注射劑無菌保證工藝與驗證常見技術(shù)問

注射劑無菌保證工藝研究與驗證常見技術(shù)問題注：以下均為2023年度第一期講習(xí)班（注射劑無菌保證工藝研究與驗證技術(shù)要求）參會代表所提問題，本期講習(xí)班講習(xí)組根據(jù)目前的有關(guān)技術(shù)要求，經(jīng)過認(rèn)真梳理、分析、總結(jié)后，現(xiàn)予以發(fā)布，并就相關(guān)問題進行討論與交流。

1、按照歐盟決策樹的要求，不能達(dá)到121℃，15分鐘滅菌，可選擇F0≥8的殘存概率法。請問，若產(chǎn)品能達(dá)到121℃，12分鐘滅菌，是否就不能選擇121℃，10分鐘，同樣，能達(dá)到10分鐘，就不能選擇8分鐘，都是F0≥8的情況。答：從微生物殺滅的數(shù)學(xué)模型可知，在初始污染相同的情況下，滅菌F0值越大，無菌保證水平越高。因此，顯然為降低產(chǎn)品殘留微生物的風(fēng)險，盡量選擇高的F0值是順理成章的。

2、在產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的條件下，均能滿足121℃，8分鐘和115℃，30分鐘，哪個條件應(yīng)該優(yōu)先選擇呢？答：不考慮產(chǎn)品理化質(zhì)量穩(wěn)定性，理論上這兩種條件達(dá)到的F0值幾乎相等，無所謂優(yōu)選哪個。但實際生產(chǎn)中，還要考慮滅菌器內(nèi)產(chǎn)品中熱穿透的情況，滅菌器內(nèi)不同部位的產(chǎn)品實際獲得的F0值的差異，不同滅菌批次間產(chǎn)品的F0的差異等。應(yīng)該選擇熱分布差異小，產(chǎn)品F0值差異較小的滅菌工藝。

2℃，滅菌30分鐘”，這種表示法是否規(guī)范？3、申報資料中的滅菌條件為“101℃40min。15min或116℃2℃，滅菌30分鐘”幾乎不能計算F0值。滅菌條件的表示可以參照中國藥典2005年版二部附錄168滅菌法，121℃2℃，滅菌30分鐘”本身不能稱為終端滅菌，因“101℃2℃，滅菌30分鐘”是否規(guī)范，“101℃答：暫不說滅菌條件為“101℃

4、同品種10ml、20ml注射劑，采取相同的滅菌方式是否合適？答：同品種10ml、20ml注射劑，可以采取相同的滅菌方式，但應(yīng)進行熱穿透試驗，考察不同體積樣品的熱穿透是否有一致，同時考慮采用的滅菌方式應(yīng)能保證大體積產(chǎn)品的無菌保證水平。

5、選擇最高無菌保證水平的滅菌工藝，可能會與產(chǎn)品的質(zhì)量，如有關(guān)物質(zhì)、穩(wěn)定性等方面有沖突，如何平衡這一矛盾？另外，國外上市的是粉針劑，國內(nèi)申報時是否還需要進行滅菌工藝的選擇研究？答：實際上，在進行滅菌工藝選擇研究過程中就應(yīng)該進行不同滅菌條件下樣品質(zhì)量變化的研究，選擇滅菌工藝的過程也是平衡無菌保證水平和（樣品質(zhì)量）理化指標(biāo)的過程，在產(chǎn)品有臨床需求的情況下，滅菌工藝的選擇應(yīng)以其自身能達(dá)到的最高無菌保證水平為原則。對國外上市的粉針劑，國內(nèi)申報時也應(yīng)對其采用粉針劑型進行研究，如主藥確系對熱、對水分不穩(wěn)定，則可以采用與國外相同的粉針劑；如果主藥不是對熱、對水分不穩(wěn)定，則應(yīng)根據(jù)主藥的性質(zhì)選擇無菌保證水平高的劑型。

6、最終滅菌工藝的選擇原則是首選F0≥12，而不是F0≥8；還是只要達(dá)到F0≥8即可？答：可參考?xì)W盟滅菌工藝選擇的決策樹。

7、決策樹中殘存概率法是否亦優(yōu)先選擇121℃的溫度條件？答：不一定，要根據(jù)產(chǎn)品的穩(wěn)定性確定，如果采用更高溫度和更短的時間能滿足殘存概率法時，可能比較低溫度，更長時間的滅菌條件對產(chǎn)品更有利。如果產(chǎn)品不能耐受121℃的高溫，則可以降低溫度，并保證微生物的殘存概率小于10-6。

8、對熱不穩(wěn)定藥品（如蛋白質(zhì)類、生物制品等），應(yīng)該直接進行無菌生產(chǎn)工藝的驗證。答：對熱不穩(wěn)定藥品（如蛋白質(zhì)類、生物制品等），首先應(yīng)對采用的無菌工藝進行研究，是采用除菌過濾+無菌生產(chǎn)工藝，還是采用無菌組裝工藝；然后再對無菌工藝進行驗證。

9、是否在產(chǎn)品注冊申報時就已形成本產(chǎn)品的完整的工藝規(guī)程中規(guī)定的各項參數(shù)的驗證？答：藥品注冊管理辦法規(guī)定，申請人在申報“藥品注冊申請表”后，經(jīng)藥品審評中心審評符合規(guī)定的，通知申請人向藥品認(rèn)證管理中心申請生產(chǎn)現(xiàn)場檢查，現(xiàn)場檢查目的是確認(rèn)核定生產(chǎn)工藝的可行性，同時抽取1批樣品，并規(guī)定樣品的生產(chǎn)應(yīng)當(dāng)符合GMP要求。由此可見，申報產(chǎn)品注冊時，應(yīng)對用于正式上市產(chǎn)品生產(chǎn)的工藝有了足夠的認(rèn)識。這種認(rèn)識是建立在產(chǎn)品和工藝開發(fā)，擴產(chǎn)、設(shè)備和系統(tǒng)的驗證以及驗證批的生產(chǎn)整個過程上的。驗證批的目的是要證明在規(guī)定的工藝參數(shù)的范圍內(nèi)，工藝過程能始終生產(chǎn)出合格的產(chǎn)品來。因此，在進行驗證批生產(chǎn)前，應(yīng)已充分了解并能控制工藝中各種關(guān)鍵的可變因素。

10、在進行滅菌工藝驗證時，一般會放置一個校驗的探頭在滅菌柜控制探頭旁邊，這兩者之間的溫度差異有什么要求？是否應(yīng)按校樣標(biāo)準(zhǔn)，只允許±0.5℃的偏差？

答：一般來說:

a：滅菌器自帶的獨立的記錄探頭與監(jiān)控探頭就應(yīng)完成足夠的驗證數(shù)據(jù)，然后對存在的偏差作修正；

b：驗證所用的測溫探頭的精度應(yīng)優(yōu)于滅菌器自帶的記錄探頭和監(jiān)控探頭；

c：驗證本身的作用之一是對滅菌器自帶的監(jiān)控探頭和記錄探頭進行修正，以便正常使用時達(dá)到較為準(zhǔn)確的溫度值。

目前沒有找到“只允許±0.5℃的偏差”的說法。11、在同一條大容量注射劑生產(chǎn)線上，如果有一臺滅菌柜，需要進行多個規(guī)格產(chǎn)品（如250ml,100ml）以及不同滅菌參數(shù)產(chǎn)品（比如滅菌溫度和時間不同）的滅菌，那么在進行驗證和再驗證的過程中，如何進行熱分布以及熱穿透的驗證設(shè)計？是否各種規(guī)格、各種滅菌條件均需分別進行驗證？答：一般來說，各種規(guī)格、各種滅菌條件均需分別進行驗證。不同規(guī)格混合裝載的滅菌，除非能夠確認(rèn)很多的相關(guān)內(nèi)容，否則不推薦應(yīng)用。

12、在對濕熱滅菌器進行驗證或再驗證過程中，進行熱分布、熱穿透的驗證時，如果柜內(nèi)設(shè)置12個或16個熱電偶進行溫度測試時，找到的冷點在3次驗證中可能不同，如果出現(xiàn)這種情況該如何處理？答：一般來說，空載熱分布的冷點應(yīng)該是在確定的位置周圍，否則就可能是設(shè)備、壓力、空氣置換不完全、蒸汽質(zhì)量等原因引起。

對于裝載熱穿透，大容量注射劑（LVP，>100ml）冷點位于產(chǎn)品的幾何中心和沿縱軸位于產(chǎn)品的底部，但需要驗證確認(rèn)。冷點的定位在小容量注射劑中并不典型，因為溶液加熱的速率幾乎與滅菌器相同。

還有，容器的方向也會影響冷點的位置，當(dāng)容器旋轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn)時，可能不存在可辨別的冷點。

如果裝載不變，容量相同，蒸汽穿透不存在阻隔等，冷點仍然無法重現(xiàn)，則應(yīng)檢查設(shè)備、工藝、壓力、蒸汽質(zhì)量等方面可能存在的不確定性。

13、滿載熱分布和空載熱分布對于滅菌效果上體現(xiàn)出的意義有何不同？答：兩項試驗都是測量滅菌腔室的溫度分布情況，還不反映產(chǎn)品內(nèi)的溫度和熱效益的情況，還不能直接反映產(chǎn)品的滅菌效果。但腔室情況顯然會影響產(chǎn)品內(nèi)的情況。驗證中依次進行空載熱分布、滿載熱分布、產(chǎn)品熱穿透試驗。采用這種試驗的主要目的是用盡量少的試驗次數(shù)，盡可能地揭示客觀情況。前道試驗的結(jié)果為后道試驗提供信息。

14、滿載熱分布試驗是用空瓶進行還是用裝注射用水的輸液瓶進行？答：滿載熱分布試驗是用模擬樣品進行。

15、如驗證時的裝載方式為半載或滿載，在以后生產(chǎn)中處于滿載和半載之間的是否需要驗證？答：對于處于滿載和半載之間的裝載方式，建議使用模擬產(chǎn)品填充使其達(dá)到滿載，從而確保生產(chǎn)時的裝載方式與驗證時一致。

16、熱穿透試驗怎么做？答：熱穿透試驗的目的是確定滅菌室裝載中的“最冷點”，并確認(rèn)該點在預(yù)定的滅菌程序中獲得充分的無菌保證值，即菌種殘余量≤10-6及各檢測點溫度與滅菌室內(nèi)平均溫度的差值≤2.5℃。對于可能影響滅菌效果的操作情況的變更應(yīng)做相應(yīng)的驗證，確認(rèn)操作方法。例如：當(dāng)在每個滅菌盤上增加不銹鋼蓋后，實際產(chǎn)品（溶液）內(nèi)部的升溫時間要比不加蓋時慢2分鐘，因此要在滅菌程序設(shè)定時增加2分鐘的時間。熱電偶的放置與滿載熱分布試驗規(guī)程一致，將標(biāo)準(zhǔn)熱電偶放在滅菌溶液中心部位。

17、熱穿透試驗中的模擬樣品是什么概念，是指實驗室小批量樣品嗎？答：熱穿透試驗中的模擬樣品是指熱穿透性能與真實樣品一致的樣品，不是實驗室小批量樣品。

18、微生物挑戰(zhàn)試驗的生物指示劑的種類需要根據(jù)品種選擇嗎？如何選擇？答：微生物挑戰(zhàn)試驗的生物指示劑的種類及選擇可以參考中國藥典2005年版二部附錄169滅菌法。

19、滅菌前微生物污染水平的測定方法？答：濾膜過濾法是最常用的方法。使用前應(yīng)通過驗證。

20.產(chǎn)品的微生物限度檢測結(jié)果為0CFU，沒有發(fā)現(xiàn)耐熱微生物，那么驗證過程中能否采用D值稍低的枯草芽孢桿菌作為生物指示劑進行驗證？答：1）、微生物限度的檢測結(jié)果和選擇D值稍低的枯草芽孢桿菌作為生物指示劑之間不存在因果關(guān)系。

2）、根據(jù)提問者的問題，可以認(rèn)為其采用的是殘存概率法的滅菌工藝。對于殘存概率法的滅菌工藝可以選擇生物指示劑進行殘存概率測試，僅僅是因為產(chǎn)品或包裝本身不能承受過度殺滅，從而選擇比較嚴(yán)格的過程控制，加上產(chǎn)品的初始菌數(shù)量控制，或者再加上除菌過濾工藝等等，然后選擇生物指示劑進行靈敏度測試，測出平均含菌量N0，再進行不少于4個梯度菌量、足夠批次、數(shù)量的產(chǎn)品的滅菌前后微生物限度測試（若必需，對不同滅菌時間也要進行測試），尋找并得到大于下降6個對數(shù)等級的狀態(tài)參數(shù)，在滿足F0值在8~12之間的條件下，從而推算出D值。21、請問滅菌前微生物污染水平和耐熱性（D值）的測試方法？答：微生物污染水平通常采用濾膜過濾法截留微生物，再將濾膜轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)并作微生物計數(shù)。應(yīng)注意過濾的體積、截留微生物的數(shù)量，保證足夠的檢出率（足量的過濾量）和可計數(shù)性（截留的微生物太多就沒法計數(shù)了）。

每批產(chǎn)品都進行的耐熱性測試并非D值測試，而是所謂沸騰試驗－一種定性試驗。將截留了微生物的濾膜放入裝有同種產(chǎn)品藥液的試管中，進行水浴煮沸15分鐘或更長時間，對該藥液進行無菌檢查，如陰性則通過，呈陽性，說明污染菌是耐熱菌，則需要進一步測D值。99%以上的檢品是非耐熱菌。

D值測定相當(dāng)復(fù)雜，請參考《藥品生產(chǎn)驗證指南》（藍(lán)皮書，國家藥監(jiān)局編）第三篇第三章第一節(jié)，有詳細(xì)介紹。

22、怎樣根據(jù)D值計算接種量？答：芽孢接種量的計算：

Ni＝10Do(lgNo+6)/Di

其中Ni為生物指示劑耐熱孢子接種數(shù)量

No為預(yù)定產(chǎn)品中滅菌前污染微生物的限度

Do為污染微生物允許的最大D值

Di為生物指示劑耐熱孢子在產(chǎn)品中的D值

23、對于選擇殘存概率法最終滅菌的產(chǎn)品，如果滅菌前每批檢測微生物限度，而微生物限度檢測時間為72小時，而實際連續(xù)生產(chǎn)的生產(chǎn)周期遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于72小時，其檢測結(jié)果僅是對滅菌后產(chǎn)品無菌保證水平的參考嗎？答：顯然滅菌前微生物含量檢查的結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于生產(chǎn)過程，其目的不是用于對當(dāng)批產(chǎn)品的中間控制。

該檢查的意義主要有兩項：第一，用于評價該批產(chǎn)品的無菌保證水平；第二，長期積累了多批滅菌前微生物含量的數(shù)據(jù)后，可以對生產(chǎn)系統(tǒng)在滅菌前的各工藝步驟的微生物污染狀況作整體的評估，從而指示該生產(chǎn)體系是否有效地將微生物污染控制在很好的水平，是否需要進行改進等。

24、請問微生物種類、數(shù)量研究的方法？所需的設(shè)備？如果采用殘存概率法，是否在生產(chǎn)過程中必須對微生物水平進行測定，如果引入將增加多少成本？作為大輸液生產(chǎn)企業(yè)，采用殘存概率法，是否要建立專門的微生物實驗室檢測滅菌前藥液微生物污染水平？答：微生物污染的程度－即數(shù)量的檢查可以按照藥典收載的微生物限度檢查方法進行；微生物的種類即鑒別可以從以下幾方面依次展開：1）通過肉眼觀察菌落形態(tài)；2）鏡檢形態(tài)和運動性；3）一般生化試驗：革蘭氏染色或3％KOH試驗；4）生化鑒定（即API試驗）鑒別到種。

采用殘存概率法時，應(yīng)該檢測產(chǎn)品滅菌前微生物污染水平，包括污染菌的煮沸試驗（如100℃，15分鐘）和微生物計數(shù)。

注射劑生產(chǎn)企業(yè)，微生物實驗室是必不可少的，其基本功能應(yīng)包括原輔料的微生物限度檢查，產(chǎn)品滅菌前微生物污染量檢查，產(chǎn)品無菌檢查，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，生產(chǎn)環(huán)境動態(tài)檢查（空氣微粒、浮游菌和沉降菌計數(shù)）。有條件的實驗室還可開展以下工作：微生物的鑒別試驗（建議企業(yè)集團的中心實驗室開展API鑒定），生物指示劑的標(biāo)定（即D值測定，建議企業(yè)集團中心實驗室開展該項工作）。

25.對于過度殺滅法是否需要進行滅菌工藝驗證？殘存概率法的產(chǎn)品研發(fā)工藝研究與實際生產(chǎn)中驗證有何區(qū)別？答：當(dāng)然需要驗證，歐盟CGMP附錄第83條:所有的滅菌工藝都應(yīng)驗證。

殘存概率法是滅菌工藝的設(shè)計，本身就需要驗證確認(rèn)。

26、過度殺滅法是否確定不需進行微生物挑戰(zhàn)試驗？答：過度殺滅法的內(nèi)涵是產(chǎn)品中的微生物下降12個對數(shù)，微生物挑戰(zhàn)試驗是證明微生物的殘存概率不大于10-6，故過度殺滅法可以不進行微生物挑戰(zhàn)試驗。

27、最終滅菌產(chǎn)品是否每個申請注冊的品種都要單獨進行設(shè)備驗證？是否可以只進行一次設(shè)備驗證，其它品種可以通用？設(shè)備驗證資料是否可不附在品種驗證資料中，只作為存檔備查？答：最終滅菌產(chǎn)品不一定每個申請注冊的品種都要單獨進行設(shè)備驗證，如果注冊品種采用相同的或更低的滅菌條件，可以只進行較高溫度滅菌條件下的設(shè)備驗證；針對品種滅菌條件的設(shè)備驗證資料也應(yīng)附在品種的驗證資料中。

28、非溶液劑型、半固體或粉針劑的滅菌工藝可以計算出類似于F0值的數(shù)值嗎？可以計算出SAL嗎？具體規(guī)定是多少？

答：非溶液劑型、半固體或粉針劑的滅菌工藝不可以計算出F0值，但可以計算出SAL，具體可參考?xì)W盟滅菌工藝選擇的決策樹。

29、關(guān)于培養(yǎng)基灌裝試驗，是針對生產(chǎn)線驗證的，還是針對申報產(chǎn)品進行的（每個產(chǎn)品都要灌裝三批驗證），請問：（1）生產(chǎn)線驗證能否代替申報產(chǎn)品的灌裝試驗（同類品種）？（2）采用何種培養(yǎng)基，硫乙醇酸鹽和改良馬丁兩種培養(yǎng)基都要嗎？（3）GMP檢查中不同包裝規(guī)格是否都需要進行三批次的灌裝試驗？答：（1）培養(yǎng)基模擬灌裝試驗應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品、包裝規(guī)格、包裝形式的不同而分別進行。例如，如果產(chǎn)品是粉針劑，則培養(yǎng)基模擬灌裝試驗通常會先灌裝液體培養(yǎng)基，然后再灌裝模擬產(chǎn)品的無菌粉末（如PEG無菌粉）；如果無菌注射液或凍干粉針劑，則只需灌裝液體培養(yǎng)基即可；如果包裝的規(guī)格有2ml、5ml、10ml幾種，則即便是同一種產(chǎn)品也需要分別進行各自規(guī)格的培養(yǎng)基模擬灌裝試驗；如果包裝的形式有西林瓶或者其他形式（如預(yù)充式注射器、安瓿），因采用不同生產(chǎn)線需要分別進行培養(yǎng)基模擬灌裝試驗。

在具體工作中，考慮到培養(yǎng)基模擬灌裝試驗實際上是對整個生產(chǎn)線的系統(tǒng)驗證，包括生產(chǎn)設(shè)備、環(huán)境和人員操作等，所以，如果進行培養(yǎng)基模擬灌裝試驗采用最差條件，即瓶子最大，灌裝速度最慢，人員最多，時間長于正常生產(chǎn)的時間等，則也可以不必進行每個產(chǎn)品、每個規(guī)格的培養(yǎng)基模擬灌裝試驗；如果不是最差條件，則應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品、包裝規(guī)格、包裝形式的不同分別進行。

（2）一般采用廣譜的培養(yǎng)基，能促進革蘭氏陽性、陰性、酵母菌和霉菌的生長，如大豆胰蛋白胨培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)基只在特殊情況下使用。

（3）只有在首次驗證時，每種規(guī)格需要連續(xù)成功進行3次培養(yǎng)基模擬灌裝試驗，以后每年進行2次，每次進行1批次培養(yǎng)基模擬灌裝試驗即可。30、培養(yǎng)基灌裝試驗中，培養(yǎng)基滅菌后、灌裝前，再經(jīng)濾膜除菌過濾，以觀察濾器在消毒安裝過程中的無菌效果，是否可行？答：培養(yǎng)基灌裝試驗是對包括無菌過濾在內(nèi)的所有步驟的無菌性保證程度的考察，推薦配制培養(yǎng)基后直接用于無菌過濾及隨后的灌裝過程，實際操作中要注意防止不溶性顆粒堵塞濾器。

31、培養(yǎng)基灌裝試驗?zāi)甓仍衮炞C每年兩次，每次幾批？答：對于某個產(chǎn)品的年度再驗證，通常的做法是每年進行兩次培養(yǎng)基灌裝試驗，每次一批。

32、中國藥典2005年版無菌培養(yǎng)時間已變?yōu)?4天，培養(yǎng)基模擬灌裝后在兩個溫度的培養(yǎng)試驗是否也需延長？

答：總培養(yǎng)時間不得少于14天，可以分成兩個溫度（22.5度和32.5度）各培養(yǎng)至少7天，也可以一個溫度（22.5度）直接培養(yǎng)。

33、培養(yǎng)基灌裝試驗合格標(biāo)準(zhǔn)置信限為95%，染菌概率0.1%，請具體解釋一下使用哪個統(tǒng)計方法，如何計算查表得出。答：有關(guān)計算公式的詳細(xì)說明，可參照國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品安全監(jiān)管司和藥品認(rèn)證管理中心組織編寫的《藥品生產(chǎn)驗證指南（2003）》（化學(xué)工業(yè)出版社）一書第258頁。

有兩種計算方法。一種是采用泊松分布的近似值計算公式，即

P（X>0）=1－e-Np>0.95

其中，P為置信限，N為模擬分裝瓶數(shù)或批量，p＝0.1％（污染概率）

另一種計算方法是更為精確的二項式計算公式，即

P(X>0)=1－（1－X）N

其中，P為置信限，N為模擬分裝瓶數(shù)或批量，X=0.1％（污染概率）

在書中的第259頁，列有“可信限為95%時一次模擬分裝中模擬分裝量、污染數(shù)量與污染概率關(guān)系表”，可從該表查出模擬分裝數(shù)量與污染數(shù)量的對應(yīng)數(shù)值。

34、在講義72頁第59張片子中提到粉針劑、凍干粉針、小容量注射劑工藝驗證的異同點中培養(yǎng)基灌裝程序的差異主要是指什么，具體怎樣做，起始點是哪里，從哪里開始到哪里結(jié)束？答：對于無菌粉針劑，培養(yǎng)基灌裝的形式有一些特殊性，如要準(zhǔn)備模擬的無菌粉末，分裝后用注射器將液體培養(yǎng)基加入瓶中；或?qū)o菌培養(yǎng)基粉末分裝，結(jié)束后用注射器加入無菌注射用水。但目的仍是考察整個無菌分裝過程的無菌保證程度。

35、如何進行容器密封性驗證？答：容器密封性驗證常采用物理和微生物學(xué)檢測手段。物理檢測有許多優(yōu)點，如靈敏度較高、使用方便、檢測迅速及低成本等。在產(chǎn)品有效期內(nèi)，均可使用物理檢測方法來確定包裝完整性是否符合規(guī)定要求。進行包裝完整性檢測的一個重要原因是確保無菌產(chǎn)品始終保持無菌狀態(tài)。因此，在產(chǎn)品包裝的研發(fā)階段，應(yīng)考慮采用微生物侵入試驗，或采用經(jīng)驗證過的并且比微生物檢測更為有效的物理試驗方法，來檢測產(chǎn)品包裝的完整性。但是，對效期內(nèi)產(chǎn)品的穩(wěn)定性試驗來說，因進行微生物侵入試驗較為困難，故建議采用物理檢測方法。微生物侵入試驗是對最終滅菌容器／密封系統(tǒng)完好性的挑戰(zhàn)性試驗。在驗證試驗中，取輸液瓶或西林瓶(小瓶)，灌裝入培養(yǎng)基，在正常生產(chǎn)線上壓塞、壓蓋滅菌。然后，將容器密封面浸入高濃度運動性菌液中，取出、培養(yǎng)并檢查是否有微生物侵入，確認(rèn)容器密封系統(tǒng)的完好性。同時，需作陽性對照試驗，確認(rèn)培養(yǎng)基的促菌生長能力。

36、在采用微生物浸泡法進行容器密封性驗證時，為什么要事先去除鋁蓋，請問除去鋁蓋后，是不是只剩膠塞，那么在試驗過程中會不會發(fā)生藥液泄露而影響驗證結(jié)果？答：去除鋁蓋是為了造成一個更為嚴(yán)格的條件，講課中以凍干粉針劑為例，通常容器內(nèi)有較高的真空，不會造成漏液，試驗者可根據(jù)自己產(chǎn)品的特點判斷去除鋁蓋是否適用。

37、密封性驗證中，如鋁桶的驗證，用培養(yǎng)基驗證無法觀察結(jié)果，是否有其他方法？

答：對于無菌原料的容器，建議嘗試物理的方法，如鹽水滲入法。

38、密封性驗證一般每次取樣量是多少，再驗證的周期是多少？答：可以從壓蓋線上從開始、中間、結(jié)束各取至少10瓶進行試驗，起始驗證應(yīng)考察有效期內(nèi)不同時間的密閉性，再驗證一般一年可進行一次。

39、驗證指南中對大輸液產(chǎn)品的密封性驗證有相關(guān)的要求，但對分裝及凍干產(chǎn)品無要求，是否不需進行密封性驗證？答：對大容量注射劑、小容量注射劑、粉針劑均應(yīng)進行容器密封性驗證。

40、容器密封性測試是否在安瓿、西林瓶等所有注射劑型中都必須完成？答：容器密封性測試在安瓿、西林瓶等所有注射劑型中都必須進行。但采用的方法不盡相同，安瓿一般采用物理測試方法，西林瓶則采用物理和微生物學(xué)檢測方法。40、容器密封性測試是否在安瓿、西林瓶等所有注射劑型中都必須完成？

答：容器密封性測試在安瓿、西林瓶等所有注射劑型中都必須進行。但采用的方法不盡相同，安瓿一般采用物理測試方法，西林瓶則采用物理和微生物學(xué)檢測方法。

41.無菌過濾驗證目前國內(nèi)廠家能夠做到什么水平？哪種水平是國家認(rèn)可的？答：根據(jù)國家局藥品注冊司于2023年1月10日發(fā)布執(zhí)行的《化學(xué)藥品注射劑基本技術(shù)要求（試行）》（二）制備工藝第4點有關(guān)凍干粉針劑的要求，除菌過濾系統(tǒng)適應(yīng)性驗證試驗包括過濾系統(tǒng)相容性測試、過濾前后過濾膜完整性測試、必要時尚需要進行濾膜的微生物截留量測試。

關(guān)于滅菌工藝驗證工作目前正處于推進過程中，以上是基于目前的認(rèn)識所提出的階段性的要求，還將隨著對此問題的認(rèn)知而不斷完善。

42、對于濾膜的微生物挑戰(zhàn)試驗是否需對每一種特定產(chǎn)品進行？這部分試驗既然交由生產(chǎn)商進行，對生產(chǎn)商資質(zhì)是否有要求？即，如何判定供應(yīng)商提供給我的檢測報告是有效的？

答：如果不同產(chǎn)品對于過濾器的通透性影響是不同的，從而導(dǎo)致截留效率的不同，應(yīng)該對分別進行微生物挑戰(zhàn)試驗，反之則不需要。

目前，沒有對過濾器生產(chǎn)商的資質(zhì)有法定要求，建議選擇已通過行業(yè)認(rèn)證的，其產(chǎn)品在國際國內(nèi)廣泛應(yīng)用，質(zhì)量有保證，信用度較高的生產(chǎn)商。所選擇的過濾器供應(yīng)商是否可信是基于藥品生產(chǎn)企業(yè)對于自己所要生產(chǎn)的產(chǎn)品的了解以及對于過濾工藝的了解。過濾器生產(chǎn)商是否法定資質(zhì)并不是最重要的，最重要的是藥品生產(chǎn)企業(yè)是否清楚自己選擇的過濾器適用于所生產(chǎn)的產(chǎn)品，過濾器的材質(zhì)是否符合安全性的要求，符合制藥的要求，藥品生產(chǎn)企業(yè)是否清楚自己研發(fā)的過濾工藝是否有效。也就是說，只有自己真正理解了過濾的專業(yè)知識，了解產(chǎn)品和工藝，才能判定供應(yīng)商檢測報告的有效性。

此外，還可以到過濾器供應(yīng)商那里親眼看看檢測過程，對供應(yīng)商進行質(zhì)量審計，這也有助于增強判斷的準(zhǔn)確性。

43、除菌過濾使用二個濾芯串聯(lián)，是否孔徑一致？如對主藥成分有影響，如何解決？

答：串聯(lián)的兩個除菌過濾器，其濾膜孔徑應(yīng)一致，如果串聯(lián)的兩個除菌過濾濾芯是不同生產(chǎn)批號的，就更好。

如果濾膜對主要成分有影響，應(yīng)根據(jù)過濾系統(tǒng)相容性測試的結(jié)果選用其他材質(zhì)的濾膜，使其對主藥成分沒有影響。

44、請具體介紹一下過濾器完整性試驗的測試方法，如“擴散流試驗”。答：過濾器完整性試驗的測試方法應(yīng)參照供應(yīng)商說明書提供的方法。如果采用擴散流方法，請根據(jù)供應(yīng)商說明書使用指定的介質(zhì)潤濕過濾器，再與擴散流法的專用儀器、壓力氣體（壓縮空氣或氮氣）相連接，向過濾器提供供應(yīng)商說明書確定的壓力，專用儀器會自動打印出測試結(jié)果，表明試驗通過還是不通過。

45、過濾器驗證哪些是生產(chǎn)企業(yè)必須進行的？哪些是供應(yīng)商提供的？

有的老師在講課中提到“微生物挑戰(zhàn)性試驗由供應(yīng)商做，以避免污染產(chǎn)品”，有的老師在講課中提到無菌過濾器微生物挑戰(zhàn)試驗，應(yīng)該在實際的生產(chǎn)參數(shù)下進行驗證，且微生物截留試驗必須在藥液中進行，這似乎只能由藥品生產(chǎn)企業(yè)完成。如何理解？如何進行此項試驗更能保證驗證的科學(xué)價值？答：兩者并不矛盾。過濾器生產(chǎn)廠家都應(yīng)有自己的實驗室，如Pall和Millipore，可以利用藥品生產(chǎn)企業(yè)提供的藥液，選擇合適的過濾器并確定實際生產(chǎn)中的過濾參數(shù)，并在這些參數(shù)范圍內(nèi)進行微生物挑戰(zhàn)試驗。

46、過濾器使用前后起泡點測試中，使用以后是用注射用水沖洗后測試好，還是直接測試好？

答：起泡點試驗需要保持過濾器的充分潤濕，在過濾器選擇和驗證時就應(yīng)確定潤濕的介質(zhì)）

47、起泡點試驗與前向流試驗，在過濾器的完整性試驗中，是只需選擇一種，還是必須兩種都作？答：選擇一種即可，但應(yīng)根據(jù)過濾器驗證中確定的完整性試驗的測試條件和標(biāo)準(zhǔn)進行）

48、如何補救吐溫使濾膜孔徑變大，以保證藥品的安全性？

答：企業(yè)應(yīng)將產(chǎn)品的成分和特性等資料提供給過濾器生產(chǎn)廠家，過濾器廠家根據(jù)產(chǎn)品特性選擇合適的過濾材質(zhì)并進行無菌過濾驗證）

49、無菌藥品應(yīng)如何監(jiān)控中間產(chǎn)品的微生物和細(xì)菌內(nèi)毒素污染情況？非最終滅菌？最終滅菌？通常微生物檢測需要4－5天，而中間產(chǎn)品須當(dāng)天完成才能決定是否可以進入下道工序。

答：在無菌藥品生產(chǎn)過程中，不管是非最終滅菌還是最終滅菌工藝，盡管中間產(chǎn)品的微生物檢測需要幾天的時間，但是通常不用等微生物檢測的結(jié)果，可直接進行下一步工序的生產(chǎn)。等中間產(chǎn)品的微生物檢驗結(jié)果出來后，可以根據(jù)檢測結(jié)果采取相應(yīng)的措施，如中間產(chǎn)品的檢驗結(jié)果合格，則產(chǎn)品可以繼續(xù)生產(chǎn)直至最終方行，如中間產(chǎn)品的檢驗結(jié)果不合格，則產(chǎn)品不能放行。

50、生產(chǎn)環(huán)境的控制：（1）在生產(chǎn)過程中，無菌灌裝線上沉降碟的放置是否應(yīng)在所用操作開始前完成？（2）沉降碟需要暴露多長時間？（3）在講義60頁提到的無菌灌裝區(qū)生產(chǎn)環(huán)境監(jiān)控頻率中測試項目“表面微生物”是指哪種檢測項目，其內(nèi)容和標(biāo)準(zhǔn)是什么，監(jiān)測頻率是否是每批一次呢？（4）動態(tài)沉降菌檢測中，等結(jié)果出來已經(jīng)是2-3天后了，如何根據(jù)結(jié)果進行判斷？（5）壓縮空氣的微生物檢測如何很好的進行？答：（1）是，這樣可以監(jiān)測整個操作過程。（2）歐盟、FDA的要求是不超過4小時，目前我國的要求為30分鐘，在新GMP修訂時可能會考慮采用國際通行要求。（3）表面微生物測試是考察如墻面、地面、操作臺面、設(shè)備等表面的微生物狀態(tài)，一般采用接觸碟或棉拭子的方法，相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)請參照歐盟GMP附錄1和FDA有關(guān)無菌生產(chǎn)工藝的指南。（4）由于微生物培養(yǎng)的特點，批生產(chǎn)時進行的環(huán)境微生物監(jiān)測的結(jié)果至少需要等待2-3天的時間，一旦發(fā)生超標(biāo)，需要進行全面的分析和調(diào)查，以找出造成偏差的原因，并評估對產(chǎn)品的污染風(fēng)險。（5）由于壓縮氣體有壓力，一般的空氣浮游菌采樣儀較難直接測定，需要先進行減壓，現(xiàn)已有商品化的壓縮氣體浮游菌采樣儀。51、請問如何建立警戒限或糾偏限？有無相關(guān)的計算公式或技術(shù)要求？答：應(yīng)根據(jù)歷史的數(shù)據(jù)，結(jié)合不同潔凈區(qū)域的標(biāo)準(zhǔn)制訂。如采用數(shù)理統(tǒng)計的方法，一般可以將平均值加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差作為警戒限度，加上3倍的標(biāo)準(zhǔn)差作為行動限度，限度設(shè)定以后，應(yīng)定期回顧評價，如每年一次。

52、無菌檢查不合格時，如有真菌不合格的情況，可能有哪些原因？最有可能的原因是什么？答：無菌檢查出現(xiàn)不合格時，應(yīng)首先進行無菌試驗過程的調(diào)查，考慮的因素可包括培養(yǎng)基、試驗器材、試驗環(huán)境、人員操作等，并結(jié)合當(dāng)批產(chǎn)品生產(chǎn)的環(huán)境監(jiān)測結(jié)果作出綜合的分析判斷。

53、如何進行藥液儲存周期驗證，儲存周期起點、終點如何確定，使配制完成后→滅菌前，還是過濾后→滅菌前，取樣點如何設(shè)置，檢驗方法及合格判定標(biāo)準(zhǔn)如何確定？答：進行藥液儲存時間驗證的目的是為了確保藥液的微生物水平控制在下道工藝要求范圍內(nèi)并確保對產(chǎn)品的無菌性和內(nèi)毒素等質(zhì)量指標(biāo)無不良影響。一般來講，配液完成后到無菌過濾前，或過濾完成后到滅菌前（終端滅菌產(chǎn)品）是考察的重點，方法和標(biāo)準(zhǔn)需要根據(jù)自己產(chǎn)品的工藝特點確定。

54、軋蓋條件是萬級制藥下的局部保護，這局部保護如何理解？凍干轉(zhuǎn)運是萬級下的局百，是指在凍干過程中嗎？

答：局部保護就是在軋蓋機的正上方有高效空氣過濾器，提供單向流保護，這里所說的萬級實際是歐盟無菌藥品附錄中的C級。

參照98版GMP無菌藥品附錄的要求，凍干轉(zhuǎn)運應(yīng)該是在萬級背景下百級環(huán)境中進行的，這通常發(fā)生在凍干開始前將已灌裝的半加塞產(chǎn)品送入凍干機的冷凍干燥腔室內(nèi)，或者是凍干結(jié)束后將已凍干的產(chǎn)品從凍干機的冷凍干燥腔室內(nèi)取出送去軋蓋，尤其是前者應(yīng)對產(chǎn)品予以特別的保護，這樣才不至于污染未密封的產(chǎn)品。

55、凍干機的濕熱滅菌怎么進行？臭氧或甲醛熏蒸不行嗎？

答：如果凍干機帶有在線滅菌系統(tǒng)的，就可以在每次凍干結(jié)束后對冷凍干燥腔室進行濕熱滅菌。如果采用臭氧或甲醛熏蒸，應(yīng)證明這兩種方法能達(dá)到滅菌的要求，而且其殘留量不會對產(chǎn)品質(zhì)量有不利影響，也不會影響到產(chǎn)品的安全性。此外，采用臭氧有可能加速設(shè)備的老化，而采用甲醛熏蒸時，應(yīng)考慮甲醛的殘留以及對人體健康的影響。

56.凍干產(chǎn)品批號以凍干機來確定（98版），如一次配料共兩臺凍干機冷凍，批號如何確定？答：根據(jù)98版GMP“無菌藥品”附錄第5條第（3）款的要求，“凍干粉針劑以同一批藥液使用同一臺凍干設(shè)備在同一生產(chǎn)周期內(nèi)生產(chǎn)的均質(zhì)產(chǎn)品為一批”，一次配料共兩臺凍干機冷凍時，應(yīng)對每臺凍干機凍干的產(chǎn)品分別設(shè)定各自的生產(chǎn)批號。

57、能否詳細(xì)介紹一下充氮的效果，如何進行評價？含氧量的測定是在線的還是事后QC測定？所用方法與檢測設(shè)備？

答：充氮能顯著地抑制以氧氣為底物的氧化反應(yīng)，效果取決于反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)氧氣的含量。含氧量測定有專門的儀器分別用于測定空氣中和溶液中的氧，均有在線和離線（實驗室）測定設(shè)備。比較著名的儀器有：瑞士OrbisphereLaboratories公司的溶解氧儀；丹麥PBI－Dansensor公司的氣體氧儀。都有多種精度的在線和離線的型號。

58、請問，可靠的除熱原方法有哪些？一般情況下，采用哪種除熱原方法較好？

答：活性炭吸附、超濾等方法都對除熱源有效果。效果取決于實際條件和產(chǎn)品特性，應(yīng)通過試驗比較、確定。

59、對空間滅菌采用新潔爾滅溶液噴灑、紫外燈照射過夜的方式，該滅菌方法有隱患嗎（與環(huán)氧乙烷消毒比較）？答：新潔爾滅對空間消毒是無效的，而且殘留固體微粒，并不可取。生產(chǎn)空間也不能用環(huán)氧乙烷消毒。可靠的消毒方法是甲醛（福爾馬林）熏蒸或臭氧消毒。兩種方法的效果取決于空氣中活性成分的濃度和存留的時間。

60、一品種已上市多年，未采用終端滅菌工藝，再注冊時是否需提供滅菌工藝驗證資料，若考察后可以終端滅菌，是否需更改工藝？答：對未采用終端滅菌工藝的已上市品種，其可以采用終端滅菌工藝，則應(yīng)進行變更工藝的補充申請，提供相應(yīng)的研究和驗證資料。具體可參照二○○七年八月十日國食藥監(jiān)辦[2007]504號“關(guān)于開展注射劑類藥品生產(chǎn)工藝和處方核查工作的通知”的要求。61、大輸液產(chǎn)品現(xiàn)采用殘存概率法，以后是否要提高到過度殺滅法？殘存概率法是否每批樣品都要對滅菌前藥液進行微生物檢查，并制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)進行相應(yīng)的驗證？答：大輸液產(chǎn)品采用殘存概率法，是否要提高到過度殺滅法，主要還是根據(jù)主藥的性質(zhì)和企業(yè)付出的生產(chǎn)成本，如果大輸液產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，可以耐受過度殺滅的滅菌條件，最好還是提高到過度殺滅法，這樣既不影響產(chǎn)品的質(zhì)量，同時又降低了生產(chǎn)成本；因為殘存概率法要對每批樣品滅菌前藥液進行微生物監(jiān)測及控制。

62、現(xiàn)有的大部分小容量注射劑的滅菌工藝的F0值均不能達(dá)到8，對此中心有何措施或規(guī)定？答：國食藥監(jiān)[2023]7號文附件1：化學(xué)藥品注射劑基本技術(shù)要求（試行），對F0值不能達(dá)到8的小容量注射劑提出了相應(yīng)的技術(shù)要求，可參照執(zhí)行。

63、原申報的工藝為大盤凍干或溶媒結(jié)晶后再無菌分裝，現(xiàn)改成凍干（瓶凍）工藝，應(yīng)該講無菌保證水平有提高，現(xiàn)在CDE對這類工藝變更的審評要求？答：首先應(yīng)該按照《藥品注冊管理辦法》附件4要求，進行工藝變更的補充申請，同時參照《上市后化學(xué)藥品變更研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》進行工藝變更的研究和驗證，提交相應(yīng)的研究資料。CDE對這類工藝變更的審評與其他變更申請的技術(shù)要求一致，任何變更應(yīng)對產(chǎn)品的安全性、有效性、質(zhì)量不產(chǎn)生負(fù)面的影響，對無菌產(chǎn)品還應(yīng)關(guān)注無菌保證水平不能降低。

64、在遵