臨床醫(yī)學(xué)無(wú)菌檢查法

2無(wú)菌檢查法（2010版）無(wú)菌檢查法系用于檢查要求無(wú)菌的藥品、生物制品、醫(yī)藥器具、原料、輔料、及其他品種是否無(wú)菌的一種方法。若供試品符合無(wú)菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。無(wú)菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行，其全過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法》的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度確認(rèn)。隔離系統(tǒng)應(yīng)定期按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無(wú)菌檢查的要求。日常檢驗(yàn)還需對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。無(wú)菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識(shí)，并經(jīng)過(guò)無(wú)菌技術(shù)的培訓(xùn)。

2無(wú)菌檢查法（2010版）所用到的培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)基的適用性檢查：無(wú)菌檢查用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基應(yīng)符合無(wú)菌性檢查和培養(yǎng)基靈敏度檢查要求。本檢查可在供試品無(wú)菌檢查前或與供試品無(wú)菌檢查同時(shí)進(jìn)行。培養(yǎng)基無(wú)菌性檢查：每批培養(yǎng)基隨機(jī)抽取不少于10支（瓶），5支（瓶)置30～35℃，另5支（瓶）置20～25℃培養(yǎng)14天，均應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。靈敏度檢查：菌種：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉。2無(wú)菌檢查法（2010版）菌液制備接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，20～25℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，上述培養(yǎng)物用0.9%氯化鈉溶液制成含菌數(shù)小于100CFU/mL的菌懸液；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏瓊脂培養(yǎng)基上，23～28℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5mL無(wú)菌的含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用滅菌的紗布將孢子懸液濾至無(wú)菌試管內(nèi)，用無(wú)菌的0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液制成含孢子數(shù)小于100CFU/mL的孢子懸液。2無(wú)菌檢查法（2010版）菌液稀釋梯度的確定用于靈敏度測(cè)定的菌液用相應(yīng)的培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)，采用10倍梯度稀釋法（1mL+9mL=10-1），每個(gè)擴(kuò)增好的菌液稀釋到10-7，用于計(jì)數(shù)的梯度為10-4～10-7，每個(gè)梯度用三個(gè)平行的培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值作為菌落數(shù)。金黃色葡萄球菌、枯燥芽孢桿菌、銅綠假單胞菌用TSA平皿進(jìn)行計(jì)數(shù)培養(yǎng)，30～35℃培養(yǎng)2天，生孢梭菌用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)培養(yǎng)，30～35℃培養(yǎng)2天，白色念珠菌、黑曲霉用TSA平皿進(jìn)行計(jì)數(shù)培養(yǎng)20～25℃培養(yǎng)3天。菌落數(shù)小于100CFU的梯度下的菌液即為實(shí)驗(yàn)所需的菌懸液。培養(yǎng)基接種取每管裝量為12mL的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另一支不接種，作為空白對(duì)照，置30～35℃培養(yǎng)3天；取每管裝量為9mL的改良馬丁培養(yǎng)基5支，分別接種小于100CFU的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另一支不接種，作為空白對(duì)照，置20～25℃培養(yǎng)5天。逐日觀察結(jié)果。同時(shí)對(duì)相應(yīng)梯度下的菌懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)復(fù)核，每種菌做三個(gè)平行，以確保培養(yǎng)基接種的是小于100CFU的菌液。

2無(wú)菌檢查法（2010版）結(jié)果判定：空白對(duì)照管應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，若加菌的培養(yǎng)基管均生長(zhǎng)良好，判該培養(yǎng)基靈敏度檢查符合規(guī)定。供試品的無(wú)菌檢查抽驗(yàn)數(shù)量：系指一次實(shí)驗(yàn)所用最小包裝容器的數(shù)量（支或瓶）。成品每亞批均應(yīng)進(jìn)行無(wú)菌檢查。抽檢量按下表：供試品批產(chǎn)量（N）最少抽檢數(shù)量注射劑N≤1005個(gè)100<N≤50010個(gè)N>50020個(gè)2無(wú)菌檢查法（2010版）接種量：系指每個(gè)最小包裝的最小取樣量（mL或g），接種供試品量按下表進(jìn)行。規(guī)格每支（瓶）供試品的最小接種量液體制劑（mL）V≤1全量1<V≤5半量5<V<202mL20≤V<5010mLV≥50半量原液或半成品半量固體制劑M<50mg全量50mg≤M<300mg半量300mg≤M<5g150mgM≥5g半量2無(wú)菌檢查法（2010版）無(wú)菌檢查方法有直接接種法和薄膜過(guò)濾法，只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法。若采用薄膜過(guò)濾法，接種過(guò)程應(yīng)采用三聯(lián)薄膜過(guò)濾器，其中兩聯(lián)加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，另一聯(lián)加入改良馬丁培養(yǎng)基，只要供試品允許，應(yīng)將所用容器內(nèi)的內(nèi)容物全部過(guò)濾。陽(yáng)性對(duì)照：以金光色葡萄球菌作為陽(yáng)性對(duì)照菌。供試品用量同供試品無(wú)菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的菌懸液制備同培養(yǎng)基靈敏度檢查項(xiàng)下的金黃色葡萄球菌菌液制備方法，加菌量小于100CFU。陽(yáng)性對(duì)照也可在供試品無(wú)菌檢查培養(yǎng)14天后，取其中1份硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，加入小于100CFU的陽(yáng)性對(duì)照菌，作為陽(yáng)性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照置30～35℃培養(yǎng)48～72小時(shí)應(yīng)生長(zhǎng)良好。陰性對(duì)照：供試品無(wú)菌檢查時(shí)，應(yīng)取相應(yīng)溶劑、稀釋液和沖洗液同法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。操作時(shí)，用適宜的消毒液對(duì)供試品容器表面進(jìn)行徹底消毒。如果供試品容器內(nèi)有一定的真空度，可用適宜的無(wú)菌器材（如帶有除菌過(guò)濾器的針頭）向容器內(nèi)導(dǎo)入無(wú)菌空氣，再按無(wú)菌操作啟開(kāi)容器，取出內(nèi)容物。2無(wú)菌檢查法（2010版）供試品接種及培養(yǎng)基接種薄膜過(guò)濾法采用封閉式薄膜過(guò)濾器，濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm，直徑約為50mm，根據(jù)供試品及其容劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。使用時(shí)應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。水溶性供試品溶液過(guò)濾前先將少量的沖洗液潤(rùn)濕濾膜，油類供試品，其濾膜和過(guò)濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過(guò)濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液和沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試品溶液經(jīng)薄膜過(guò)濾后，若需要用沖洗液沖洗，每張濾膜每次沖洗量一般為100mL，總沖洗量不得超過(guò)1000mL，以避免濾膜上的微生物受損傷。水溶液供試品：取規(guī)定量，每支（瓶）供試品裝量為5mL及以下者，全部轉(zhuǎn)移至含適量稀釋液的無(wú)菌容器內(nèi)，混勻，立即過(guò)濾。水溶液固體供試品：取規(guī)定量，加適宜的稀釋液溶解或按標(biāo)簽說(shuō)明復(fù)溶，然后按水溶液供試品項(xiàng)下的方法操作。2無(wú)菌檢查法（2010版）培養(yǎng)及觀察將上述接種后的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基平均分成兩份，一份置30～35℃培養(yǎng)14天；另一份與接種后的改良馬丁培養(yǎng)基置20～25℃培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長(zhǎng)。如在加入供試品后或在培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷是否有菌生長(zhǎng)，可取該培養(yǎng)基適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中及營(yíng)養(yǎng)瓊脂和改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌培養(yǎng)2天，真菌培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基及營(yíng)養(yǎng)瓊脂和改良馬丁瓊脂斜面上是否有菌生長(zhǎng)；或取培養(yǎng)液（物）涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌，必要時(shí)做菌種鑒定。結(jié)果判定：陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。否則，實(shí)驗(yàn)無(wú)效。若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確認(rèn)無(wú)菌生長(zhǎng)，則判供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確認(rèn)有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，即生長(zhǎng)的菌非供試品所含。試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無(wú)效，應(yīng)重試。重試時(shí)，重新取同量供試品，依法檢查，若無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定，若有菌生長(zhǎng)，則判供試品不符合規(guī)定。22015版與2010版藥典無(wú)菌檢查法對(duì)比改變項(xiàng)目2015版2010版無(wú)菌檢查環(huán)境環(huán)境潔凈度B級(jí)背景下的局部A級(jí)潔凈度環(huán)境潔凈度10000下的局部潔凈度100級(jí)培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（FT）和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)基無(wú)菌性檢查每批取不少于5支（瓶）每批取10支（瓶）22015版與2010版藥典無(wú)菌檢查法對(duì)比改變項(xiàng)目2015版2010版培養(yǎng)基靈敏度檢查菌液制備：金葡、枯草、銅綠接TSB擴(kuò)增，白念接沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，黑曲霉用沙氏葡萄糖瓊脂斜面金葡、枯草、銅綠接NB，白念接改良馬丁培養(yǎng)基、黑曲霉接改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基接種：FT接種金葡、銅綠、生孢；TSB接種枯草、白念、黑曲霉FT接種金葡、銅綠、