正交實(shí)驗(yàn)法篩選千斤拔多糖的提取分離工藝

正交實(shí)驗(yàn)法篩選千斤拔多糖的提取分離工藝【摘要】目的研究千斤拔多糖的提取分離的最佳工藝條件。方法采用正交設(shè)計(jì)法篩選。結(jié)果千斤拔多糖的最佳提取分離工藝為：采用加熱回流法，石油醚回流3h；濾渣用乙醚回流5h；濾渣用95%乙醇回流5h，濾渣用18倍量提取3次，2h/次，提取液濃縮至10ml，加入乙醇后使溶液中乙醇的濃度約為90%，靜置8h后抽濾，真空干燥即得千斤拔多糖粗品。結(jié)論該實(shí)驗(yàn)為千斤拔多糖的提取分離的條件提供了參考，為千斤拔的進(jìn)一步開發(fā)研究提供了依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】千斤拔多糖提取分離工藝正交設(shè)計(jì)

常見婦科疾病以經(jīng)前期綜合征、陰道炎癥、乳腺增生三大疾病最為明顯，其中陰道炎癥為常見和多發(fā)婦科疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前市面上治療效果和銷量較好的婦科千金片對陰道炎癥有良好的治療作用，為女性婦科炎癥首選藥物。千斤拔為其君藥?！吨袊幍洹?005版Ⅰ部中收載千斤拔為豆科植物蔓性千斤拔Moghaniaphilippinensis(Merr.etRolfe)Li.、大葉千斤拔Moghaniamacrophylla(Willd.)或繡毛千斤拔Moghaniaferruginea(Benth.)Li.的干燥根［1］，用于治療風(fēng)濕痹痛、腰腿痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損、陽痿、遺精、婦科病、乳房疾病等病癥［2］。蔓性千斤拔、大葉千斤拔分布較廣，主產(chǎn)于江西、福建、臺灣、湖北、湖南、廣西、廣東、四川等省區(qū)［3］。文獻(xiàn)報道千斤拔含有多糖、黃酮、生物堿、β-谷甾醇等多種成分［2］。多糖是一類天然大分子物質(zhì),多糖參與了細(xì)胞各種生命活動的調(diào)節(jié)。大量的藥理和臨床研究表明植物多糖類化合物是一種免疫調(diào)節(jié)劑,它具有激活免疫細(xì)胞、改善機(jī)體免疫功能等作用［4］?！吨袊幍洹飞形词蛰d千斤拔的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，目前未見有關(guān)千斤拔多糖成分的研究報道。本文分別考察了不同提取方法、不同濃度、時間、物料比條件下提取千斤拔多糖的工藝，以期為安全、可控、有效地利用該藥材和新藥開發(fā)研究打下堅(jiān)實(shí)的科學(xué)基礎(chǔ)。

1材料與儀器

UV-752分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；SHB-3循環(huán)多用真空泵；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；hh-2數(shù)顯恒溫水浴鍋；hctp11b5托盤天平；正德牌遠(yuǎn)紅外可控調(diào)溫電爐；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；KQ-250B型超聲波清洗器。(+)葡萄糖(AR，105℃干燥至恒重)；其他試劑均為分析純。千斤拔藥材購于成都藥材市場，經(jīng)劉圓博士鑒定為蔓性千斤拔Moghaniaphilippinensis(Merr.etRolfe)Li.的根。苯酚試劑［5］:取苯酚150g，加鋁片g和碳酸氫鈉g，蒸餾，收集182℃餾份。稱取10g，加水200ml溶解，置棕色瓶內(nèi)放冰箱中備用。

2方法

以改良苯酚-硫酸法［5］測定千斤拔多糖的含量。

線性關(guān)系考察

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品70mg，用水稀釋成為700μg·ml-1的對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液，，，，，，ml置50ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，再精密吸取ml于具塞試管中。各管精密加入%苯酚溶液［3］ml，搖勻，迅速分別滴加濃硫酸ml，搖勻后放置5min，置沸水浴中加熱15min，取出冷至室溫后，于490nm處測定吸光度值。以濃度C(μg·ml-1)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=68,r=6(n=6)。結(jié)果表明，在～μg·ml-1之間，葡萄糖濃度與吸收度值具有良好的線性關(guān)系。

粗多糖樣品溶液的制備精密吸取定容后的粗多糖溶液20ml置100ml容量瓶中，稀釋至刻度，精密吸取2ml顯色，備用。

精密度實(shí)驗(yàn)取同一樣品溶液，重復(fù)測定吸光度6次，RSD為%。結(jié)果表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取樣品溶液，每隔h測定吸光度值，連續(xù)4h，RSD為%。結(jié)果表明樣品穩(wěn)定性良好。

加樣回收實(shí)驗(yàn)精密稱取已知多糖含量的粗多糖溶液1ml，3份，依次加入不同量的葡萄糖對照品溶液，取“”項(xiàng)下的對照品溶液，按“”項(xiàng)下測吸光度供試品溶液的制備方法，自“各管精密加入%苯酚溶液ml”起，依法操作，測得樣品吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求多糖的含量，并以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作對比測定，計(jì)算多糖回收率為%，RSD為%。

提取物中多糖含量測定精密吸取定容后的粗多糖溶液20ml置100ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，精密量取ml置10ml具塞試管中，按“”項(xiàng)下測吸光度供試品溶液的制備方法，自“各管精密加入%苯酚溶液ml”起，依法操作，測得樣品吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求多糖的含量。粗多糖得率(%)=沉淀重量×多糖含量÷稱樣量×100%。

3結(jié)果

單因素考察

考察石油醚、乙醚、乙醇脫脂的必要性取千斤拔干燥粉末7份，精密稱定，一份直接用水回流提取；一份用石油醚回流6h。濾過，取濾渣，揮去溶劑后用水回流提取；一份用石油醚提取，藥渣揮去溶劑后用乙醚回流提取6h，藥渣揮去乙醚后用水回流提??；一份直接用乙醚直接回流提取6h，藥渣揮去乙醚后用水回流提??；一份用石油醚提取，藥渣揮去溶劑后用乙醚回流提取6h，藥渣揮去乙醚，再用95%乙醇回流6h，藥渣揮去乙醚后用水回流提??；一份直接用95%乙醇直接回流提取6h，藥渣揮去透劑后用水回流提??；一份用石油醚提取，藥渣揮去溶劑后用95%乙醇回流提取6h，藥渣揮去溶劑后用水回流提取。結(jié)果顯示用石油醚、乙醚、95%乙醇都回流提取后，脫脂效果最好。

考察石油醚、乙醚、95%乙醇回流時間分別逐步考察千斤拔藥材分別經(jīng)石油醚、乙醚、95%乙醇回流2，3，4，5，6，7h后，濾過，溶液在200～400nm進(jìn)行全波長掃描。確定其最佳回流時間。結(jié)果表明，石油醚的最佳提取時間為3h；乙醚的最佳提取時間為5h；95%乙醇的最佳提取時間為5h。

考察不同的提取溫度對千斤拔多糖粗品提取量的影響稱取千斤拔干燥粉末約5g，5份，精密稱定，各精密加入100ml石油醚，分別回流3h，過濾，藥渣揮去石油醚，分別精密加入100ml乙醚，分別回流5h，過濾，藥渣揮去乙醚，分別精密加入95%乙醇100ml，分別回流5h，過濾，揮干藥渣，分別于藥渣中加入100ml水，一份直接加熱使沸騰回流2h，另4份濾渣分別用60，50，80，90℃的水溫浸2h。濾過后，濾液定容至500ml，按“”項(xiàng)下方法測定。結(jié)果表明，沸水回流者所提出的粗多糖最多，故選用沸水回流提取千斤拔多糖。

考察不同藥材粉碎度對千斤拔多糖粗品提取量的影響稱千斤拔干燥粉末取過24目、打碎不過篩、飲片的藥材各約5g，精密稱定。按“”項(xiàng)下各精密加入100ml石油醚回流3h起，選用沸水回流，其余步驟依法操作。結(jié)果表明，過24目的粉末所提出的粗多糖最多。

考察不同脫色方法對千斤拔多糖粗品性狀的影響稱取千斤拔莖皮粉末約10g，3份，精密稱定，按照“”項(xiàng)下方法自“精密加入石油醚100ml”起，相同操作至合并濾液。3份濾液，第1份室溫加入3%的雙氧水溶液使濾液雙氧水濃度至%，并用碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9～10；第2份加活性炭加熱回流，濾去活性炭；第3份不脫色，作為空白對照，之后濃縮，再加95%乙醇，使溶液乙醇濃度達(dá)到80%。置冰箱冷藏室內(nèi)放置過夜，過濾，沉淀分別用無水乙醇、丙酮、乙醚脫水后置真空干燥箱內(nèi)干燥，觀察得到的千斤拔多糖粗品的性狀。結(jié)果表明，用雙氧水脫色效果最好。

正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

提取過程的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選用L9正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平通過預(yù)實(shí)驗(yàn)選取安排見表1，正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果見表2。稱取千斤拔藥材約5g，9份，分別各精密加入100ml石油醚，分別回流3h，過濾，棄去濾液，藥渣揮去石油醚，分別精密加入100ml乙醚，分別回流5h，過濾，棄去濾液，藥渣揮去乙醚，分別精密加入95%乙醇100ml，分別回流5h，過濾，棄去濾液，揮干藥渣，濾渣按正交設(shè)計(jì)分別進(jìn)行水提取。提取液定容到500ml，精密量取20ml定容到100ml，再精密量取ml，按“”項(xiàng)下自“各管精密加入%苯酚溶液ml”起，依法操作，測定吸收度。

表1提取工藝因素水平

表2提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行方差分析的結(jié)果見表3。

表3千斤拔多糖提取工藝的方差分析結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，I2A＞I3A＞I1A；I1B＞I3B＞I2B；I3C＞I2C＞I1C，因此A，B，C三因素的最優(yōu)勢水平是A2，B1，C3。A，C兩個因素的P值皆＜，故都為主要因素，而B的P值＞，故為非主要因素。因此，最佳實(shí)驗(yàn)方案為A2B1C3，即提取3次，2h/次，加水量18倍。

為考察上述實(shí)驗(yàn)方案的穩(wěn)定性，按該最佳工藝提取3批產(chǎn)品，分別測定總多糖的得率。計(jì)算得多糖的平均得率為(±)%。3次結(jié)果差異較小，說明該工藝穩(wěn)定可行。

沉淀過程的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選用L9正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平安排見表4,正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果見表5。在按此實(shí)驗(yàn)所得最佳提取方法提取，所得溶液濃縮后加入乙醇并靜置，濾過，揮去溶劑，恒重后精密稱量所得粗多糖。

表4沉淀因素水平

表5L9(3)4沉淀?xiàng)l件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對以上結(jié)果進(jìn)行方差分析的結(jié)果見表6。

正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：I3A＞I2A＞I1A；I1B＞I3B＞I2B；I1C＞I2C＞I3C，因此A、B、C三因素的最優(yōu)勢水平是A3，B1，C1，A、C三因素的P值皆＜，故都為重要因素，B因素的P值＞，為非重要因素。

因此，最佳實(shí)驗(yàn)方案為A3B1C1，即加醇使醇濃度達(dá)到90%，靜置8h，提取液濃縮到10ml。為考察上述實(shí)驗(yàn)方案的穩(wěn)定性，按該最佳工藝提取3批產(chǎn)品，分別測定總多糖的得率。計(jì)算得多糖的平均得率為(±)%。3次結(jié)果差異較小，說明該工藝穩(wěn)定可行。

表6千斤拔多糖方差分析結(jié)果

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)以上實(shí)驗(yàn)得出千斤拔多糖的最佳提取工藝為：石油醚回流3h；濾渣用乙醚回流5h；濾渣用95%乙醇回流5h，濾渣用18倍量提取3次，2h/次，提取液濃縮至10ml，加入乙醇后使溶液中乙醇的濃度約為90%，靜置8h后抽濾，真空干燥即得粗多糖。為考察上述提取工藝的穩(wěn)定性，按該最佳工藝提取3批產(chǎn)品，分別測定總多糖的得率。計(jì)算得多糖的平均得率為(±)%。3次結(jié)果差異較小，說明該工藝穩(wěn)定可行。

4討論

植物多糖提取時用酸浸提法和堿浸提法很容易使部分多糖發(fā)生水解，從而破壞多糖的活性結(jié)構(gòu)，所以千斤拔多糖用水反復(fù)提比較適宜。

由于粗多糖接觸空氣顏色易氧化變深，在過濾過程中分別用石油醚、乙醚、乙醇對粗多糖沉淀依次洗滌，消除了這種變化，而后置真空干燥箱內(nèi)干燥即可得淺棕黃色的粗多糖。

千斤拔中多糖含量較高，但對于其多糖的藥理研究比較少。

本實(shí)驗(yàn)采用正交法優(yōu)化了千斤拔多糖的提取工藝，該工藝具有穩(wěn)定、準(zhǔn)確、操作簡單、生產(chǎn)成本較低的優(yōu)點(diǎn)，為千斤拔的進(jìn)一步開發(fā)打下了良好基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

［1］國家藥典委員會.中國藥典，2005