化學(xué)去細(xì)胞同種異體神經(jīng)制備的改良及橋接周圍神經(jīng)缺損效果

化學(xué)去細(xì)胞同種異體神經(jīng)制備的改良及橋接周圍神經(jīng)缺損效果【摘要】目的：改良去細(xì)胞異體神經(jīng)的制備方法，研制出一種理想的自體神經(jīng)移植替代物.方法：將用Sondell法和改良法［TritonX200，sulfobetaine10,sulfobetaine16］兩種方法制備的去細(xì)胞異體神經(jīng)用HE染色、髓鞘染色、免疫組化染色、掃描電鏡檢查等進(jìn)行組織學(xué)評價.然后將制備的神經(jīng)橋接大鼠坐骨神經(jīng)缺損，從坐骨神經(jīng)指數(shù)、神經(jīng)電生理、運(yùn)動終板染色等方面評價神經(jīng)移植后的再生效果.結(jié)果：改良法制備的神經(jīng)細(xì)胞及髓鞘去除徹底、結(jié)構(gòu)保存完好；移植后神經(jīng)再生良好，優(yōu)于Sondell法制備的神經(jīng)，達(dá)到了與自體神經(jīng)移植相當(dāng)?shù)脑偕Ч?結(jié)論：綜合運(yùn)用萃取劑TritonX200,SB10和SB16的改良化學(xué)萃取方法是一種較為理想的去細(xì)胞異體神經(jīng)制備方法，其制備的異體神經(jīng)移植物可望替代自體神經(jīng)移植.

【關(guān)鍵詞】周圍神經(jīng)化學(xué)萃取去細(xì)胞異體神經(jīng)神經(jīng)再生神經(jīng)缺損

0引言

周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)是臨床上的難題，目前主要采用自體神經(jīng)移植修復(fù)，但此方法有諸多缺點(diǎn)，且常因供體有限，無法滿足較大神經(jīng)缺損或較廣泛神經(jīng)損傷修復(fù)的需要［1］.異體神經(jīng)來源廣泛，但新鮮異體神經(jīng)移植會出現(xiàn)導(dǎo)致移植失敗的免疫排斥反應(yīng).采用化學(xué)萃取方法能較好地降低異體神經(jīng)的免疫反應(yīng)［2-3］，但由于處理方法的不同，有時對神經(jīng)的結(jié)構(gòu)破壞太大［2］.本研究旨在改良去細(xì)胞異體神經(jīng)的制備方法，即綜合應(yīng)用萃取劑TritonX200，sulfobetaine10和sulfobetaine16，并與目前得到認(rèn)可的Sondell化學(xué)制備方法進(jìn)行比較；并將改良制備的異體神經(jīng)橋接周圍神經(jīng)缺損，評價其再生效果，以期研制出一種理想的自體神經(jīng)移植替代物.

1材料和方法

材料健康成年SD大鼠26只，雌雄不拘，體質(zhì)量270～300g，用于去細(xì)胞異體神經(jīng)制備.健康成年Wistar大鼠24只，雌雄不拘,體質(zhì)量300～320g，用于神經(jīng)移植動物實驗.上述動物由解放軍總醫(yī)院動物中心提供.回旋式恒溫振蕩器(上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠)；環(huán)境掃描電鏡；顯微外科器械，手術(shù)顯微鏡，便攜式肌電圖儀；TritonX100，脫氧膽酸鈉，TritonX200，SB10，SB16(美國Sigma公司).

方法

去細(xì)胞異體神經(jīng)制備將SD大鼠26只用100g/L水合氯醛以μL/g腹腔注射麻醉后,切取雙側(cè)全長坐骨神經(jīng)，每根神經(jīng)長約20mm.分3組進(jìn)行處理：Sondell法組、改良法組和對照組.Sondell法處理步驟為：①蒸餾水中振蕩浸浴12h；②30g/LTritonX100溶液中振蕩萃取12h；③40g/L脫氧膽酸鈉溶液中振蕩萃取24h；④重復(fù)上述步驟1次；⑤蒸餾水沖洗30min.改良法處理步驟為：①蒸餾水中振蕩浸浴12h；②125mmol/LSB10溶液中振蕩萃取12h；③g/LTritonX200和mmol/LSB16溶液中振蕩萃取24h；④重復(fù)上述步驟1次；⑤mmol/LPBS沖洗30min.處理后的神經(jīng)于4℃的PBS液中儲存?zhèn)溆?對照組神經(jīng)不作化學(xué)處理.

移植手術(shù)將Wistar大鼠隨機(jī)分成3組，每組8只.Sondell法組用Sondell法制備的異體神經(jīng)移植；改良法組用改良法制備的異體神經(jīng)移植；對照組用自體神經(jīng)移植.造成坐骨神經(jīng)10mm長缺損，手術(shù)顯微鏡下將移植物用80無損傷尼龍線與斷端吻合.對照組將自體神經(jīng)近、遠(yuǎn)端翻轉(zhuǎn)后吻合.

去細(xì)胞異體神經(jīng)質(zhì)量評價光鏡觀察：常規(guī)石蠟包埋,5μm的橫向和縱向組織學(xué)切片.HE染色,觀察去細(xì)胞程度和圍繞神經(jīng)軸突的基底膜管結(jié)構(gòu)的完整性；快藍(lán)(fastblue)染色,觀察髓鞘殘留成分；基底膜素免疫組化染色，觀察基底膜素的保留.電鏡觀察：于20g/LOsO4溶液中固定24h后，二甲胂酸鈉緩沖液沖洗，濾紙蘸干水分，投入液氮中冷凍，取出后迅速切成5mm小段，于冷凍干燥機(jī)中干燥固定，環(huán)境掃描電鏡下觀察基底膜管結(jié)構(gòu)的完整性及去髓鞘程度.綜合質(zhì)量評分：根據(jù)我們制定的評分標(biāo)準(zhǔn)［4］，由病理專業(yè)人員按去細(xì)胞程度、髓鞘染色分級和結(jié)構(gòu)完整性觀察的標(biāo)準(zhǔn)，行雙盲觀察計分，綜合評分，分?jǐn)?shù)越低，表示制備的質(zhì)量越好.

神經(jīng)再生效果觀察術(shù)后即行大體觀察；術(shù)后3mo行坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)測定；SFI測定后將動物在麻醉狀態(tài)下用肌電圖儀行運(yùn)動誘發(fā)電位檢測；繼之將動物大劑量麻醉處死，行運(yùn)動終板病理染色.一般觀察：對實驗動物進(jìn)行肢體功能恢復(fù)以及術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生情況的觀察.坐骨神經(jīng)功能指數(shù)測定：自制木箱，將白紙置于箱底.大鼠雙足醮碳素墨水，經(jīng)過木箱后留下足印.選實驗側(cè)足(E)、正常側(cè)足(N)足印測量3個變量：PL(足印長度)，TS(足趾寬度)，TI(中間足趾距離)，精確到mm.將測量值代入Bain公式計算得出SFI值.用運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢查觀察跨過移植段神經(jīng)的上下兩刺激點(diǎn)在出現(xiàn)運(yùn)動誘發(fā)電位時限上的差別.靶肌肉運(yùn)動終板染色：切取坐骨神經(jīng)支配區(qū)的小腿三頭肌肌腹部位的纖維，用膽堿酯酶法進(jìn)行運(yùn)動終板染色，觀察靶肌肉中運(yùn)動終板的再生情況.

統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以x±s表示.組間對比用成組資料或配對資料的t檢驗，時，有顯著性差異.

2結(jié)果

去細(xì)胞異體神經(jīng)制備組織學(xué)評價HE染色示Sondell法組與改良法組中均見不到任何細(xì)胞，紅染的神經(jīng)內(nèi)膜呈波浪狀縱形排列.Sondell法組于紅染的神經(jīng)內(nèi)膜之間出現(xiàn)了大的空隙；而改良法組排列均勻一致，均未出現(xiàn)大的空隙.快藍(lán)染色示Sondell法組與改良法組中均顯示細(xì)胞完全消失、髓鞘大部分消失.Sondell法組殘留的髓鞘染色較重，改良法組較輕.基底膜素免疫組化染色示Sondell法組與改良法組中均可見到大部分黃染的基底膜素的保留.Sondell法組中保留基底膜素染色較輕，改良法組較重.環(huán)境掃描電鏡(EM)觀察示Sondell法與改良法制備的去細(xì)胞異體神經(jīng)均可見到基底膜保留，管腔擴(kuò)大.Sondell法制備的去細(xì)胞異體神經(jīng)可見到較多的空腔管壁不完整，相互融合連成大的空腔.改良法中小空腔排列規(guī)范，管壁破壞的較少，較少見到融合的大空腔(圖2).綜合質(zhì)量評分：經(jīng)配對資料t檢驗，t1=，P1=＞；t2=，P2=；t3=，P3=＜；t4=，P4=＜其中，t1，t2，t3，t4分別指Sondell法組與改良法組間在去細(xì)胞程度、髓鞘染色分級、結(jié)構(gòu)完整性以及綜合質(zhì)量評分的統(tǒng)計量.

2．2移植后神經(jīng)再生效果評價

大體觀察術(shù)后3wk時,大鼠術(shù)肢出現(xiàn)足部皮膚紅腫或不同程度的潰瘍，約6wk后皮膚紅腫及潰瘍基本消退，各組無明顯差異.SFI測量：術(shù)后3mo，自體神經(jīng)移植組為-±；sondell法組為-±；改良法組為-±，經(jīng)成組資料t檢驗，sondell法與改良法：t1=,P1=＜，有統(tǒng)計學(xué)差異，改良法優(yōu)于sondell法.改良法與自體移植：t2=,P2=＞，無統(tǒng)計學(xué)差異，改良法與自體效果相似.Sondell法與自體移植：t3=,P3=＜，有統(tǒng)計學(xué)差異，sondell法差于自體移植.A:Sondell法組，去細(xì)胞完全，神經(jīng)結(jié)構(gòu)破壞較重;B:改良法組，去細(xì)胞完全，神經(jīng)結(jié)構(gòu)破壞較輕.

肌電圖檢測術(shù)后3mo時,sondell法組的運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度為±，改良法組為±，自體移植組為±經(jīng)成組資料t檢驗，sondell法與改良法：t1=,P1=＜，有統(tǒng)計學(xué)差異，改良法優(yōu)于sondell法.改良法與自體移植：t2=,P2=＜，有統(tǒng)計學(xué)差異，改良法差于自體移植.

運(yùn)動終板染色各組運(yùn)動終板與正常相比均較小，染成淺棕色，未能恢復(fù)至正常形態(tài).高倍鏡下運(yùn)動終板計數(shù)，sondell法組為14±3，改良法組為19±3，自體移植組為22±4.經(jīng)成組資料t檢驗，sondell法與改良法：t1=,P1=＜，有統(tǒng)計學(xué)差異，改良法優(yōu)于sondell法.改良法與自體移植：t2=,P2=＞，無統(tǒng)計學(xué)差異，改良法與自體效果相似.Sondell法與自體移植：t3=,P3=＜，有統(tǒng)計學(xué)差異，sondell法差于自體移植.

3討論

神經(jīng)同種異體移植的抗原性主要存在于施旺細(xì)胞和髓鞘.為降低同種異體神經(jīng)的抗原性，人們嘗試采用了多種方法對同種異體神經(jīng)移植進(jìn)行預(yù)處理，如低溫保存、凍融、冷凍干燥、冷凍放射和化學(xué)萃取等［5］.凍融法雖然能殺死細(xì)胞，去除免疫原性，但不能清除細(xì)胞碎片，且常常引起基底膜碎裂.放射法雖不會引起組織形態(tài)的破壞，同時也能殺死細(xì)胞，去除免疫原性，但同凍融法一樣不能清除細(xì)胞碎片.化學(xué)萃取法能殺死細(xì)胞，降低免疫反應(yīng)，同時清除大部分細(xì)胞碎片，但如果萃取劑的選擇不當(dāng)，不但影響免疫原物質(zhì)的去除，且易引起神經(jīng)形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞［6］.目前得到認(rèn)可的化學(xué)萃取方法有Sondell方案，但此法仍有許多不盡意之處，由于其在一定程度上破壞了神經(jīng)基底膜管及細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，故影響了軸突的再生［7］.而基底膜管及細(xì)胞外基質(zhì)在軸突再生的過程中起重要作用［8］.

我們的實驗結(jié)果表明，在去細(xì)胞神經(jīng)制備組織學(xué)評價方面，HE染色示兩種方法的去細(xì)胞效果均較好，但改良法對神經(jīng)結(jié)構(gòu)的破壞較小；快藍(lán)染色表明，改良法對髓鞘的去除較為徹底；基底膜素免疫組化染色表明，改良法對基底膜素的保留略好于Sondell法；環(huán)境掃描電鏡表明，改良法對神經(jīng)結(jié)構(gòu)的保存略好于Sondell法；綜合質(zhì)量評分結(jié)果表明，兩種方法在去細(xì)胞效果方面相當(dāng)，但在髓鞘去除及神經(jīng)結(jié)構(gòu)的保存方面改良法優(yōu)于Sondell法，綜合去細(xì)胞程度、髓鞘染色分級、結(jié)構(gòu)完整性三方面質(zhì)量評分，改良法優(yōu)于Sondell法.在神經(jīng)移植后再生效果評價方面，SFI測量表明改良法優(yōu)于sondell法，達(dá)到了與自體神經(jīng)移植相當(dāng)?shù)男Ч?肌電圖檢測表明，改良法制備的神經(jīng)移植運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度快于Sondell，但較自體神經(jīng)移植慢.運(yùn)動終板染色結(jié)果表明，改良法制備的神經(jīng)移植再生的運(yùn)動終板多于Sondell法，達(dá)到了與自體神經(jīng)移植相當(dāng)?shù)男Ч催_(dá)到正常運(yùn)動終板形態(tài).

綜上所述，在去細(xì)胞神經(jīng)制備組織學(xué)評價方面及體內(nèi)動物實驗神經(jīng)移植后再生效果評價方面，改良法均優(yōu)于目前得到認(rèn)可的Sondell法制備方法.因此，綜合運(yùn)用萃取劑TritonX200,SB10和SB16的改良化學(xué)萃取方法，是一種較為理想的去細(xì)胞異體神經(jīng)制備方法，其制備的異體神經(jīng)移植物可望替代自體神經(jīng)移植.

【參考文獻(xiàn)】

［1］RovakJM,BishopDK,BoxerLK,etal.Peripheralnervetransplantation:Theroleofchemicalacellularizationineliminatingallograftantigenicity［J］.JReconstrMicrosurg,2005,21(3):207-213.

［2］孫明學(xué)，唐金樹，王鑫，等.去細(xì)胞處理對化學(xué)去細(xì)胞異體神經(jīng)免疫原性的影響［J］.中華外科雜志,2006,44(4):275-278.

［3］衷鴻賓，盧巨璧，侯樹勛，等.人類去細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植物化學(xué)萃取方法的研究［J］.中華外科雜志,2003,41(1):60-63.

［4］SunMX,LuSB,TangJS.Experimentalstudyonrepairingdifferentlengthnervedefectswithchemicalextractedacellularnerveallograft［J］.ChinJOrthop,2006,14:603-607.

［5］SunMX,TangJS,XuWJ.Experimentalstudyonchemicalextractedacellularnerveallograft［J］.ChinJOrthop,2006,26(4):267-271.

［6］HudsonTW,LiuSY,SchmidtCE.Engineeringanimprovedacellularnervegraftviaoptimizedchemicalprocessing［J］.TissueEng,2004，10(910):1346-1358.

［7］HudsonTW,ZawkoS,DeisterC,etal.Optimizedacellularnervegraftisimmunologicallytoleratedandsupport