PMA聯(lián)合鈣離子載體誘導K562細胞向樹突狀細胞分化

PMA聯(lián)合鈣離子載體誘導K562細胞向樹突狀細胞分化【摘要】目的探討卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯聯(lián)合鈣離子載體誘導K562細胞向樹突狀細胞分化的作用。方法對數(shù)生長期的K562細胞在含PMA和CI的培養(yǎng)液中培養(yǎng)96h后，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，用流式細胞儀檢測細胞表型，用MTT法檢測其刺激淋巴細胞增殖的能力。結果PMA聯(lián)合CI組細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，表面出現(xiàn)許多細小的突起，細胞表面CD83、CD86、CD80、CD40、HLADR和CD1a表達上調，并且可以刺激淋巴細胞的增殖反應。結論PMA聯(lián)合CI可以有效地使K562細胞向DC分化。

【關鍵詞】K562細胞樹突細胞十四酰佛波乙酯鈣通道離子載體

ABSTRACT:ObjectiveToexploretheeffectofPMA(phorbolmyristateacetate)andcalciumionophore(CI)ininducingthedifferentiationofleukemiacelllineK562intoactivateddendriticcells(DC).MethodsK562cellswereculturedinacommonmediumcontainingCI(A23187)andPMAfor96h.Thecellmorphologywasobservedunderthelightphasecontrastmicroscopeandtheelectronicmicroscope.TheviabilityrateofK562cellsculturedineachgroupwasexaminedbythetrypanbluestaining.Theimmunologicphenotypeswereanalyzedbyflowcytometry.TheproliferationreactionoflymphocytecellswasdetectedbyMTTcolorimetry.ResultsAfter96htreatmentwithA23187(375ug/ml)andPMA(10μg/mL),thecellsexhibitedthecharacteristicDCmorphology,CD83,CD86,CD80,CD40andHLADR,CD1aexpressionwasupregulatedandthecellswerefoundtobeabletostronglystimulatetheproliferationofallogeneicTcellswhenculturedwiththem.ConclusionCIincombinationwithPMAcaninduceK562cellstodifferentiateintoDCs.

KEYWORDS:K562cells;dendriticcells;tetradecanoylphorbolacetate;calciumchannels;ionophores

福建醫(yī)科大學學報2008年7月第42卷第4期曾曉明等：PMA聯(lián)合鈣離子載體誘導K562細胞向樹突狀細胞分化樹突狀細胞是體內最強的抗原提呈細胞，來源于髓系祖細胞。在白血病的細胞中，DC的祖細胞和白血病細胞同樣來源于骨髓造血干細胞，因此可以刺激原始細胞分化成DC，直接呈遞完整的白血病抗原，從而刺激T細胞產生抗腫瘤效應[1]。筆者觀察了卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbolmyristateacetate，PMA)聯(lián)合鈣離子載體誘導K562細胞向DC分化的作用,探討運用細胞株進行抗白血病免疫治療的可行性。

1材料與方法

材料

K562細胞株由福建醫(yī)科大學藥理學研究所饋贈。CI、PMA為Sigma公司產品。RPMI1640干粉為美國Gibco公司產品。胎牛血清(FCS)為杭州四季青生物制品公司產品。異硫氰酸熒光素標記的抗HLADR、CD80單抗，PE標記的抗CD86，CD83，CD40和CD1a單抗及同亞型對照抗體，均為美國eBioscience公司產品。絲裂霉素C為上海Roche公司產品。6孔培養(yǎng)板、96孔培養(yǎng)板均為Coasta公司產品。L谷氨酰胺、MTT及臺盼藍制劑為廈門泰京生物工程有限公司產品，人淋巴細胞分離液為天津市灝洋生物制品科技有限責任公司產品。

方法

K562細胞培養(yǎng)及形態(tài)觀察

取對數(shù)生長期的K562細胞，以完全RPMI1640培養(yǎng)基懸浮，以1×106mL-1接種于6孔板中，每孔2mL，分4組。PMA+CI組：加入PMA和CI,使PMA最終濃度為10ng/mL，CI最終濃度為375ng/mL；PMA組：只加入PMA，PMA最終濃度為10ng/mL；CI組：只加入CI，CI最終濃度為375ng/mL；對照組：只加培養(yǎng)基。每組細胞為一板，37℃、體積分數(shù)為的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天半液換量。實驗組另外加入半量新鮮試劑，對照組只補充新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)96h后收獲細胞。形態(tài)觀察。收獲4組細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。細胞活率測定。收獲各實驗組的K562細胞，按臺盼藍1滴、K562細胞9滴的比例混合均勻，30s滴于細胞計數(shù)板上，顯微鏡下計數(shù)。

計算細胞活率=不染色細胞/×100％

電鏡觀察

收獲的細胞經離心沉淀，用%戊二醛和%餓酸固定，經乙醇梯度脫水，超薄切片置透射電鏡觀察。

流式細胞儀檢測

收獲的細胞用PBS洗滌2次后重懸成體積100μL，加入FITC標記的抗HLADR和CD80單抗，PE標記的抗CD86、CD83，CD40和CD1a單抗及同亞型對照抗體20μL，室溫孵育30min，PBS洗滌3次，用流式細胞儀檢測。

同種混合淋巴細胞反應

人外周血淋巴細胞的分離和培養(yǎng)

抽取健康人外周血20mL，用淋巴細胞分離液密度梯度離心分離，吸取中間層單個核細胞層，洗滌3次，用1640完全培養(yǎng)基重懸浮，于6孔板37℃、體積分數(shù)為的CO2培養(yǎng)4h后，輕輕吸取未貼壁細胞，為外周血淋巴細胞，備用。

MTT比色法測定

取PMA+CI組培養(yǎng)96h后收獲的K562細胞，用PBS洗滌2次，用含10％的FCS的RPMI1640培養(yǎng)基懸浮，調整細胞濃度5×105mL-1，加入終濃度為25μg/mL的絲裂霉素C，37℃、體積分數(shù)為的CO2孵育30min去增殖后，用PBS洗滌2次，分別調整細胞濃度為5×103，×103，1×103mL-1，與上述淋巴細胞共同接種于96孔板中，每孔終體積為180μL，刺激細胞和效應細胞比分別為1∶100，1∶200，1∶500，每孔設3個復孔。同時，將沒有經過實驗處理的K562細胞以同樣的方法和淋巴細胞接種于96孔板內。另設相同濃度的單獨效應細胞對照孔及單獨DC對照組、單獨靶細胞對照組對照孔，每孔同樣設3個復孔，在37℃、體積分數(shù)為的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h，在培養(yǎng)結束前4h每孔加入MTT20μL，培養(yǎng)結束后離心棄上清，加入二甲基亞砜(DMSO)150μL，酶標儀于490nm波長檢測吸光度，計算實驗孔和未處理孔增殖倍數(shù)。

實驗孔增殖倍數(shù)=/淋巴細胞對照孔

對照孔增殖倍數(shù)=/淋巴細胞對照孔

2結果

顯微鏡觀察

PMA+CI組的細胞變大，表面出現(xiàn)許多細小的突起，部分細胞死亡，細胞數(shù)與對照組相比有所減少。PMA組的細胞也變大，但突起不明顯，死亡的細胞較多，數(shù)量明顯減少。CI組細胞稍變大，但沒有發(fā)現(xiàn)細胞突起，也沒有引起細胞死亡，數(shù)量上與對照組也沒有很大的差別。

細胞活率

各實驗組的細胞活率：PMA+CI組為%，PMA組為%，CI組為%，對照組為99%。

電鏡觀察

PMA+CI組的細胞體積增大，形狀不規(guī)則，細胞質有突起，細胞核清晰，線粒體豐富，粗面內質網發(fā)達，可見溶酶體。

流式細胞儀檢測

與對照組比較，PMA+CI組細胞表面分子CD80、CD83、CD83、CD40L、CD1a、HLADR都有明顯的表達上調。而單用PMA和單用CI組與對照組比較無明顯不同。表1K562細胞經PMA聯(lián)合CI誘導96h后的細胞表型

混合淋巴細胞反應

PMA+CI組與對照組的淋巴細胞增殖反應見圖4。PMA+CI組在DC∶淋巴細胞為1∶100，1∶200，1∶500均可見淋巴細胞增殖反應，以1∶100時最強，達200％以上，而對照組的增殖倍數(shù)都沒有超過100％，即淋巴細胞沒有發(fā)生增殖反應。

形狀不規(guī)則，細胞質有突起，細胞核清晰，線粒體豐富，粗面內質網發(fā)達，可見溶酶體.

3討論

Choudhury等采用慢性粒細胞白血病患者的骨髓細胞，經體外誘導成DC，這些DC帶有CML細胞的特異性抗原bcr/abl融合基因，可以激活T細胞產生特異性的細胞毒性T淋巴細胞效應，對白血病細胞進行殺傷溶解[1]。本實驗室也曾采集CML患者的骨髓細胞在體外誘導可轉化為DC，這種DC同樣表達腫瘤抗原，在同CML骨髓細胞共同培養(yǎng)后，可以使CML腫瘤細胞減少，為CML的體外凈化提供了一條可能的治療途徑。

用白血病細胞株也可以在體外誘導分化成DC[23]，白血病細胞株來源方便，同質性好。但研究表明，白血病細胞誘導生成的DC表面分子表達不充分，分析認為，可能由于不同的刺激因子只是部分激活了DC分化的機制，不能全面誘導DC成熟。Mohamed等分析了不同的刺激因子誘導腫瘤細胞生成DC的作用認為，比起細胞因子，CI和PMA可以使細胞分化得更為成熟?？赡苁墙浻杉毎蜃咏閷Ъ毎只男盘杺鲗緩娇赡茉谀[瘤細胞中存在缺陷，而CI和PMA是直接刺激下游信號的介質，可以繞過這些途徑而引起細胞的分化。

筆者采用PMA聯(lián)合CI誘導K562細胞，經過4d的培養(yǎng)，觀察到細胞周圍有細小的突起，檢測其表達免疫表型CD80、CD86、CD83、CD40、MHCI/Ⅱ分子，發(fā)現(xiàn)比對照組有明顯的上調。混合淋巴細胞培養(yǎng)也顯示，比對照組具有明顯的淋巴細胞增殖效應。單用CI誘導K562細胞，沒有發(fā)現(xiàn)有形態(tài)上的變化，其免疫表型和對照組也沒有很大的區(qū)別，這也和本實驗室以往的研究結果一致。雖然采用CI已證實可以在體外使CML患者的外周血或骨髓單個核細胞分化成具有抗原提呈功能的DC，但單用CI看來不足以使K562細胞分化。可能的解釋是，K562是增殖旺盛的細胞株，需要更強的誘導分化刺激。單用PMA的實驗結果是細胞死亡率比較高，和Mohamed等實驗結果一致，可能由于PMA是一種化學誘導劑，對細胞的毒性作用比較大。本實驗在淋巴細胞增殖反應上采用了比其他實驗更低的效靶比，同樣發(fā)現(xiàn)有相當強烈的增殖效應，說明采用這種方法誘導生成的DC具有很強的刺激淋巴細胞增殖的能力。

筆者認為，采用PMA聯(lián)合CI誘導K562細胞，可以使其獲得典型DC的形態(tài)特征、免疫表型和刺激同種混合淋巴細胞增殖的功能，使這種類DC的細胞更加具有成熟DC的特征，為臨床上獲取DC進行免疫治療提供了一種更加方便和可靠的方法，有可能成為抗白血病治療新的手段，當然，K562細胞作為腫瘤細胞，其應用的安全性還需要進一步的研究和探討。

【參考文獻】

[1]ChoudhuryA,GajewskiJL,LiangJC,etal.UseofleukemicdendriticcellsforthegenerationofantileukemiccellularcytotoxicityagainstPhiladelphiachromosomepositivechronicmyelogenousleukemia[J].Blood，1997,89(4):11331142.

陳君敏,陳志哲,魏秀妹.自體樹突狀細胞用于慢性粒細胞白血病骨髓凈化的初步研究[J].福建醫(yī)科大學學報,2001,35(1):3639.

LindnerI,KharfanDabajaMA,AyalaE,etal.InduceddendriticcelldifferentiationofchronicmyeloidleukemiablastsisassociatedwithdownregulationofBCRABL[J].JImmunol,2003,171(4):17801791.

KharfanDabajaM,AyalaE,LindnerI,etal.Differentiationofacuteandchronicmyeloidleukemicblastsintothedendriticcelllineage:analysisofvariousdifferentiationinducingsignals[J].CancerImmunolImmunother,2005,54(1):2536.

郜峰,陳君