、完整性眼眼瞼眼球其他注射部位一般狀態(tài)行為變化、不正常叫聲、躁動(dòng)不安或靜伏少動(dòng)抽搐、震顫、麻痹、局部肌肉抽動(dòng)、強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)煩躁易怒、冷漠、感覺過敏、抑制狀態(tài)遲鈍、喪失僵硬、松馳縮小、擴(kuò)大流涎、流淚分泌物急促、過慢、陳式呼吸、Kussmaul氏呼吸心室顫動(dòng)、心動(dòng)過緩、心律不齊、心博過強(qiáng)或微弱腹瀉、便秘（溏便、不成形、量多、堅(jiān)硬、量少）黑色或土色脹氣、收縮腫脹骯臟充血、紫紺、蒼白、發(fā)疹、豎毛、皮毛松馳下垂凸出、震顫、透明度降低腫脹異常姿態(tài)、消瘦等不同性別，給受試物不同途徑應(yīng)分別列表若發(fā)現(xiàn)中毒反應(yīng)和死亡率有動(dòng)物性別的明顯差別，則應(yīng)選擇性別比較敏感的動(dòng)物進(jìn)行復(fù)試。試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)詳細(xì)具體，包括試驗(yàn)日期、動(dòng)物的規(guī)格、性別、數(shù)量、受試動(dòng)物來源及含量、試驗(yàn)方法。LD50值及其95%可信限，以及各劑量組和死亡率，或最大耐愛量的值及其相當(dāng)于臨床劑量的倍數(shù)。詳細(xì)報(bào)告實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物出現(xiàn)的中毒表現(xiàn)及致死癥狀，綜合評(píng)價(jià)受試物毒性大小。2、最大耐受量（MTD）的測定當(dāng)受試物毒性較低，測不出LD50時(shí)，可以測定一次或一日最大耐受量，也可反映受試物的毒性情況。這在中藥急性毒性試驗(yàn)中經(jīng)常見到。（1）方法：最大濃度，一般以灌胃給藥時(shí)，藥液的粘滯度能通過灌胃針頭為準(zhǔn)。若液體劑型或注射液為提高劑量，也可適當(dāng)濃縮；但由于滲透壓、PH等限制，也不宜過濃，以濃縮2~3倍為限。需注意許多中藥制劑含揮發(fā)油，加熱濃縮時(shí)易致?lián)]發(fā)油損耗，影響試驗(yàn)的可信性。最大體積，可參考ld50測定時(shí)給藥體積的最大值。

表3急性毒性試驗(yàn)報(bào)告表制劑 批號(hào)試驗(yàn)日期 年月 給藥途徑 環(huán)境溫度 ℃ 環(huán)境濕度動(dòng)物品種 品系 供應(yīng)單位 合格證號(hào)周齡 體重 實(shí)驗(yàn)前禁食時(shí)間最大耐受量（MTD）測定劑量動(dòng)物數(shù)（只）死亡率（%）MTD值金早癥狀譜毒性反應(yīng)程度（級(jí)）自發(fā)活動(dòng)異常肌肉運(yùn)動(dòng)對(duì)外界反應(yīng)瞳孔分泌物大便膚色眼呼吸其他增多減少抽搐麻痹異常步態(tài)過敏冷漠?dāng)U大縮小流涎流淚稀便便秘色澤異常蒼白紫紺充血眼球突出眼瞼下垂興奮抑制 -二三四（格內(nèi)填入各級(jí)反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)，毒性反應(yīng) …S的/一實(shí)驗(yàn)單位： 等級(jí)：一級(jí)最輕，四級(jí)最重） 實(shí)驗(yàn)負(fù)責(zé)人： （職稱）實(shí)驗(yàn)參加者： 原始資料保存地點(diǎn)： 聯(lián)系人： 實(shí)驗(yàn)資料表4列出，用適宜的統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算LD50值（推薦用Bliss統(tǒng)計(jì)法）表4受試物劑量對(duì)數(shù)劑量動(dòng)物數(shù)死亡動(dòng)物數(shù)死亡率機(jī)率單位ld50及可信限（mg/kg） （X） （只） （只） （％） （Y）常用方法；①在測定中藥新藥ld50時(shí)，如僅高劑量組出現(xiàn)少量動(dòng)物死亡，而此時(shí)的最大劑量組已達(dá)該受試藥的最大濃度和最大體積，則可以以未出現(xiàn)動(dòng)物死亡的最大一檔劑量，作為該受試物的最大耐受量。②測定ld50預(yù)試驗(yàn)中未出現(xiàn)動(dòng)物死亡，則可采用推薦臨床的給藥途徑。以最大濃度下最大容積，一次給予20只動(dòng)物（雌雄各半），或一日內(nèi)每隔4~6小時(shí)連續(xù)2~3次給藥，觀察動(dòng)物是否出現(xiàn)死亡，以不引起死亡的最大累計(jì)劑量，作為最大耐受量，如均未出現(xiàn)動(dòng)物死亡，則可以認(rèn)為其最大耐受量大于三次累加劑量。或認(rèn)為受試物對(duì)某種動(dòng)物給藥途徑的LD50大于某一數(shù)值（g/kg）。測定最大耐受量，同樣也應(yīng)嚴(yán)密觀察動(dòng)物毒性反應(yīng)情況，要求與觀察ld50的毒性反應(yīng)相同。（2）結(jié)果處理：計(jì)算出總給予藥量g/kg（合生藥量g/kg表示），推算出相當(dāng)于臨床用藥量的倍數(shù)。三、動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)資料及文獻(xiàn)資料的基本要求包括：摘要、試驗(yàn)?zāi)康?、試?yàn)材料、試驗(yàn)方法和結(jié)果、主要參考資料、實(shí)驗(yàn)單位出具的證明。一、摘要簡要途述受試藥物、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)結(jié)果（寫明LD50值及95%可信限或最大耐受量，動(dòng)物的毒性反應(yīng)，死亡原因和病理變化）和結(jié)論。二、試驗(yàn)?zāi)康谋砻鬟M(jìn)行本試驗(yàn)研究的目的。如“觀察受試物XXX一次給予動(dòng)物后所產(chǎn)生的急性毒性反應(yīng)和死亡情況。或在受試物未測出ld50值時(shí)，測定其最大耐受量”。三、受試藥物（一〕名稱受試藥物名稱應(yīng)與申報(bào)資料0—21相一致應(yīng)寫全稱。（二）提供單位、批號(hào)提供單位應(yīng)是受試物的主研單位，如為兩個(gè)單位或以上共同研制，應(yīng)注明。批號(hào)應(yīng)是供該項(xiàng)試驗(yàn)使用的受試物的批號(hào)，應(yīng)注意供急毒、長毒和藥效動(dòng)物試驗(yàn)研究的受試物應(yīng)為同一批號(hào)。（三）含量、效價(jià)、制劑標(biāo)示量首先寫明受試物的規(guī)格，如XXX膠囊的規(guī)格為：2g生藥/0.5g內(nèi)容物/粒，12粒/板，2板/盒。再寫出受試物的服法，如上述膠囊劑的服法為：口服，2粒/次，3次/日。最后根據(jù)其規(guī)格和服法計(jì)算出臨床劑量，如上述膠囊劑的成人臨床日用劑量二（2g生藥/粒義2粒/次義3次/日）?60kg體重=0.2g生藥/kg體重/日。資料中應(yīng)寫出計(jì)算程序，以便審核。我國成人的體重一般為：男60kg；女50kg。（四）配制方法在臨用時(shí)用蒸餾水或生理鹽水配成所需濃度藥液，以“g原生藥/ml”。表示。如該受試物能求出ld50時(shí)，可先配成一定濃度的藥液，然后按倍比稀釋法配制所需濃度藥液。如該受試物不能求出ld50時(shí)，應(yīng)配成灌胃針頭所能允許通過的最大濃度藥液供試驗(yàn)用。（五）溶劑如制劑采用特殊溶劑對(duì)，應(yīng)注明，并用該溶劑配制藥液，同時(shí)在試驗(yàn)中設(shè)該溶劑對(duì)照組。四、動(dòng)物（一）來源、種屬、品系、合格證標(biāo)出每次試驗(yàn)所用動(dòng)物的種屬和品系，尤其是寫明動(dòng)物的生產(chǎn)單位及生產(chǎn)合格證明號(hào)，試驗(yàn)時(shí)動(dòng)物飼養(yǎng)觀察單位的使用合格證，并應(yīng)附以上合格證的復(fù)印件。（二）體重除寫明供試驗(yàn)用動(dòng)物的平均體重外，還應(yīng)寫出其體重分布情況，并標(biāo)示其鼠齡。（三）性別注意有些實(shí)驗(yàn)可用一種性別動(dòng)物（如受試物為主治婦科疾病者，或受試物出現(xiàn)明顯性別差異時(shí)）。（四〕動(dòng)物數(shù)此處標(biāo)明的動(dòng)物數(shù)應(yīng)與試驗(yàn)資料中所用動(dòng)物數(shù)相一致，否則應(yīng)說明出現(xiàn)差異的原因，如動(dòng)物外逃或給藥操作不當(dāng)致死等。五、試驗(yàn)方法（一）給藥途徑與臨床一致，如不一致說明理由。一般應(yīng)有兩種或兩種以上給藥途徑，如僅選擇與臨床一致的給藥途徑，也應(yīng)說明不選擇其它途徑的理由，如許多口服制劑（片劑，膠囊等）水溶性差，不宜靜脈給藥。（二）藥量以折合生藥量或浸膏量表示中藥制劑如膠囊、片劑的重量，需折合生藥量表示。如某膠囊每粒內(nèi)容物重0.3g，相當(dāng)于生藥量的1.2g，即4g生藥/g內(nèi)容物。（三）給藥最大濃度，最大體積的具體量資料中應(yīng)明確寫出給藥的最大濃度和最大體積的具體量，如XXX藥物給小鼠灌胃給藥的最大濃度為4g生藥/ml,最大體積為40ml/kg/次，3次/日。（四）詳細(xì)記錄動(dòng)物異常反應(yīng)，寫出動(dòng)物死亡原因，病理變化記錄動(dòng)物出現(xiàn)異常反應(yīng)的性別分布、百分率，潛伏期和持續(xù)時(shí)間，按系統(tǒng)描述異常反應(yīng)的癥狀。動(dòng)物死亡的時(shí)間分布情況，歸納出致死的主要原因，描述動(dòng)物可能出現(xiàn)的病理變化.如有明顯的肉眼變化，應(yīng)作病理組織學(xué)檢查。上述實(shí)驗(yàn)資料最好列表顯示，并注意不同性別及給受試物不同途徑應(yīng)分別列表表示。（五）推算最大耐受量相當(dāng)臨床用藥倍數(shù)及給出計(jì)算方法寫出完整的計(jì)算程序和采用的計(jì)算方法。對(duì)最大耐受量應(yīng)求出相當(dāng)臨床用藥的倍數(shù)。在計(jì)算LD50時(shí)，對(duì)計(jì)算所用實(shí)驗(yàn)資料應(yīng)用表列出表中內(nèi)容包括受試物劑量.對(duì)數(shù)劑量、動(dòng)物數(shù)、死亡動(dòng)物數(shù)（按姓別列出）、死亡率和機(jī)率單位等.為了全面表達(dá)出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在測出在計(jì)算LD50時(shí)，還應(yīng)求出其95%可信限和LD50。來表示誤差限度和量效關(guān)系.（六）寫出動(dòng)物死亡原因，附病理檢驗(yàn)報(bào)告“要明確中毒的靶器官，并附病理檢驗(yàn)報(bào)告和照片。六、結(jié)果以表格表示可采用上述表格表示七、結(jié)論應(yīng)包括最大耐受量LD50及95%可信限，其相當(dāng)臨床用藥的倍數(shù)，中毒的主要癥狀和靶器官或組織，死亡的主要原因，并對(duì)受試