分子克隆及蛋白表達(dá)常見(jiàn)問(wèn)題和對(duì)策

分子克隆及蛋白表達(dá)常見(jiàn)問(wèn)題和對(duì)策一、重要意義與應(yīng)用（一）重要意義分子克隆技術(shù)起步于上世紀(jì)70年代

1、開(kāi)辟了分子生物學(xué)研究的新領(lǐng)域；2、打開(kāi)了人類(lèi)了解、識(shí)別、分離和改造基

因，創(chuàng)造新物種的大門(mén)；3、對(duì)工業(yè)、農(nóng)牧和醫(yī)藥業(yè)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響；4、將為解決世界面臨的能源、食品和環(huán)保

三大危機(jī)開(kāi)拓新的出路。一、重要意義與應(yīng)用分子克隆技術(shù)基因工程細(xì)胞工程酶工程發(fā)酵工程緊密聯(lián)系、綜合利用（二）在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用一、重要意義與應(yīng)用

利用分子克隆技術(shù)生產(chǎn)的化學(xué)試劑：

丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、環(huán)氧乙烷、烏頭酸和水楊酸等。

污水處理：

利用基因操作，將某種微生物的基因轉(zhuǎn)入另一微生物，創(chuàng)造對(duì)有害物質(zhì)降解能力更強(qiáng)的新菌種，以分解污水中的有毒物質(zhì)。食品工業(yè)：

利用細(xì)菌可生產(chǎn)蛋白質(zhì)、氨基酸和糖等。一、重要意義與應(yīng)用

（三）在制藥工業(yè)中應(yīng)用利用分子克隆和發(fā)酵技術(shù)已工業(yè)化生產(chǎn)重組蛋白藥物及相關(guān)產(chǎn)品：胰島素、人牛雞的生長(zhǎng)激素、人干擾素、松弛素、促紅細(xì)胞生長(zhǎng)激素、乙肝病毒抗原和口蹄疫病毒抗原等。利用分子克隆技術(shù)還可提高微生物本身所產(chǎn)生的蛋白和抗生素類(lèi)藥物的產(chǎn)量。一、重要意義與應(yīng)用

（四）在基因治療中的應(yīng)用

通過(guò)基因水平的操縱而治療或預(yù)防疾病。

基因置換、基因修正、基因修飾、基因失活

1990年，NIH進(jìn)行了世界上首例基因治療臨床試驗(yàn)

修復(fù)了一個(gè)復(fù)合免疫缺陷綜合征女孩腺苷脫氨酶的活性，使其免疫系統(tǒng)得到了恢復(fù)。

2012年，首個(gè)基因治療產(chǎn)品獲批上市

歐洲藥品管理局批準(zhǔn)荷蘭生物技術(shù)公司UniQure以重組腺相關(guān)病毒(AAV)為載體的基因治療藥物Glybera上市，用于脂蛋白脂酶缺乏癥(LPLD)患者的治療。一、重要意義與應(yīng)用

（五）在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用許多外源基因?qū)胫参锏难芯揩@得成功。培育新品種

、作物品質(zhì)改良、促進(jìn)作物增產(chǎn)、防除雜草、防治病蟲(chóng)害、抗病菌

等。影響植物基因工程在農(nóng)業(yè)中應(yīng)用的因素：1、對(duì)人體的安全性問(wèn)題

2、轉(zhuǎn)基因DNA在作物生長(zhǎng)中轉(zhuǎn)移或漂移至其他作物，從而引發(fā)環(huán)境及生態(tài)問(wèn)題3、轉(zhuǎn)基因作物在農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中的問(wèn)題一、重要意義與應(yīng)用

（六）在基因功能研究中的應(yīng)用

1982年，《MolecularCloning:ALaboratoryManual》由ColdSpringHarborLaboratoryPress出版，這部著作在20年中成為指導(dǎo)生命科學(xué)研究的一部“圣經(jīng)”。

分子生物學(xué)技術(shù)目前已經(jīng)是幾乎所有主流實(shí)驗(yàn)室的必備技術(shù)，其中基因克隆技術(shù)作為基礎(chǔ)和首要技術(shù)，是大部分科研同行接觸到的第一種分子生物學(xué)技術(shù)。

一、重要意義與應(yīng)用

基因過(guò)表達(dá)、RNAi、基因敲除、基因的定點(diǎn)突變、CRISPR/Cas9等技術(shù)已在生命科學(xué)研究中廣泛應(yīng)用，沒(méi)有掌握分子克隆技術(shù)科研將寸步難行。二、基因克?。ㄒ唬┓肿涌寺〖夹g(shù)的誕生

1972年11月，在檀香山有關(guān)質(zhì)粒的會(huì)議上首次出現(xiàn)基因克隆技術(shù)的想法。

StanleyCohen

（1986年諾獎(jiǎng)獲得者），對(duì)HerbertW.Boyer

關(guān)于細(xì)菌酶切割DNA分子特定部分的介紹很感興趣。在威基基的一間熟食店里，兩位科學(xué)家相遇，構(gòu)思出了一個(gè)開(kāi)創(chuàng)現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的實(shí)驗(yàn)。

1973年初，他們推出了一系列實(shí)驗(yàn)，以選擇特定的外源基因在細(xì)菌中復(fù)制。二、基因克隆

（二）什么是基因

基因是細(xì)胞內(nèi)DNA分子上具有遺傳效應(yīng)的特定核苷酸序列的總稱(chēng)，是具有遺傳效應(yīng)的DNA分子片段。

基因控制蛋白質(zhì)合成，是不同物種以及同一物種的不同個(gè)體表現(xiàn)出不同的性狀的根本原因。

"種瓜得瓜，種豆得豆"，"一母生九子，九子各不同"。

基因通過(guò)DNA復(fù)制及細(xì)胞分裂把遺傳信息傳遞給下一代，并通過(guò)控制蛋白質(zhì)的合成使遺傳信息得到表達(dá)。二、基因克隆

（三）基因克隆的概念基因克隆是70年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)具有革命性的生物技術(shù)，最終目的在于通過(guò)相應(yīng)技術(shù)手段，將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞，在宿主細(xì)胞內(nèi)目的基因被大量的復(fù)制。該技術(shù)可概括為∶分、切、連、轉(zhuǎn)、選。二、基因克隆切：用序列特異的限制性?xún)?nèi)切酶切開(kāi)載體DNA，即切出目的基因；連：用DNA連接酶將目的DNA同載體DNA相連接，形成重組DNA分子；轉(zhuǎn)：將重組DNA分子送入宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增；

選：從宿主群體中挑選出攜帶有重組DNA分子的個(gè)體。二、基因克隆基因工程技術(shù)的兩個(gè)最基本的特點(diǎn)：1、分子水平上的操作2、細(xì)胞水平上的表達(dá)

分子水平上的操作即是體外重組的過(guò)程，是利用工具酶對(duì)DNA分子進(jìn)行“外科手術(shù)"?；蚩寺〖夹g(shù)又稱(chēng)為分子克隆、基因的無(wú)性繁殖、基因操作、重組DNA技術(shù)以及基因工程等。二、基因克?。ㄈ┳畛醯幕蚩寺?shí)驗(yàn)1972年，斯坦福大學(xué)的P.Berg等人將一種猿猴病毒的DNA與λ噬菌體DNA用同一種限制性?xún)?nèi)切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子相連接，產(chǎn)生了一種新的重組DNA分子，奠定了基因克隆技術(shù)的基礎(chǔ)。1973年，S.Cohen等人把一段外源DNA片段與質(zhì)粒DNA連接起來(lái)，構(gòu)成了一個(gè)重組質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，第一次完整地建立了基因克隆體系。二、基因克?。ㄋ模┗蚩寺〉幕具^(guò)程基因克隆涉及一系列的分子生物學(xué)技術(shù)，如目的DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的選用、體外重組、導(dǎo)入宿主細(xì)胞技術(shù)和重組子篩選技術(shù)等等。三、克隆過(guò)程概述

（一）目的DNA片段的獲得

基因克隆的第一步是獲得包含目的基因在內(nèi)的一群DNA分子。

DNA分子的來(lái)源：1、目的生物基因組；2、目的細(xì)胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的雙鏈cDNA分子。三、克隆過(guò)程概述

基因組DNA較大，不利于克隆，需將其處理成適合克隆的DNA小片段。常用的方法：機(jī)械切割和核酸限制性?xún)?nèi)切酶消化若基因序列已知且較小可直接合成。若基因的兩端部分序列已知，根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物，從基因組DNA或cDNA中通過(guò)PCR技術(shù)可以獲得目的基因。三、克隆過(guò)程概述（二）載體的選擇基因工程的載體的性質(zhì)：1、在宿主細(xì)胞中有獨(dú)立復(fù)制和表達(dá)的能力，能使外源重組的DNA片段得以擴(kuò)增；2、分子量盡可能小，在宿主細(xì)胞中有較多的拷貝，便于結(jié)合更大的外源DNA片段，并在實(shí)驗(yàn)操作中不易被機(jī)械剪切破壞；3）最好具有兩個(gè)以上的容易檢測(cè)的遺傳標(biāo)記（如抗藥性標(biāo)記基因），以賦予宿主細(xì)胞不同的表型（如對(duì)抗生素的抗性）。三、克隆過(guò)程概述4、具有盡可能多的限制酶單一切點(diǎn)，為避免外源DNA片段中限制酶位點(diǎn)的干擾提供更大的選擇范圍。

若載體上的單一酶切位點(diǎn)是位于檢測(cè)表型的標(biāo)記基因之內(nèi)可造成插入效應(yīng)，則更有利于重組子的篩選。

三、克隆過(guò)程概述DNA克隆常用的載體：質(zhì)粒載體（plasmid），噬菌體載體（phage），科斯質(zhì)粒載體（cosimid），單鏈DNA噬菌體載體（ssDNAphage），噬粒載體（phagemid）、酵母人工染色體（YAC）等。

根據(jù)載體的使用目的，載體可以分為克隆載體，表達(dá)載體，測(cè)序載體，穿梭載體等。三、克隆過(guò)程概述（三）體外重組

將目的片斷和載體分子連接的過(guò)程。大多數(shù)核酸限制性?xún)?nèi)切酶能夠切割DNA分子形成有黏性末端，用同一種酶或同尾酶切割適當(dāng)載體的多克隆位點(diǎn)便可獲得相同的黏性末端，通過(guò)T4DNA連接酶的作用便可形成重組體，此為黏末端連接。

當(dāng)目的DNA片斷為平端，可以直接與帶有平端載體相連，此為平末端連接，連接效率差些。三、克隆過(guò)程概述有時(shí)為了不同的克隆目的，如將平端DNA分子插入到帶有黏末端的表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)表達(dá)時(shí)，則要將平端DNA分子通過(guò)一些修飾，如同聚物加尾，加銜接物或人工接頭，PCR法引入酶切位點(diǎn)等，可以獲得相應(yīng)的黏末端，然后進(jìn)行連接，此為修飾黏末端連接。三、克隆過(guò)程概述（四）導(dǎo)入受體細(xì)胞

載體DNA分子上具有能被原核宿主細(xì)胞識(shí)別的復(fù)制起始位點(diǎn)，因此可以在原核細(xì)胞如大腸桿菌中復(fù)制，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴(kuò)增，最終獲得大量同一的重組DNA分子。三、克隆過(guò)程概述將外源重組DNA分子導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞的方法有轉(zhuǎn)化（transformation），轉(zhuǎn)染（transfection），轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。重組質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)化技術(shù)可以導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，同樣重組噬菌體DNA可以通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入。轉(zhuǎn)染效率不高，因此將重組噬菌體DNA或柯斯質(zhì)粒體外包裝成有浸染性的噬菌體顆粒，借助這些噬菌體顆粒將重組DNA分子導(dǎo)入到宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，該轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)的導(dǎo)入效率要比轉(zhuǎn)染的導(dǎo)入效率高。三、克隆過(guò)程概述（四）重組子的篩選從不同的重組DNA分子獲得的轉(zhuǎn)化子中鑒定出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子即陽(yáng)性克隆的過(guò)程就是篩選。發(fā)展起來(lái)的成熟篩選方法如下：

1、插入失活法

外源DNA片段插入到位于篩選標(biāo)記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位點(diǎn)后，會(huì)造成標(biāo)記基因失活，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化子相應(yīng)的抗生素抗性消失或轉(zhuǎn)化子顏色改變，通過(guò)這些可以初步鑒定出轉(zhuǎn)化子是重組子或非重組子。常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍(lán)白篩選法（白色菌落是重組質(zhì)粒）。三、克隆過(guò)程概述

2、PCR篩選和限制酶酶切法提取轉(zhuǎn)化子中的重組DNA分子作模板，根據(jù)目的基因已知的兩端序列設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)PCR技術(shù)篩選陽(yáng)性克隆。PCR法篩選出的陽(yáng)性克隆，用限制性?xún)?nèi)切酶酶切法進(jìn)一步鑒定插入片段的大小。注意：

菌落PCR技術(shù)篩選陽(yáng)性克隆時(shí)，如果克隆的基因本身來(lái)源于宿主的話(huà)，不能采用該技術(shù)三、克隆過(guò)程概述

3、核酸分子雜交法

制備目的基因特異的核酸探針，通過(guò)核酸分子雜交法從眾多的轉(zhuǎn)化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達(dá)蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。注意：

該方法篩選陽(yáng)性克隆時(shí)，如果克隆的基因本身來(lái)源于宿主的話(huà)，不能采用該技術(shù)三、克隆過(guò)程概述

4、免疫學(xué)篩選法

獲得目的基因表達(dá)的蛋白抗體，就可以采用免疫學(xué)篩選法獲得目的基因克隆。注意：上述方法獲得的陽(yáng)性克隆最后要進(jìn)行測(cè)序分析，以最終確認(rèn)目的基因。四、克隆的要素（一）質(zhì)粒四、克隆的質(zhì)粒要素（一）特點(diǎn)：環(huán)狀DNA分子能夠自我復(fù)制,或整合到染色體上,隨染色體復(fù)制.(最重要一點(diǎn),可自我復(fù)制)；有多個(gè)限制酶切點(diǎn)(便于切割)；

有標(biāo)記基因(便于進(jìn)行檢驗(yàn)和篩選)；

有可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(便于基因的誘導(dǎo)表達(dá))。

四、克隆的質(zhì)粒要素質(zhì)粒類(lèi)型：類(lèi)型有天然質(zhì)粒；人工構(gòu)建質(zhì)粒。按基因工程構(gòu)建方式可分為:插入失活型質(zhì)粒；表達(dá)型質(zhì)粒；按拷貝數(shù)可分為:高拷貝；低拷貝數(shù)質(zhì)粒四、克隆的其它要素

（二）PCR引物的設(shè)計(jì)用軟件來(lái)設(shè)計(jì)，既要考慮發(fā)夾結(jié)構(gòu)，又要考慮二聚體，還要考慮Tm值，顯得特別復(fù)雜。

首先保證你要的基因是正確的，這個(gè)可以從NCBI中找到，大部分是沒(méi)問(wèn)題；

然后再找到起始密碼子，從那開(kāi)始大概上游取20-27bp，加上酶切位點(diǎn)，加上保護(hù)堿基（一般3個(gè)）就是上游引物，取后20-27bp堿基，反向互補(bǔ)，加上酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基組成下游引物。這樣引物設(shè)計(jì)就完成了，再放到軟件里看看GC含量，Tm值，發(fā)夾結(jié)構(gòu)，二聚體等，適當(dāng)調(diào)整堿基個(gè)數(shù)和保護(hù)堿基的個(gè)數(shù)。需要額外注意的是移碼問(wèn)題。

四、克隆的其它要素設(shè)計(jì)引物時(shí)一定要考慮切點(diǎn)的甲基化問(wèn)題。涉及到dam甲基化和dcm甲基化。常用的大腸桿菌都有這兩種甲基化酶。dam甲基化酶識(shí)別GATC位點(diǎn)并甲基化；dcm甲基化酶識(shí)別CCWGG位點(diǎn)（W是A或T）并甲基化。有這兩種位點(diǎn)那么多數(shù)情況內(nèi)切酶是切不開(kāi)了。

容易受甲基化影響的內(nèi)切酶有：Dpn1（GA/TC）天生就甲基化；Cla1（ATC/GAT）如果前面加個(gè)G或后面加個(gè)C就會(huì)發(fā)生dam甲基化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加個(gè)GA或后面加個(gè)TC也是dam甲基化，等等有好多。設(shè)計(jì)引物時(shí)一定要注意，避免引入甲基化位點(diǎn)。如果真是避免不了或者后來(lái)才發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，那么把甲基化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到甲基化酶缺陷型大腸桿菌中再提質(zhì)粒就沒(méi)有甲基化，可以進(jìn)行酶切。甲基化缺陷型菌有：DM1（Invitrogen）、INV110（invitrogen）、JM110等。

四、克隆的要素

（三）酶切兩種方式：一種純化后直接酶切連接；一種連T載體再往下切連接。新手建議第二種方法，連T載體。因?yàn)镻CR產(chǎn)物直接酶切有兩個(gè)缺點(diǎn)：①由于兩頭把手太短，雖說(shuō)有保護(hù)堿基，但容易切不好；②無(wú)法從電泳上看出切的情況，因?yàn)榍邢铝藥讉€(gè)或十幾個(gè)bp，無(wú)法驗(yàn)證。

連T載體的優(yōu)點(diǎn)：①進(jìn)載體后，大提一次的質(zhì)粒足夠進(jìn)行下面的克隆了，不再需要總PCR調(diào)基因，PCR帶來(lái)的突變頻率高。②酶切會(huì)很清晰，切下來(lái)了就是有帶，沒(méi)切動(dòng)就是沒(méi)有。連T載體也有些麻煩的地方，如需要的切點(diǎn)有時(shí)跟T載體上自帶的切點(diǎn)沖突，這就要鑒別；而且連T載體最好測(cè)序看一下PCR的產(chǎn)物對(duì)不對(duì)、切點(diǎn)對(duì)不對(duì)。

四、克隆的其它要素有時(shí)手工小提或粗提的質(zhì)粒酶切效果不好，這可能是提取的不夠純或者內(nèi)切酶品質(zhì)不好。建議用柱子精提或大提。

四、克隆的其它要素

酶切需注意如下幾點(diǎn)：

①如果是雙酶切A和B，預(yù)實(shí)驗(yàn)中必須做A和B各自的單酶切和A+B的雙酶切,好確認(rèn)這幾種酶都好用，質(zhì)粒上的切點(diǎn)都好用。如果切不開(kāi)就要考慮是不是酶的問(wèn)題，buffer的問(wèn)題，質(zhì)粒上有沒(méi)有這些切點(diǎn)，序列是否甲基化等。

②酶切盡量用大體系，如50ul、100ul等。大體系能稀釋內(nèi)切酶包裝中的甘油，對(duì)反應(yīng)有利。相反，連接盡量用小體系，以增加DNA末端的碰撞機(jī)會(huì)。

四、克隆的其它要素

③酶切時(shí)用酶量不用太大。大了會(huì)切碎，形成一些不規(guī)則的末端，不利于下一步連接。

④酶切后的電泳，如果切成的條帶很清晰，不拖泥帶水，沒(méi)有彌散，沒(méi)有拖尾，那做回收、連接效果最好。相反，若有彌散、拖尾、不清楚、一團(tuán)亮等情況就是切的不好，做后續(xù)實(shí)驗(yàn)成功率會(huì)降低。若真是效果很差建議改進(jìn)體系重新切。

四、克隆的其它要素

（四）DNA回收回收DNA可以用試劑盒或手工法。柱式回收試劑盒：此類(lèi)試劑盒適合各種長(zhǎng)度DNA，對(duì)黏性末端基本沒(méi)有破壞，回收效率高。手工醇沉法步驟如下，把切得的膠弄碎，用Tris-HCl浸泡一段時(shí)間，吸出所有的液體，用酚抽提一遍，氯仿抽提一遍，加鹽和醇醇沉，沉淀用70％乙醇漂洗，再用Tris溶解。此方法優(yōu)點(diǎn)是對(duì)DNA和黏性末端的損傷最小，缺點(diǎn)是容易損失DNA。四、克隆的其它要素

回收后要電泳，一來(lái)估算回收液濃度，二來(lái)看回收DNA的質(zhì)量。若條帶有彌散，即自目的條帶以下有拖痕，不是清晰利落的一條帶，則質(zhì)量不好。質(zhì)量不好的回收產(chǎn)物做連接成功率會(huì)降低，假陽(yáng)性克隆會(huì)增加。造成回收質(zhì)量差的原因可能是回收這步，也可能是酶切出現(xiàn)問(wèn)題。只有回收到清晰、利索的條帶，才不影響連接。

四、克隆的其它要素

（五）感受態(tài)

感受態(tài)的效率要高。感受態(tài)的感受效率一般剛制備完時(shí)是最高的，以后逐漸減弱，要求取感受態(tài)時(shí)動(dòng)作迅速、最大程度減少感受態(tài)盒升溫。如果你們的感受態(tài)已經(jīng)儲(chǔ)存了很長(zhǎng)時(shí)間或者連接長(zhǎng)的克隆連續(xù)幾把都太少就要重做感受態(tài)了。制備感受態(tài)最好由經(jīng)驗(yàn)豐富者做或他帶你做。制備高感受態(tài)細(xì)菌的方法：采用低溫培養(yǎng)（16-18℃），進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)收菌，制備高感受態(tài)細(xì)菌（長(zhǎng)片段克隆需要）。

四、克隆的其它要素

（六）連接連接的問(wèn)題討論的是比較多的。如果前述若干步驟所得產(chǎn)物質(zhì)量好，連接不會(huì)很難。

①DNA的量：DNA總量有幾十ng就能連接成。當(dāng)然如果你的DNA質(zhì)量好，DNA用量越大連接效率越高。就怕你為了追求DNA數(shù)量而降低了質(zhì)量，那可就得不償失了。

②vector和insert的比例：如果insert不長(zhǎng)（2kb以下）、vector是insert的幾倍長(zhǎng)，可以用1：3－1：6。如果insert較長(zhǎng)（3、4kb以上）、vector和insert長(zhǎng)度相似或insert比vector還長(zhǎng)，可以用1：1－1：3。短片段的連接相對(duì)容易，做的好可以挑到好多正確的克隆。長(zhǎng)片段的連接效率較低，陽(yáng)性克隆率小于10％是很正常的。四、克隆的其它要素③體系體積：通常用20ul都能連上，若連長(zhǎng)片段可以壓縮成10ul（前提是DNA數(shù)量不變）。④T4連接酶：酶選擇名牌公司產(chǎn)品，而且連接酶控制著整個(gè)分子克隆過(guò)程的瓶頸——連接，強(qiáng)烈建議買(mǎi)好的。如果連長(zhǎng)片段就加二倍的連接酶。⑤連接時(shí)間：過(guò)夜就應(yīng)該足夠了。四、克隆的其它要素

⑥連接溫度：最適是16℃。有人用4℃連接，也行。

⑦轉(zhuǎn)化：連接的轉(zhuǎn)化不能像轉(zhuǎn)質(zhì)粒那么隨便，要小心翼翼，盡量作到不放棄任何一個(gè)菌。一般所用的感受態(tài)體積最少是連接體系的5倍。長(zhǎng)片段的連接轉(zhuǎn)化時(shí)搖菌2小時(shí)。四、克隆的其它要素⑧對(duì)照：對(duì)照很關(guān)鍵，可以反應(yīng)出很多重要的信息，不要懶，你的連接若是問(wèn)題不少，就要乖乖的做對(duì)照。一般有如下幾種對(duì)照方式：

⑴轉(zhuǎn)化質(zhì)粒對(duì)照。和連接產(chǎn)物同樣抗性質(zhì)粒、一起轉(zhuǎn)化。這個(gè)對(duì)照目的是檢測(cè)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是否有效，即抗生素是否有效、板子是否有效、轉(zhuǎn)化的手法是否正確、以及感受態(tài)的效率如何（這需要你每次轉(zhuǎn)化質(zhì)粒都用相同的手法、用量，看長(zhǎng)的菌落數(shù)，若明顯太少就要懷疑感受態(tài)）。四、克隆的其它要素

⑵切完回收的vector直接轉(zhuǎn)化對(duì)照。如果你是雙酶切，切完的vector和沒(méi)切的vector的長(zhǎng)度相差不大，或跑電泳這兩種跑不很開(kāi)，就要做這個(gè)對(duì)照。目的是看切的是否徹底，是否還有環(huán)狀質(zhì)粒存在。長(zhǎng)不出克隆是對(duì)的，若長(zhǎng)出克隆，好好改進(jìn)你的酶切體系。

⑶切完回收的vector加連接酶自身連接再轉(zhuǎn)化做對(duì)照。雙酶切的，最好要做這個(gè)對(duì)照，這個(gè)對(duì)照能檢測(cè)酶切和回收的質(zhì)量，總之不長(zhǎng)克隆或只長(zhǎng)很少是對(duì)的，長(zhǎng)多了還是去改進(jìn)上游的步驟。

四、克隆的其它要素（七）基因來(lái)源問(wèn)題

對(duì)于原核基因，可以通過(guò)NCBI網(wǎng)路基因數(shù)據(jù)庫(kù)獲得全基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用基因組DNA為模板進(jìn)行PCR獲取相關(guān)基因；

對(duì)于真核基因，情況要復(fù)雜得多，雖然我們也能夠從基因數(shù)據(jù)庫(kù)獲得基因序列，但由于模板問(wèn)題，因此需要首先構(gòu)建基因文庫(kù)，或者利用RTPCR方法從真核細(xì)胞中獲得相關(guān)基因。四、克隆的其它要素真核基因獲取一、貼壁細(xì)胞總RNA提取：1、吸掉培養(yǎng)液，用PBS洗一遍2、往培養(yǎng)皿中加入1ml,TRIzol,吹打幾次(每10cm2面積,即3.5cm直徑的培養(yǎng)板加1ml)

3、移至1.5mlEP管，靜置5分鐘

4、加入200ul三氯甲烷，震蕩混勻，室溫靜置5分鐘

5、4度12000r/min，離心15分鐘，取上清約600ul

6、加入500ul異丙醇，混勻后，靜置30分鐘四、克隆的其它要素7、4℃12000r/min，離心15分鐘，棄上清8、加入1ml70%預(yù)冷酒精洗滌沉淀物9、4℃7500r/min，離心5分鐘10、棄上清，自然晾干11、加入50ulDEPC水溶解，測(cè)OD值

四、克隆的其它要素二、RT體系：20ul：預(yù)變性體系12ul

5×buffer

4ul

RNAase

inhibiter

1ul

10m

dNTP

2ul

MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶

1ul

42℃60min

；70℃

5min

；12℃

forever四、克隆的其它要素三、PCR體系20ul：10×buffer

2ul

10m

dNTP

0.5ul

Primer(F+R)

1ul

（0.5ul+0.5ul）稀釋后cDNA（50ul）1ul

Pfu

0.2ul

dd

water

15.3ul

95℃3min、（95℃30s，55℃30s，72℃35s）×29cycle、72℃10min、12℃forever五、基因克隆實(shí)例

啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因的構(gòu)建和活性檢測(cè)[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯1.掌握基因克隆方法2.掌握尋找啟動(dòng)子序列的方法；3.掌握用熒光素酶報(bào)告基因的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子之間的結(jié)合和激活效應(yīng)。五、基因克隆實(shí)例[實(shí)驗(yàn)原理]啟動(dòng)子是參與特定基因轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控的DNA序列，包含核心啟動(dòng)子區(qū)域和調(diào)控區(qū)域。核心啟動(dòng)子區(qū)域產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控區(qū)域能夠?qū)Σ煌沫h(huán)境條件作出應(yīng)答，對(duì)基因的表達(dá)水平做出相應(yīng)的調(diào)節(jié)。啟動(dòng)子的范圍非常大，可以包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp的區(qū)域，有些特定基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)部也存在著轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，因此也屬于啟動(dòng)子范圍。五、基因克隆實(shí)例

轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物識(shí)別的是啟動(dòng)子序列，而不是整個(gè)基因的序列。比如用干擾素處理細(xì)胞，所有干擾素作用的靶基因，因?yàn)閿y帶有ISRE（interferon-stimulatedresponseelements，干擾素刺激反應(yīng)元件）的啟動(dòng)子，因此都可以被激活轉(zhuǎn)錄。五、基因克隆實(shí)例

轉(zhuǎn)錄因子蛋白的結(jié)構(gòu)可以分成結(jié)合域（BD，bindingdomain）以及激活域（AD，activationdomain）兩部分，作為基因啟動(dòng)子DNA的序列也具有特征性的結(jié)構(gòu)。一般情況下，確定了一種新基因的編碼區(qū)序列之后，通過(guò)與htgs數(shù)據(jù)庫(kù)的同源性比對(duì)，可以很方便地確定其相應(yīng)的基因組DNA序列。在確定編碼基因的起始密碼子之后，指導(dǎo)基因表達(dá)的啟動(dòng)子序列一般位于其上游基因序列300-3000nt之間，鮮有例外。五、基因克隆實(shí)例

因此可以從翻譯起始密碼子上游的基因組DNA序列，選取3000nt左右的核苷酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。例如可以應(yīng)用在線(xiàn)軟件分析技術(shù)，或自行研發(fā)的啟動(dòng)子序列分析技術(shù)等軟件分析.五、基因克隆實(shí)例

在相應(yīng)化學(xué)反應(yīng)中，熒光的產(chǎn)生是來(lái)自于熒光素酶催化下的螢光素氧化，有些情況下反應(yīng)體系中也包括三磷酸腺苷（ATP）。熒光生成反應(yīng)通常分為以下兩步：螢光素+ATP→螢光素化腺苷酸（luciferyladenylate）+PPi；螢光素化腺苷酸+O2→氧熒光素+AMP+光（圖1）。這一反應(yīng)非常節(jié)省能量，幾乎所有輸入反應(yīng)的能量都被轉(zhuǎn)化為光。五、基因克隆實(shí)例

圖1.熒光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)五、基因克隆實(shí)例

目前Promega公司開(kāi)發(fā)出了熒光素酶報(bào)告基因系列載體（圖2），如pGL3及pGL2，它們含SV40啟動(dòng)子及增強(qiáng)子的不同組合，有助于分析DNA片段的轉(zhuǎn)錄活性。具體情況如下：pGL2-及pGL3-Basic載體不含啟動(dòng)子及增強(qiáng)子，因此將可能的啟動(dòng)子序列克隆到熒光素酶基因的上游，可測(cè)定其是否具有啟動(dòng)熒光素酶基因表達(dá)的活性；pGL2-及pGL3-Promoter載體含SV40的啟動(dòng)子，可驅(qū)動(dòng)熒光素酶基因表達(dá)，而插入可能的增強(qiáng)子可增加熒光素酶基因的表達(dá)；pGL2-及pGL3-Enhancer載體在熒光素酶基因下游插入了SV40的增強(qiáng)子，這可用于測(cè)定能增強(qiáng)熒光素酶基因表達(dá)的啟動(dòng)子；五、基因克隆實(shí)例

pGL2-及pGL3-Control載體含SV40的啟動(dòng)子及增強(qiáng)子，能產(chǎn)生高水平的熒光素酶基因表達(dá)，可作為檢測(cè)轉(zhuǎn)染頻率的有效對(duì)照。因此，我們可以把目的基因的啟動(dòng)子序列連接到熒光素酶的上游，把報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞。如果這段啟動(dòng)子序列確實(shí)可以和某個(gè)轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，而激活下游熒光素酶的轉(zhuǎn)錄和翻譯，那么當(dāng)加入底物和ATP時(shí)，體系的熒光產(chǎn)生就會(huì)增多，從而可以通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度來(lái)間接地反映轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子之間的結(jié)合和激活效應(yīng)。五、基因克隆實(shí)例五、基因克隆實(shí)例[儀器、材料與試劑]（一）儀器冷凍臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、PCR儀、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀、DNA凝膠電泳裝置（二）材料人肝癌細(xì)胞株HepG2、H1299細(xì)胞株、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、pGL3-Basic載體及檢測(cè)底物、限制性核酸內(nèi)切酶KpnI和HindIII、T4連接酶、KOD-plusDNA聚合酶、基因組DNA提取試劑盒、小量提取質(zhì)粒試劑盒、DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、熒光素酶雙報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒（三）試劑LB細(xì)菌培養(yǎng)液、雙蒸水、DNA電泳緩沖液（TAEbuffer）五、基因克隆實(shí)例[實(shí)驗(yàn)步驟]

第一步：基因組DNA的提取

將貼壁培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞處理成細(xì)胞懸液，按照試劑盒說(shuō)明提取DNA（離心柱型血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒，TiangenDR303），用分光光度計(jì)測(cè)定產(chǎn)物在260nm處吸收值，以計(jì)算其濃度。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度及完整性。

五、基因克隆實(shí)例第二步：Bax啟動(dòng)子的載體構(gòu)建Bax啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增和回收純化：Bax啟動(dòng)子序列為971bp（AB183034）,根據(jù)軟件Primerpremier5.0設(shè)計(jì)引物如下：上游引物（其中斜線(xiàn)加粗序列GGTACC為KpnI酶切位點(diǎn)，GG為保護(hù)性堿基）:5’-GGGGTACCCCTGCTGATCTATCAGCACAG-3’；下游引物（其中斜線(xiàn)加粗序列AAGCTT為HindIII酶切位點(diǎn)，GG為保護(hù)性堿基）：五、基因克隆實(shí)例第二步：Bax啟動(dòng)子的載體構(gòu)建下游引物：5’-GGAAGCTTACCGCCGCTCCCGCCGCCGCCTCT-3’。在PCR反應(yīng)管中加入：DNA2ml，dNTP（各2.5mM）4ml，10×buffer（無(wú)Mg2+）5ml，MgSO4（25mM）3ml，上游引物（10mM）2ml，下游引物（10mM）2ml，ddH2O3m1，KOD-plus1ml（高保真，能擴(kuò)高GC含量基因的酶KOD-plus）。五、基因克隆實(shí)例

PCR反應(yīng)條件如下：94℃變性3min，然后PCR36個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30s，60℃退火30s，68℃延伸1min，36個(gè)循環(huán)結(jié)束后，再68℃延伸5min。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖電泳并回收目的產(chǎn)物。pGL3-basic質(zhì)粒的抽提：采用堿裂解法小量抽提質(zhì)粒。所得質(zhì)粒用分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，于1%瓊脂糖凝膠電泳。五、基因克隆實(shí)例

Bax啟動(dòng)子PCR片段和pGL3-basic質(zhì)粒的雙酶切及回收：將目的promoter回收產(chǎn)物和pGL3-basic質(zhì)粒分別進(jìn)行KpnI和HindIII雙酶切，酶切條件分別如下：pGL3-basic質(zhì)粒/promoterDNA：10ml/30ml，KpnI（10U/ml）：2ml，HindIII（10U/ml）：2ml，10×buffer：5ml，ddH2O31ml/11ml，共50ml。37℃酶切過(guò)夜，完成后，于1%瓊脂糖凝膠電泳，并分別回收酶切后的promoterDNA和pGL3-basic質(zhì)粒。五、基因克隆實(shí)例

連接和轉(zhuǎn)化：將回收的promoterDNA雙酶切產(chǎn)物連接到pGL3-basic質(zhì)粒中，并將此重組的pGL3-basic質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組克隆。

分別取promoterDNA雙酶切回收產(chǎn)物（68ng/ml）6ml，pGL3-basic質(zhì)粒雙酶切回收產(chǎn)物（160ng/ml）2ml，10×buffer2ml，T4DNAligase（5U/ml，F(xiàn)ermentas）1ml，ddH2O9ml，共20ml。22℃連接2h。將20ml連接產(chǎn)物與100mlDH5a感受態(tài)混勻冰上放置30min，42℃90s，冰上5min，然后加入700mlLB培養(yǎng)基（無(wú)抗性），于37℃、250r/min搖床上培養(yǎng)1h后，涂于Amp+抗性的固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，平板上有克隆長(zhǎng)出，挑取一些克隆進(jìn)行陽(yáng)性鑒定。五、基因克隆實(shí)例

陽(yáng)性克隆鑒定、測(cè)序：挑取10個(gè)平板克隆接種于LB（Amp+抗性）培養(yǎng)基中，37℃、220r/min振搖培養(yǎng)直至菌液混濁。各取1ml做PCR克隆鑒定，于2%瓊脂糖膠電泳，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒作KpnI和HindIII雙酶切鑒定，挑選陽(yáng)性克隆上海生工公司測(cè)序。

五、基因克隆實(shí)例

第三步：熒光素酶表達(dá)活性測(cè)定

分別將pGL3-basic質(zhì)粒0.8mg和構(gòu)建的pGL3-basic-Bax-promoter質(zhì)粒0.8mg轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的H1299細(xì)胞中，同時(shí)轉(zhuǎn)染入0.01mg的pRL-SV40熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)染效率內(nèi)參照，24h后收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，制成細(xì)胞裂解液，使用Promega公司的雙熒光報(bào)告基因分析試劑和GloMax2-/20發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定熒光值。五、基因克隆實(shí)例[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]1.Bax啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖電泳并回收目的產(chǎn)物，結(jié)果如圖1?；厥债a(chǎn)物采用eppendorfBioPhotometer紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度為80ng/ml。pGL3-basic質(zhì)粒抽提后所得質(zhì)粒于1%瓊脂糖凝膠電泳，如圖2所示。五、基因克隆實(shí)例

Bax啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物五、基因克隆實(shí)例pGL3-basic質(zhì)粒電泳圖

1：1kbladder；

2，3：pGL3-basic質(zhì)粒五、基因克隆實(shí)例雙酶切完成后，于1%瓊脂糖凝膠電泳,分別回收酶切后promoterDNA和pGL3-basic質(zhì)粒五、基因克隆實(shí)例陽(yáng)性克隆鑒定：挑取10個(gè)平板克隆，接種于LB（Amp+抗性）培養(yǎng)基中，37℃、220r/min振搖培養(yǎng)直至菌液混濁。各取1ml做PCR克隆鑒定，于2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4，可見(jiàn)有5個(gè)克隆均為陽(yáng)性。提取1、6、8號(hào)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒作KpnI和HindIII雙酶切鑒定，酶切結(jié)果見(jiàn)圖5。挑選陽(yáng)性克隆于上海生工公司測(cè)序，結(jié)果證明所構(gòu)建質(zhì)粒與設(shè)計(jì)相符。五、基因克隆實(shí)例Bax啟動(dòng)子報(bào)告基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后熒光素酶表達(dá)六、研究生實(shí)驗(yàn)過(guò)程中

常出現(xiàn)的錯(cuò)誤（一）引物設(shè)計(jì)出現(xiàn)的錯(cuò)誤將待克隆的基因進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)分析，從質(zhì)粒中選取兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶，注意，最好采用有粘性末端的酶，切記不要采用一個(gè)粘性末端，一個(gè)平末端，這樣永遠(yuǎn)都不能成功，引物采用的限制性?xún)?nèi)切酶在待克隆的基因中不存在該位點(diǎn)。引物設(shè)計(jì)時(shí)，不管是上游還是下游引物，都從5‘端-3’端，因此，限制性?xún)?nèi)切酶永遠(yuǎn)是一個(gè)順序，如BamHI，GGATCC上游，下游引物的退火溫度要接近，在人為堿基中通過(guò)調(diào)節(jié)GC，或AT的量調(diào)節(jié)；避免引物二聚體的產(chǎn)生。研究生實(shí)驗(yàn)過(guò)程中常出現(xiàn)的錯(cuò)誤（二）限制性?xún)?nèi)切酶活性不驗(yàn)證克隆過(guò)程中限制性?xún)?nèi)切酶的驗(yàn)證對(duì)克隆的成功與否十分關(guān)鍵，需要通過(guò)對(duì)質(zhì)粒的單酶切驗(yàn)證，采用單-單-雙的酶切和瓊脂糖電泳驗(yàn)證，質(zhì)粒完全線(xiàn)性化可認(rèn)為酶活性正常，同時(shí)注意酶切緩沖液的適配問(wèn)題，兩種限制性?xún)?nèi)切酶如果一個(gè)高鹽，一個(gè)低鹽，采用中鹽緩沖液。六、研究生實(shí)驗(yàn)過(guò)程中

常出現(xiàn)的錯(cuò)誤（三）表達(dá)載體中閱讀框的錯(cuò)誤蛋白誘導(dǎo)表達(dá)中我們經(jīng)常采用融合蛋白表達(dá)方式，如果標(biāo)簽序列在N-端，我們要表達(dá)的基因的起始密碼子ATG必需在閱讀框內(nèi)；如果標(biāo)簽序列在C-端，我們要表達(dá)的基因的終止密碼子在引物中要去掉。六、研究生實(shí)驗(yàn)過(guò)程中

常出現(xiàn)的錯(cuò)誤（四）用錯(cuò)質(zhì)?？寺∵^(guò)程中需要的質(zhì)粒來(lái)源十分重要，經(jīng)常要從師兄或師姐或從別的實(shí)驗(yàn)室獲得，要質(zhì)粒也要從牢靠的人手上獲得，否則，2個(gè)星期甚至一個(gè)月會(huì)浪費(fèi)掉，人也很郁悶，本來(lái)完全可以避免。六、研究生實(shí)驗(yàn)過(guò)程中

常出現(xiàn)的錯(cuò)誤（五）用錯(cuò)抗生素實(shí)驗(yàn)室中，研究生容易犯得錯(cuò)誤是抗生素用錯(cuò)了，導(dǎo)致細(xì)菌不能生長(zhǎng)。注意：當(dāng)菌在含抗生素平板上不長(zhǎng)時(shí)，首先要檢查抗生素是否用錯(cuò)。六、研究生實(shí)驗(yàn)過(guò)程中

常出現(xiàn)的錯(cuò)誤（六）限制性?xún)?nèi)切酶選擇錯(cuò)誤盡量選擇有粘性末端的限制性?xún)?nèi)切酶，不要選擇平末端的限制性?xún)?nèi)切酶，如EcoRV等，更不要用一個(gè)粘性末端的限制性?xún)?nèi)切酶，另一個(gè)平末端的限制性?xún)?nèi)切酶，如果這樣的話(huà)，可能一輩子也不能得到你要的結(jié)果。如果只能用平末端的限制性?xún)?nèi)切酶克隆，注意，載體需要進(jìn)行去磷酸化處理，否則，給自己找麻煩。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL-21大腸桿菌中，選取1-2個(gè)單克隆在LB或M9培養(yǎng)基上加入相應(yīng)的抗生素培養(yǎng)，當(dāng)菌體生長(zhǎng)到OD600至0.7左右加入IPTG或其它誘導(dǎo)劑如乳糖等，誘導(dǎo)6-8小時(shí)收菌，超聲破壁，離心，用未誘導(dǎo)或空載BL-21plus大腸桿菌為對(duì)照進(jìn)行SDS-PAGA電泳。電泳時(shí)最好用總菌蛋白、上清蛋白及沉淀蛋白進(jìn)行比較，確定誘導(dǎo)的蛋白可溶性如何。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

真核和原核表達(dá)系統(tǒng)比較

體外重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)主要分為真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)。其中原核表達(dá)系統(tǒng)以大腸桿菌表達(dá)為主，也是目前應(yīng)用最廣泛最多的表達(dá)系統(tǒng)。真核表達(dá)系統(tǒng)分為：哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，酵母表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)。其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)又分為哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)和穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建，重組抗體生產(chǎn)。酵母系統(tǒng)又分為畢赤酵母表達(dá)和釀酒酵母表達(dá)。針對(duì)真核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母表達(dá)較為常用。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)各種表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)大腸桿菌蛋白誘導(dǎo)表達(dá)：將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL-21plys大腸桿菌中，選取1-2個(gè)單克隆在LB或M9培養(yǎng)基上加入相應(yīng)的抗生素培養(yǎng)，當(dāng)菌體生長(zhǎng)到OD600至0.7左右加入IPTG或其它誘導(dǎo)劑如乳糖等，誘導(dǎo)6-8小時(shí)收菌，超聲破壁，離心，用未誘導(dǎo)或空載BL-21大腸桿菌為對(duì)照進(jìn)行SDS-PAGA電泳。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGA電泳后的膠進(jìn)行考姆斯亮蘭進(jìn)行染色，對(duì)照不出現(xiàn)，而誘導(dǎo)后出現(xiàn)條帶且分子量符合預(yù)期的視為陽(yáng)性，誘導(dǎo)成功。然后檢查蛋白在上清還是在沉淀中，確定蛋白的可溶性。大腸桿菌蛋白誘導(dǎo)表達(dá)可能出現(xiàn)的情況及應(yīng)對(duì)：1、誘導(dǎo)后蛋白不表達(dá)2、誘導(dǎo)后蛋白為包含體3、表達(dá)的量不高4、大腸桿菌不能生長(zhǎng)5、大腸桿菌前面生長(zhǎng)良好，后期快速消失七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)1、誘導(dǎo)后蛋白不表達(dá)

這種情況經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)，最大的可能性是克隆的基因不正確或者基因表達(dá)的閱讀框不正確，如誘導(dǎo)2-3次后仍然不表達(dá)，建議回到測(cè)序的結(jié)果中再仔細(xì)檢查，找到原因七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)2、誘導(dǎo)后蛋白為包含體包含體產(chǎn)生的原因有以下兩個(gè)方面：-基因本身決定了其不溶性（真核基因/膜蛋白）-表達(dá)過(guò)快，來(lái)不及正確折疊對(duì)于第一種情況，能改變的不多，采用共表達(dá)伴侶蛋白進(jìn)行改善對(duì)于第二種情況，可以通過(guò)降低誘導(dǎo)溫度，采用溫和誘導(dǎo)劑如（乳糖代替IPTG)，加入相關(guān)的氨基酸（精氨酸），采用共表達(dá)伴侶蛋白效果更佳。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)3、誘導(dǎo)后蛋白表達(dá)的量不高可通過(guò)高密度培養(yǎng)，增加細(xì)胞量；可通過(guò)增加抗生素濃度減少質(zhì)粒丟失；可通過(guò)新型蛋白誘導(dǎo)表達(dá)方式，如巴奧得的天達(dá)1號(hào)，使蛋白（可溶性）表達(dá)及細(xì)胞量均得到明顯提高；天達(dá)2號(hào)使蛋白（包含體）表達(dá)及細(xì)胞量均得到大幅提高。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)4、大腸桿菌不能生長(zhǎng)可能的原因有抗生素用錯(cuò)了或要表達(dá)的是有毒基因：

有毒基因影響：宿主中質(zhì)粒不穩(wěn)定、抑制菌體生長(zhǎng)或溶菌、表達(dá)量低或不表達(dá)

應(yīng)對(duì)辦法：?jiǎn)?dòng)子調(diào)控、抑制本底表達(dá)

選擇特殊表達(dá)載體PETco-co

選擇宿主菌BL-21（DE3）PlysS,BL-21（DE3）PlysE

包涵體表達(dá)七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)5、大腸桿菌前面生長(zhǎng)良好，后期快速消失可能的原因是受到噬菌體污染：（1）

發(fā)酵液光密度上升緩慢，甚至下降，肉眼可見(jiàn)發(fā)酵液逐漸變清；（2）

耗糖速度緩慢或停止，產(chǎn)物生成量少或不增加，發(fā)酵液中殘?zhí)歉?；?）產(chǎn)生大量泡末，發(fā)酵液呈粘稠狀；（4

）菌體不規(guī)則，甚至出現(xiàn)畸形。

一旦出現(xiàn)以上情況，立即進(jìn)行環(huán)境消毒，不要抱有幻想

七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)噬菌體污染對(duì)策：1

決不使用可疑菌種；2

清除周?chē)h(huán)境中存在的噬菌體。能滅菌的滅菌，能消毒的消毒，搞好清潔衛(wèi)生工作；3

選育抗噬菌體菌株4

輪換使用菌株。因?yàn)橐粋€(gè)菌株用的時(shí)間一長(zhǎng)，就有可能出現(xiàn)該菌種的噬菌體。藥物防治：

（1）螯合劑。如植酸鹽（0.05~1%），檸檬酸鹽（0.2~0.5%），草酸鹽（0.2~0.5%），三聚磷酸鹽（0.5~1%）等可抑制噬菌體的吸附或阻止DNA的注入

七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)藥物防治：

（2）表面活性劑。0.01~0.2%的聚乙二醇單酯、聚氧乙烯烷基醚、土溫20、土溫60等。主要作用于寄主細(xì)胞表面，抑制噬菌體在細(xì)菌上的吸附。（3）抗菌素。如1ug/mL的金霉素、四環(huán)素、氯霉素等抑制噬菌體蛋白質(zhì)的合成；

（4）

N-脂酰氨基酸。是一類(lèi)具有16~18個(gè)碳原子的衍生物。如20ug/mL的N-棕櫚酰-L-谷氨酸，其作用機(jī)制是抑制噬菌體核酸的復(fù)制或子代噬菌體的成熟

七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)真核基因表達(dá)的調(diào)控——真核基因表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn)盡管我們現(xiàn)在對(duì)真核基因表達(dá)調(diào)控知道還不多，但與原核生物比較它具有一些明顯的特點(diǎn)。真核基因表達(dá)調(diào)控的環(huán)節(jié)更多如前所述：基因表達(dá)是基因經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯、產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的整個(gè)過(guò)程。同原核生物一樣，轉(zhuǎn)錄依然是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的主要環(huán)節(jié)。但真核基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細(xì)胞核（線(xiàn)粒體基因的轉(zhuǎn)錄在線(xiàn)粒體內(nèi)），翻譯則多在胞漿，兩個(gè)過(guò)程是分開(kāi)的，因此其調(diào)控增加了更多的環(huán)節(jié)和復(fù)雜性，轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控占有了更多的分量。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)圖中標(biāo)出了真核細(xì)胞在分化過(guò)程中會(huì)發(fā)生基因重排（generearrangement），即胚原性基因組中某些基因會(huì)再組合變化形成第二級(jí)基因。例如編碼完整抗體蛋白的基因是在淋巴細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程中，由原來(lái)分開(kāi)的幾百個(gè)不同的可變區(qū)基因經(jīng)選擇、組合、變化、與恒定區(qū)基因一起構(gòu)成穩(wěn)定的、為特定的完整抗體蛋白編碼的可表達(dá)的基因。

這種基因重排使細(xì)胞可能利用幾百個(gè)抗體基因的片段，組合變化而產(chǎn)生能編碼達(dá)108種不同抗體的基因，其中就有復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

此外，真核細(xì)胞中還會(huì)發(fā)生基因擴(kuò)增（geneamplification），即基因組中的特定段落在某些情況下會(huì)復(fù)制產(chǎn)生許多拷貝。最早發(fā)現(xiàn)的是蛙的成熟卵細(xì)胞在受精后的發(fā)育程中其rRNA基因（可稱(chēng)為rDNA）可擴(kuò)增2000倍，以后發(fā)現(xiàn)其他動(dòng)物的卵細(xì)胞也有同樣的情況，這很顯然適合了受精卵其后迅速發(fā)育分裂要合成大量蛋白質(zhì)要求有大量核糖體的需要。基因的擴(kuò)增無(wú)疑能夠大幅度提高基因表達(dá)產(chǎn)物的量，但這種調(diào)控機(jī)理至今還不清楚七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)真核基因表達(dá)調(diào)控和原核生物相比有什么相同點(diǎn)和區(qū)別（1）原核生物和真核生物基因表達(dá)調(diào)控的共同點(diǎn)：

a結(jié)構(gòu)基因均有調(diào)控序列；

b表達(dá)過(guò)程都具有復(fù)雜性，表現(xiàn)為多環(huán)節(jié)；

七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)（2）與原核生物比較，真核生物基因表達(dá)調(diào)控具有自己的特點(diǎn)：

a真核生物基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程更復(fù)雜；

b基因及基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同，如真核生物基因具有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)等；

c轉(zhuǎn)錄與翻譯的間斷性，原核生物轉(zhuǎn)錄與翻譯同時(shí)進(jìn)行，而真核生物該兩過(guò)程發(fā)生在不同區(qū)域，具有間斷性；

d轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程；

e正負(fù)調(diào)控機(jī)制；

fRNA聚合酶種類(lèi)多。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

真核表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)①根據(jù)原核生物蛋白與靶DNA間作用的高度特異性設(shè)計(jì)，而靶DNA與真核基因調(diào)控序列基本無(wú)同源性，故不存在基因的非特異性激活或抑制；②能誘導(dǎo)基因高效表達(dá)，可達(dá)105倍，為其他系統(tǒng)所不及；③能?chē)?yán)格調(diào)控基因表達(dá)，即不僅可控制基因表達(dá)的“開(kāi)關(guān)”，還可人為地調(diào)控基因表達(dá)量。因此，利用真核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)目的蛋白越來(lái)越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。

七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)1、酵母表達(dá)系統(tǒng)

最早應(yīng)用于基因工程的酵母是釀酒酵母，后來(lái)人們又相繼開(kāi)發(fā)了裂殖酵母、克魯維酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)。目前甲醇酵母主要有H

Polymorpha，Candida

Bodini，Pichia

Pastris3種。以Pichia

Pastoris應(yīng)用最多。甲醇酵母的表達(dá)載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中。大部分甲醇酵母的表達(dá)載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一1(A0x1)，在該基因的啟動(dòng)子(PAXOI)作用下，外源基因得以表達(dá)。PAXOI是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，在以葡萄糖或甘油為碳源時(shí)。

酵母表達(dá)系統(tǒng)甲醇酵母中AOx1基因的表達(dá)受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時(shí)PAXOI可被誘導(dǎo)激活，因而外源基因可在其控制下表達(dá),將目的基因多拷貝整合入酵母染色體后可以提高外源蛋白的表達(dá)水平及產(chǎn)量。此外甲醇酵母的表達(dá)載體都為E.coli／Pichia

Pastoris的穿梭載體，其中含有E.coli復(fù)制起點(diǎn)和篩選標(biāo)志，可在獲得克隆后采用E.coli細(xì)胞大量擴(kuò)增.目前，將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入酵母菌的方法主要有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電擊法及氯化鋰法等。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

甲醇酵母一般先在含甘油的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。培養(yǎng)至高濃度。再以甲醇為碳源誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白。這樣可以大大提高表達(dá)產(chǎn)。利用甲醇酵母表達(dá)外源性蛋白質(zhì)其產(chǎn)量往往可達(dá)克級(jí)。與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動(dòng)物細(xì)胞，不會(huì)發(fā)生超糖基化。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

利用PAXOI表達(dá)外源蛋白時(shí),一般需很長(zhǎng)時(shí)間才能達(dá)到峰值水平，而甲醇是高毒性、高危險(xiǎn)性化工產(chǎn)品。使得實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生產(chǎn)。因此那些不需要甲醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子受到青睞包括GAP、FLD1、PEX8、YPTI等多種。利用三磷酸甘油醛脫氫酶(GAP)啟動(dòng)子代替PAXOI，不需要甲醇誘導(dǎo)。培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)需更換碳源，操作更為簡(jiǎn)便，可縮短外源蛋白到達(dá)峰值水平的時(shí)間。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種后起的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，由于兼具原核以及真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，正在基因工程領(lǐng)域中得到日益廣泛的應(yīng)用。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

2、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣的昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)通常采用目宿銀紋夜蛾桿狀病毒(AcNPV)作為表達(dá)載體。在AcNPV感染昆蟲(chóng)細(xì)胞的后期，核多角體基因可編碼產(chǎn)生多角體蛋白，該蛋白包裹病毒顆粒可形成包涵體。核多角體基因啟動(dòng)子具有極強(qiáng)的啟動(dòng)蛋白表達(dá)能力，故常被用來(lái)構(gòu)建桿狀病毒傳遞質(zhì)粒。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)克隆入外源基因的傳遞質(zhì)粒與野生型AcNPV共轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞后可發(fā)生同源重組，重組后多角體基因被破壞，因而在感染細(xì)胞中不能形成包涵體，利用這一特點(diǎn)可挑選出含重組桿狀病毒的昆蟲(chóng)細(xì)胞但效率比較低，且載體構(gòu)建時(shí)間長(zhǎng)，一般需要4~6周。此外，昆蟲(chóng)細(xì)胞不能表達(dá)帶有完整N-聯(lián)聚糖的真核糖蛋白。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表達(dá)引起昆蟲(chóng)細(xì)胞的裂解，胞質(zhì)內(nèi)的物質(zhì)釋放出來(lái)，與

目的蛋白混在一起，從而使蛋白的純化工作變得很困難，另外水解酶的釋放會(huì)降解重組蛋白。為了克服以上這些困難，科學(xué)工作者先后嘗試用絲蛾肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子或桿狀病毒ie-1基因啟動(dòng)子表達(dá)外源蛋白，但效果都不明顯。Farrel等介紹了一種新型的鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要包括3個(gè)調(diào)節(jié)外源蛋白表達(dá)序列

七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)（1）Bombyx

mori的肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子；（2）Bombyx

mori的核型多角體病毒(BmNPV)的立早基因ie-1(編碼俄IE-1蛋白，該蛋白是種轉(zhuǎn)錄激活因子，可在體外激活肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子)（3）BmNPV的同源重復(fù)序列3(HR3)可作為肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子的增強(qiáng)子。

三者協(xié)同作用，可使轉(zhuǎn)錄活性提高

1000倍以上，從而大大地提高外源蛋白的表達(dá)水平。另外目前還有一種新型的宿主范圍廣的雜合核多角體病毒(HyNPV)被應(yīng)用于昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建，該病毒由AcNPV及Bni'qP發(fā)展而來(lái)。

七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)一般情況下桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)所能表達(dá)的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分為非分泌性。為了解決這個(gè)問(wèn)題將Hsp70(熱休克蛋白70)與外源蛋白共表達(dá)可明顯提高重組蛋白的分泌水平，這是因?yàn)榉置谛远嚯谋环g后必須到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行加工才能被分泌至胞外。如果到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)前，前體多肽就伸展開(kāi)來(lái)，暴露出疏水殘基，殘基間的相互作用可引起多肽的凝聚，這對(duì)最終的表達(dá)水平有很大影響。而Hsp70是一種分子伴侶，能夠與新翻譯的多肽結(jié)合，抑制前體肽的凝聚使前體肽順利到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行加工，從而提高蛋白的分泌水平。

七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

最近，人們又構(gòu)建了桿狀病毒-S2表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能將重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞，以前人們認(rèn)為桿狀病毒僅能在鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞(如

sf9、sf21)中復(fù)制，不能在其他昆蟲(chóng)細(xì)胞(如果蠅細(xì)胞)中復(fù)制，然而目前研究表明在一定條件下，桿狀病毒也能感染果蠅細(xì)胞。在果蠅細(xì)胞中，桿狀病毒的多角體基因啟動(dòng)子幾乎不發(fā)生作用。桿狀病毒-S2表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體利用的是果蠅啟動(dòng)子如Hsp70啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白5C啟動(dòng)子、金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子等，其中，Hsp70的作用最強(qiáng)。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)重組桿狀病毒感染S2細(xì)胞后不會(huì)引起宿主細(xì)胞的裂解，且蛋白表達(dá)水平與鱗翅目細(xì)胞相似，因此，桿狀病毒-S2系統(tǒng)是一個(gè)很有應(yīng)用前景的昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，特別是桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)由于其操作安全，表達(dá)量高，目前與酵母表達(dá)系統(tǒng)一樣被廣泛應(yīng)用于基因工程的各個(gè)領(lǐng)域中。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)由哺乳動(dòng)物細(xì)胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)，在活性方面遠(yuǎn)勝于原核表達(dá)系統(tǒng)及酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)，更接近于天然蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體包含原核序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記基因、終止子和多聚核苷酸信號(hào)等。

將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞主要通過(guò)2類(lèi)方法

七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

一、感染性病毒顆粒感染宿主細(xì)胞，二是通過(guò)脂質(zhì)體法、顯微注射法

、磷酸鈣共沉淀法及DEAE一葡聚糖法等非病毒載體的方式將基因?qū)氲郊?xì)胞中。外源基因的體外表達(dá)一般采用質(zhì)粒表達(dá)載體，如將重組質(zhì)粒導(dǎo)入CHO細(xì)胞可建立高效穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)，而利用COS細(xì)胞可建立瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。目前，病毒載體已成為動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)外源基因的有力工具，在臨床基因治療的探索中也發(fā)揮了重要作用。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

利用它作為載體可同時(shí)插入幾種外源基因，從

而構(gòu)

建多價(jià)疫苗。另外，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染效率高，某些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系也可通過(guò)其導(dǎo)入外源基因，但要注意的是逆轉(zhuǎn)錄病毒可整合入宿主細(xì)胞染色體，具有潛在的危險(xiǎn)性。

七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

由于腺病毒易于培養(yǎng)、純化，宿主范圍廣,故采用該類(lèi)病毒構(gòu)建的載體被廣泛應(yīng)用腺病毒載體的構(gòu)建依賴(lài)于腺病毒穿梭質(zhì)粒和包裝載體之間的同源重組。但是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的這種同源重組效率很低，利用細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建重組體效率會(huì)大大提高，即將外源基因插入到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，形成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，將其線(xiàn)性化后與腺病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸埃希菌。另一種方法是通過(guò)CrelaxP系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒載體，在轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒中都插入laxP位點(diǎn)，然后將兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染表達(dá)Cre重組酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通過(guò)Cre介導(dǎo)兩個(gè)laxP位點(diǎn)之間的DNA發(fā)生重組，可獲得重組腺病毒，這種重組效率比一般的細(xì)胞內(nèi)同源效率高30倍。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

最近，人們?cè)跅U狀病毒中插入巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子建立了高效的基因轉(zhuǎn)移載體。由于桿狀病毒是昆蟲(chóng)病毒，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不會(huì)引起病毒基因的表達(dá)，而且載體的構(gòu)建容易，因而利用桿狀病毒進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移為我們提供了很好的途徑。利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源基因時(shí)，大多數(shù)情況下不需要誘導(dǎo)，但當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性時(shí)應(yīng)采取誘導(dǎo)，這樣可避免表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生早期就對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用到的誘導(dǎo)型載體主要與啟動(dòng)子有關(guān)如熱休克蛋白啟動(dòng)子可在高溫下被誘導(dǎo)，還有重金屬、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。但這些系統(tǒng)存在一些共同的缺陷，如誘導(dǎo)表達(dá)特異性差；當(dāng)系統(tǒng)處于關(guān)閉狀態(tài)時(shí)表達(dá)有泄漏誘導(dǎo)劑本身有毒性，常對(duì)細(xì)胞造成損傷等。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

四環(huán)素誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的哺乳動(dòng)物細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有嚴(yán)密、高效可控制性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。

外源蛋白的表達(dá)會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，因此利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源基因時(shí)，一個(gè)主要問(wèn)題便是外源基因不能持久穩(wěn)定地表達(dá)。七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

Mielke等構(gòu)建了一種能夠在哺乳動(dòng)物中穩(wěn)定表達(dá)異二聚體蛋白的載體系統(tǒng)，在這個(gè)系統(tǒng)中，編碼抗體重鏈和輕鏈的cDNA及嘌呤霉素抗性基因被轉(zhuǎn)錄成三順?lè)磎RNA。內(nèi)部的順?lè)醋油ㄟ^(guò)內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IREs)介導(dǎo)進(jìn)行翻譯，通過(guò)持續(xù)選擇壓力，無(wú)需繁瑣的篩選過(guò)程，便可獲得持久、穩(wěn)定表達(dá)抗體分子的重組體。

七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)常用的宿主細(xì)胞有CHO、COS、BHK、SP2／0、NIH3T3等，不同的宿主細(xì)胞對(duì)蛋白表達(dá)水平和蛋白質(zhì)的糖基化有不同的影響，因此在選擇宿主細(xì)胞時(shí)應(yīng)根據(jù)具體情況而定。

七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

利用基因工程技術(shù)表達(dá)外源蛋白。其產(chǎn)量還不高，難以滿(mǎn)足大規(guī)模的實(shí)際應(yīng)用。通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)可從動(dòng)物的乳汁或植物的葉組織中很方便地獲得大量較純的生物活性物質(zhì)，但目前這項(xiàng)技術(shù)還不很成熟，有待進(jìn)一步研究。

七、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

目前已經(jīng)建立了多種誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，但它們都有其優(yōu)點(diǎn)和不足，這就需要我們根據(jù)自己的要求選用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)理想的可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)需要符合下述幾個(gè)方面的要求。

①特異性：該系統(tǒng)不受其他內(nèi)源因素的影響，僅能被外源的非毒性藥物所活化。

②非干擾性：該系統(tǒng)成分不能對(duì)細(xì)胞通路有干擾。

③可誘導(dǎo)性：該系統(tǒng)在非活化狀態(tài)下本底活性最低，而在活化狀態(tài)下能快速產(chǎn)生高水平的基因表達(dá)。④誘導(dǎo)劑的生物利用率：調(diào)節(jié)分子能快速滲透人各組織，能通過(guò)胎盤(pán)屏障及血腦屏障。⑤可逆性：誘導(dǎo)劑能快速被各組織清除使該系統(tǒng)很快恢復(fù)非活化狀態(tài)。⑥劑量依賴(lài)性：該系統(tǒng)的反應(yīng)與誘導(dǎo)劑的濃度成正比，以便進(jìn)行定性定量分析。總之，各種表達(dá)系統(tǒng)各有其優(yōu)缺點(diǎn)，酵母和昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)水平高，生產(chǎn)成本低八、實(shí)例Tet-Off蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

EstablishmentofdoublestableN-JNKcelllinesandfragmentexpressionTheHA-N-JNKcDNAinsertedpUHD-10-3plasmidwastransfectedintothecellswithhighexpressionandlowbasallevelandtetwasaddedimmediatelytoafinalconcentrationof1μg/ml.Resistantcloneswereselectedbyusing600μg/mlgeneticin(G418)and100μg/mlhygromycin.

JBC,275(22),16590–16596,2000八、實(shí)例Tet-Off蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

ThereisanexogenousHAtagattheN-terminusofN-JNKforavoidingtheendogenousJNK,sowhentet(1μg/ml)waspresent,N-JNKfragmentexpressionwassuppressed.

JBC,275(22),16590–16596,2000八、實(shí)例Tet-Off蛋白誘導(dǎo)表達(dá)Ontheotherhand,iftetwaswithdrawnbythreetimeswashingwithPBSandaddingnormalmedium,theexpressionofN-JNKincreasedwithtime,asdetectedbyWesternblot.

JBC,275(22),16590–16596,2000八、實(shí)例Tet-Off蛋白誘導(dǎo)表達(dá)八、實(shí)例Tet-Off蛋白誘導(dǎo)表達(dá)九、通過(guò)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在真核細(xì)胞

表達(dá)蛋白注意事項(xiàng)

在真核細(xì)胞如NIH3T3細(xì)胞中用PCDNA3質(zhì)粒表達(dá)蛋白時(shí)可能會(huì)遇到表達(dá)不了或表達(dá)太少的情況，除了可以通過(guò)加大轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒量外，特別要注意在基因前面加入Kosak序列ACCACCATG，這樣對(duì)基因的表達(dá)會(huì)有很好的促進(jìn)作用

另外可以篩選Stable-expressioncellularline來(lái)進(jìn)行蛋白的穩(wěn)定表達(dá)

九、通過(guò)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在真核細(xì)胞

表達(dá)蛋白注意事項(xiàng)

表達(dá)過(guò)程中蛋白標(biāo)簽序列的作用蛋白標(biāo)簽（proteintag）是指利用DNA體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、示蹤和純化等。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，研究人員相繼開(kāi)發(fā)出了具有各種不同功能的蛋白標(biāo)簽。目前，這些蛋白標(biāo)簽已在基礎(chǔ)研究和商業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)等方面得到了廣泛的應(yīng)用。九、通過(guò)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在真核細(xì)胞

表達(dá)蛋白注意事項(xiàng)氨基酸標(biāo)簽（含小肽標(biāo)簽）

組氨酸標(biāo)簽（His

tag）一般為6個(gè)組氨酸，用Ni2+

（Cu2+）親和層析純化FLAG

tag

：N-DYKDDDDK-C

recovered

with

specific

antibody

HA

tagan

epitope

derived

from

the

Influenza

protein

haemagglutinin

(HA，禽流感病毒血凝素)，e.g.

N-YPYDVP-Crecovery

with

an

HA

antibody

九、通過(guò)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在真核細(xì)胞

表達(dá)蛋白注意事項(xiàng)MYC

tag：an

epitope

derived

from

the

human

proto-oncoprotein

MYC，e.g.

N-ILKKATAYIL-C,

N-EQKLISEEDL-C

recovery

with

an

MYC

antibody

SBP

tag：Streptavidin

Binding

Peptide，鏈霉親合素結(jié)合肽，38

amino

acid

tag

(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP)，九、通過(guò)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在真核細(xì)胞

表達(dá)蛋白注意事項(xiàng)

更多參考在Sigma

CBP

tag：鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（CBP;

26aa）鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽與鈣調(diào)素結(jié)合是Ca2+依賴(lài)的，這種結(jié)合不受標(biāo)簽所處的位置影響（N端和C端均可），在中性pH條件下使用2mM

EGTA可以很方便的將目標(biāo)蛋白洗脫下來(lái)。這一系統(tǒng)有如下優(yōu)點(diǎn)：1

特異性很高，因?yàn)榇竽c桿菌沒(méi)有可以和鈣調(diào)素結(jié)合的蛋白；2

與His標(biāo)簽相比可以在強(qiáng)還原性條件下純化。

纖維素結(jié)合肽（CBD）：能與纖維素介質(zhì)特異性的結(jié)合，可以在溫和的條件下洗脫（乙二醇或低鹽條件），pET

CBD

載體含有纖維素結(jié)合肽（CBD）的序列，可方便構(gòu)建。

九、通過(guò)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在真核細(xì)胞

表達(dá)蛋白注意事項(xiàng)二、蛋白質(zhì)標(biāo)簽

GST

tag：

the

small

glutathione-S-transferase

(GST;

26

kDa)

recovery

by

affinity

to

substrate

glutathione

bound

to

a

column,

e.g.

glutathione

sepharose

MBP

tag：麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP;

40kDa）載體：pMAL

IMPACT：Intein-Mediated

Purification

with

an

affinity

Chitin-binding

Tag（幾丁質(zhì)結(jié)合肽）

九、通過(guò)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在真核細(xì)胞

表達(dá)蛋白注意事項(xiàng)硫氧還蛋白：Thioredoxins

are

proteins

that

act

as

antioxidants

by

facilitating

the

reduction

of

other

proteins

by

cysteine

thiol-disulfide

exchange.

Protein

A：

a

40-60

kDa

MSCRAMM

surface

protein

originally

found

in

the

cell

wall

of

the

bacteria

Staphylococcus

aureus.

It

has

found

use

in

biochemical

research

because

of

its

ability

to

bind

immunoglobulins.

It

binds

proteins

from

many

of

二、蛋白質(zhì)標(biāo)簽mammalian

species,

most

notably

IgG’s.

It

binds

with

the

Fc

region

of

immunoglobulins