狂犬病及狂犬病診斷

狂犬病及狂犬病診斷第一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一一、狂犬病毒病原學二、狂犬病疫苗、抗體的應用三、狂犬病抗原抗體的診斷第二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一狂犬病:現(xiàn)狀我國狂犬病近年來發(fā)病人數(shù)逐年遞增，據(jù)統(tǒng)計我國2003年狂犬病病死人數(shù)達2037人，是10年來最高峰，截至今年12月，全國狂犬病死亡人數(shù)已超過3000人。第三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一中國狂犬病死亡數(shù)連續(xù)6年明顯回升第四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一人群中特別是少年兒童易受寵物的攻擊，且頭面部咬傷居多，0－19歲者占發(fā)病人數(shù)的40％。第五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一狂犬病患者中典型三恐（恐風、恐水、恐光）病癥占60％。另有40%為不典型癥狀。第六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一狂犬病的傳染源

第七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一甲醛、乙醚、升汞、過氧化氫、高錳酸鉀和季胺類化合物（如本扎溴銨）等化學藥品對狂犬病毒都有殺傷作用。1%甲醛或3%來蘇爾15分鐘可使病毒滅活。20%乙醚、10%氯仿、75%酒精、5%碘酊和0.1%胰蛋白酶等也可使病毒滅活。

第八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一狂犬病毒理化特性狂犬病毒對溫度的抵抗力很弱，在高溫下很不穩(wěn)定。病毒懸液56。C，30分鐘或60。C，10分鐘即可滅活。煮沸2分鐘，病毒全部死亡。但是保留在機體組織內的病毒加溫滅活的時間要延長些。含有狂犬病毒的腦組織在常溫下可保存活力7-10天，在日光和紫外線照射下，或強酸、強堿的環(huán)境下，病毒滅活的時間會縮短?？袢《驹赑h7.4-8.0較為穩(wěn)定，若pH超過7-9的范圍，則病毒易滅活。第九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一第十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一狂犬病毒的感染特點

狂犬病毒一般是通過破損的皮膚或黏膜進入人體的?？袢《驹隗w內典型的感染過程是由唾液中帶有狂犬病毒的瘋動物咬傷，使病毒從傷口侵入機體內。在侵入部位一般不增生，也不侵入血液，故無病毒血癥?？袢《緩那秩刖植窟M入周圍神經組織內，沿著神經向心傳遞至中樞神經系統(tǒng)。病毒運行、擴散過程的長短與潛伏期有關，一般為20-60天或更長或更短，這與病毒侵入部位和數(shù)量有關，在此過程中，若對機體進行疫苗接種，提高機體的抗感染能力，則可預防發(fā)病。第十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一

一旦狂犬病毒進入中樞神經，侵犯腦和脊髓的神經細胞，并大量增生，則引起神經細胞功能紊亂和退行性病變，機體開始出現(xiàn)癥狀，一旦發(fā)病，目前尚無法醫(yī)治，病死率為100％。狂犬病毒在腦神經細胞中大量增生后，通過傳出神經離心性地向外擴散到周圍神經及其所支配的組織中，從而引起廣泛的非神經組織的感染，常累積于唾液腺，病毒大量增生而由唾液腺排除體外，一般出現(xiàn)典型的狂犬病癥狀后一周內死亡。第十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一30－40％的狂犬病患者病程晚期腦部大量增生的狂犬病毒突破血腦屏障進入血液，誘導產生極高水平的狂犬病毒抗體，一般高出疫苗誘導抗體水平的100倍，對于不典型癥狀的狂犬病病例可通過這一指標作實驗室確證。

第十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一人狂犬病潛伏期潛伏期<1010－3031－9091－365>365(天)病例數(shù)046484622619（％）029.854.414.61.2第十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一WHO推薦的暴露后治療指南分類暴露類型推薦的治療方法I觸摸或飼養(yǎng)動物舔在完整皮膚上如有可靠的病史，不必處理II輕度抓傷或擦傷但未出血舔到有破口的皮膚立即接種狂犬病疫苗②Ⅲ單一或多處穿過皮膚的咬傷或抓傷粘膜被唾液污染（如舔）立即接種狂犬病疫苗②及免疫球白第十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一狂犬病發(fā)病與抗體消長趨勢疫苗注射0天7天14天180天360天自主抗體低水平期3天28天體內自主抗體水平發(fā)病率43天103天體內被動免疫抗體水平被動免疫第十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一二、狂犬病疫苗、抗體的應用第十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一國內外抗狂犬病血清臨床使用效果

時間地點肇事動物重傷人數(shù)處理死亡人數(shù)死亡率伊朗瘋狼13疫苗＋抗血清17.7%5單用疫苗360％1981-中國瘋狼26疫苗＋抗血清0019823單用疫苗3100％17年間伊朗364疫苗＋抗血清195.3%298單用疫苗7525％-蘇聯(lián)22疫苗＋抗血清0028單用疫苗1139.3%

俞永新等《狂犬病和狂犬病疫苗》中國醫(yī)藥科技出版社2001年p190-191第十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一抗狂犬病血清使用方法WHO建議重度咬傷、多部位咬傷者尤其應盡量多用于傷口處作浸潤性注射狂犬病毒抗血清，使局部傷口處抗狂犬病毒抗體含量足夠多，用以中和傷口處肥皂無法到達部位的狂犬病毒，剩余的抗血清肌肉注射于另一上臂。人狂犬病免疫球蛋白使用量為20IU/KG體重,馬抗狂犬病血清使用劑量為40IU/KG體重。不得增多用量。只能一次注射,不應多次注射。不應提早于疫苗注射。在歐美國家暴露后無論傷口輕重程度，均聯(lián)合使用狂犬病疫苗和抗血清。應在清洗傷口后立即使用，最遲不超過7天。馬血清使用前應作過敏試驗。第十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一中國狂犬病疫苗的發(fā)展過程——————————————————————————————————

使用年代 制備來源 效力 注射次數(shù)——————————————————————————————————第一代狂犬病疫苗 羊腦組織疫苗 0.8IU/ml21（20世紀60~70年代）第二代狂犬病疫苗 地鼠腎細胞疫苗原倍疫苗1.3IU/ml 5（20世紀80~90年代） 濃縮疫苗2.5IU/ml 5

第三代狂犬病疫苗 Vero細胞純化疫苗2.5IU/ml 5（21世紀）——————————————————————————————————第二十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一0.19911CBG9908CBG9916CBG9719cCAMB02006CBGGX9912CBGGX01017VNMGX01016VNM8743THA8734THA8758cTHA8760cTHA8738THA8664cTHAI020059910LAO02002LAO02001LAOGX9914CBGGX9915BIRGX9909BIR9913BIRGX8677cMAL02042CHIGX02041CHIGX02045CHIGX02043CHIGX02044CHI02040CHIGX9811CHI02035CHI02036CHI02037CHI03003INDOFL9707CHIGX02050CHIFL94270PHI94280PHIGX94273PHIGX03007PHI03006PHI02047CHIGX02049CHIGX02046CHI9709cCHI9702INDI94257cSRI9903NEPGX9902NEP9901NEP94260cNEP020529706CHIGX8690CHIGXRCHLCVSPVaGCTN亞洲街毒分離株N基因序列進化圖中國街毒1組中國街毒3組中國街毒2組中國街毒4組第二十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一街毒3組街毒2組街毒4組街毒1組第二十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一第二十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一第二十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一第二十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一第二十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一武生旺寧的制備流程

VERO細胞＋狂犬病毒CTN株

繼續(xù)培養(yǎng)收獲培養(yǎng)上清超濾、分子篩層析純化精制并滅活分裝待檢生物學檢定及生化檢定合格后發(fā)貨第二十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一武生旺寧精制苗的純度純化后去除了95－98％的雜蛋白殘余牛血清含量<50ng/ml第二十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一狂犬病疫苗臨床反應觀察結果

————————————————————————————————產品廠家

試驗觀察

全身反應

局部反應

血清中和抗體

人數(shù)

平均效價

陽轉率————————————————————————————————武生旺寧3044.28%7.24%11.89IU/ml100%國外產品508.0%3.6%10.08IU/ml100%

國內產品5034.0%25.6%--————————————————————————————————

第二十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一狂犬病疫苗臨床反應觀察結果

第三十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一武生旺寧免疫動物街毒攻擊保護性試驗旺寧稀釋度街毒株攻擊途徑實驗小鼠數(shù)存活小鼠數(shù)存活率（％）

原倍顱內攻擊10101001:5顱內攻擊99100陰性對照顱內攻擊9111.11原倍肌肉攻擊10101001:5肌肉攻擊1010100陰性對照肌肉攻擊10110微生物學免疫學進展2000年28(1):10-11第三十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一NIH效力測定結果狂犬病疫苗品種批號效力(IU/ml)武生旺寧200402022.99NE120040102-010.82N20040205032.12E20031202.301.28NE2200403013-120.30NE320031203-40.58NE4200312340.30我國藥典規(guī)定,狂犬病疫苗NIH效力必須達到2.50IU/ml以上方為合格第三十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一武生旺寧的效力批號效力(IU/ml)批號效力(IU/ml)200202013.77200301013.21200203022.61200301023.63200205032.67200301032.94200206042.55200302042.82200209052.92200302053.10200210063.36200302062.90200210075.00200303073.23200211082.99200303082.89200211093.2120030309389200304102.95200212112.72平均值

2.74第三十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一武漢生物制品研究所承擔狂犬病疫苗中國國家標準品的制備第三十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一武漢生物制品研究所起草《中國藥典》狂犬病疫苗規(guī)程第三十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一精制馬抗狂犬血清柱層析純化示意圖引起過敏反應的血清成分具有中和活性的血清成分第三十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一三、狂犬病抗原抗體的診斷第三十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一1、狂犬病毒抗原的檢測與診斷(Diagnosticproceduresforantigendetection)狂犬病毒通常在感染的活體神經細胞中或體外感染狂犬病毒的培養(yǎng)細胞的胞漿中形成尼氏小體和病毒顆粒，而尼氏小體和病毒可以通過組織切片或以熒光素標記的特異性抗體進行免疫組化染色或其他方法進行檢測，這些方法用于實驗室診斷既精確、又快速和經濟。尼氏小體大多出現(xiàn)在海馬回、大腦皮質的錐體細胞和浦肯也氏細胞中，較少出現(xiàn)在丘腦、橋腦、髓質、脊髓和感覺神經節(jié)等神經組織中，因此在進行神經組織為標本的實驗室診斷中，其標本的選擇就顯得尤為重要。第三十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一通常采用非常簡單的手術即可暴露海馬回，打開顱骨暴露腦組織后沿大腦半球背面半球溝外測2cm處往下通過灰質和白質直到側腦室縱切3－5cm，掀開上部腦半球，即可露出光滑的形似蠶豆狀的海馬回，取出海馬回、部分小腦和腦干，分別在載玻片上印壓制成腦印片，室溫干燥后浸入丙酮30分鐘，取出晾干即可用于熒光抗體實驗。第三十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一第四十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一1.熒光抗體實驗FluorescentAntibodyTest(FAT)狂犬病毒感染的細胞內有由狂犬病毒核衣殼聚集形成的包涵體。以提純的狂犬病毒核衣殼免疫實驗動物制備的多克隆抗體，或抗核衣殼單克隆抗體與異硫氰酸熒光素偶聯(lián)后，用直接免疫熒光法可特異地與這些包涵體結合，該方法是狂犬病毒實驗室診斷最精確、快速和最可靠的方法。

第四十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一狂犬病毒抗原熒光標記抗狂犬病毒抗體免疫熒光實驗檢測狂犬病毒抗原第四十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一腦或神經組織的印片、涂片或冰凍切片經過標記有異硫氰酸熒光素的狂犬病毒抗血清或球蛋白處理后，在紫外線激發(fā)下，通過熒光顯微鏡即可檢測，狂犬病毒陽性標本中分布有大量的黃綠色熒光顆粒，呈不同的形狀和大小，較大的圓形或橢圓形發(fā)強烈熒光者為內基氏小體（Negribodies)，而象沙粒或灰塵的較細小的熒光粒子及絲狀熒光物為神經元或樹突中含有的狂犬病毒顆粒，熒光顆粒大小范圍為0.24-27m。

第四十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一第四十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一第四十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一由于狂犬病毒多分布在動物腦海馬回及腦干處，因此合適的取樣部位對抗原的檢測很重要。腦樣品印片必須用丙酮固定30分鐘，因為丙酮可去除細胞膜表面的脂類，以便抗體到達細胞內與狂犬病毒結合。待測腦樣品必須在含50%甘油的生理鹽水中0oC以下保存，印片染色前需用生理鹽水洗滌數(shù)次，印片及丙酮固定過程需要在P3實驗室中進行。第四十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一武漢生物制品研究所徐葛林等采用多種抗狂犬病毒核蛋白的單克隆抗體混合物標記熒光素，經法國巴斯德研究所多次實驗，分別檢測了人、犬、貓、狐貍、臭鼬、蝙蝠等12種動物來源的樣品，包括目前已知的狂犬病毒7個基因型在內的共計360多份樣品，與BIO-RAD同類產品相比，證實我國制備的熒光抗體具有非特異性小、靈敏度高、使用前不需用正常鼠腦吸附的特點，得到國外同行的認可。第四十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一熒光標記抗體需最大限度降低非特異性反應，因此制備特異性、高效價的抗體是FAT的關鍵。目前有關狂犬病毒FAT檢測試劑已完全國產化，1999年用該方法檢測了我國廣西狗肉市場上出售的食用狗的腦組織，結果發(fā)現(xiàn)在154份外觀健康的犬中，有5份為狂犬病毒抗原陽性，通過乳鼠顱內接種已分離到這5株狂犬病街毒株。第四十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一2.快速狂犬病酶免疫診斷法RapidRabiesEnzymeImmunodetection(RREID)

RREID可通過檢測腦組織中的狂犬病毒核衣殼來診斷狂犬病。將標本于緩沖液或組織培養(yǎng)液中研磨成30％勻漿，1500g離心5分鐘取上清，置于微量反應板中孵育（該板已用抗狂犬病毒核衣殼抗體包被），然后再用過氧化物酶標記的抗狂犬病毒核衣殼抗體來檢測被捕獲的抗原，加顯色底物進行酶促顏色反應。對于一個給定的標本，通過用肉眼觀察顏色反應或用酶標儀測光吸收值，再與陰、陽對照比較，即可得出有無狂犬病毒抗原的結論。該方法所能檢測到的基因1型狂犬病毒最小核衣殼抗原量為0.8-1.0ng/ml。第四十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一該方法由Perrin.P于1986年建立，后經歐美6個實驗室試驗，共檢測了3000多個樣品，結果表明與FAT有很好的相關性（96%），由于不需要特別的儀器和技術，該方法尤其適用于發(fā)達國家，但其靈敏度略低于FAT。武漢生物制品研究所用抗狂犬病毒核蛋白的單抗建立了用于檢測狂犬病毒抗原的雙抗體夾心ELISA法，目前經與小鼠顱內接種及FAT法相比較，檢測了近1000份動物腦組織，結果完全一致，該試劑盒對基因1型的狂犬病毒檢出靈敏度達到0.8ng/ml，對狂犬病毒7個基因型均能檢出。第五十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一快速狂犬病酶免疫診斷法抗狂犬病毒單抗狂犬病毒樣品酶標抗狂犬病毒抗體第五十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一第五十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一第五十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一檢測狂犬病毒核蛋白的雙抗體夾心法已于2004年11月份被中國藥品生物制品檢定所列為我國狂犬病疫苗鑒別診斷試劑。第五十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一技術特點及要求本方法具有靈敏度高、特異性好、操作簡單、重復性好、不需要昂貴儀器等特點，最適合于作現(xiàn)場流行病學調查。本試劑盒中酶標板包被后需立即使用或保存于-20oC備用。肉眼觀察陽性對照顯黃顏色，陰性對照完全無色。所有顯色樣品，無論深淺均認為是陽性。福爾馬林固定的樣品不適宜作RREID。使用酶標記抗體前的加樣、孵育及洗滌過程需要在P3實驗室中進行。第五十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一3.小鼠顱內接種分離狂犬病毒法（MIT）狂犬病毒是嗜神經性病毒，可采用顱內接種法分離后，再進行狂犬病特異性抗原的檢查?？刹捎眯“资蠼臃N分離，任何品種的實驗用小白鼠均可使用，一般選擇體重10-20克的健康小白鼠，雌雄不限。如用1-3日齡的乳鼠，可提高分離病毒的陽性率。第五十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一可疑動物腦組織或唾液腺組織可用于病毒的分離，一般前者病毒檢出率要高于后者，但從流行病學觀點考慮，檢查唾液腺中的病毒更顯重要。腦組織需要預先用含10－50％滅活牛血清的生理鹽水或PBS或脫脂奶研磨成10％懸液，150－200g離心5分鐘去除粗顆粒；唾液腺需切碎后再研磨，1－2層無菌紗布過濾后，顱內接種小鼠，0.03ml/只。第五十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一狂犬病毒后潛伏期至少5天，一般觀察21天，小鼠狂犬病癥狀一般為豎毛、戰(zhàn)栗（用鑷子夾尾懸空時）、后肢失調（置于桌上使其運動時）、麻痹、衰竭（瀕死前）。第五十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一MIT法的特點該方法靈敏度高，僅適于分離活的狂犬病街毒，不適于因腐爛或其他原因導致病毒滅活的樣品。僅憑動物發(fā)病癥狀不足以確定為狂犬病毒，需配合免疫熒光法作特異性鑒定。耗時較長，不適于作快速診斷用。需要在P3實驗室中操作，并需要有經驗的技術員。第五十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一4.狂犬病組織培養(yǎng)感染實驗(rabietissue-cultureinfectiontestRTCIT)

上世紀70年代中期以來，各實驗室相繼用嬰地鼠腎細胞、BHK21、雞胚細胞、成神經瘤細胞分離街毒狂犬病毒。與小鼠顱內接種法相比所需時間大大縮短，BHK21細胞培養(yǎng)法的敏感性與小鼠顱內接種法相似，而小鼠成神經瘤N2a細胞分離街毒比BHK21細胞更為敏感。

第六十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一狂犬病毒抗原的檢測與診斷30%腦懸液樣品，5000rmp，5minN2a細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h后固定，加熒光標記的抗狂犬病毒核蛋白抗體細胞無熒光，表明樣品中不含狂犬病毒細胞有熒光，表明樣品中含有狂犬病毒第六十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一與MIT相比，RTCIT法操作簡便、成本低、耗時短，靈敏度與MIT相同，適于快速診斷。由于狂犬病毒對感染細胞不形成空斑，因此通過普通顯微鏡無法觀察到細胞病變，借助于熒光素標記的抗狂犬病毒核蛋白即可檢查出感染的細胞。第六十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一動物腦組織用含抗生素及10％滅活牛血清的EMEM培養(yǎng)液研磨成0％（w/v）懸液后2000g離心30分鐘，取上清0.1ml加入0.1ml的N2a細胞懸液（5105細胞/ml）于96孔微量細胞培養(yǎng)板孔中，37C5％CO2孵箱中培養(yǎng)24小時，甩出培養(yǎng)液，板孔用80％冷丙酮室溫固定30分鐘，甩干，晾干后加入熒光素標記的抗狂犬病毒核蛋白的抗體，37C孵育45分鐘,PBS洗滌即可通過熒光顯微鏡觀察。胞漿中有黃綠色熒光顆粒的為狂犬病毒陽性，無熒光顆粒者為狂犬病毒陰性。第六十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一狂犬病毒抗原的檢測與診斷診斷技術免疫熒光快速酶小鼠顱內細胞培養(yǎng)膠體金實驗免疫診斷接種分離技術免疫層析法所需時間2-3h3-4h5-10d20-24h5-10min特異性99.99%99.96%ND99.99%ND敏感性99.99%98.06%ND98.21%ND

第六十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一二狂犬病毒抗體的檢測（Testsforthedeterminationofrabiesantibody）

滴定抗狂犬病抗體是為了測定接種對象在暴露后治療末期或暴露前免疫的抗體水平。WHO狂犬病專家委員會認為大于或等于0.5國際單位（IU）/ml的抗體水平才具有足夠的保護性，如果滴度低于0.5IU/ml，必須給予加強劑量，直到抗體達到要求的水平。也可在血庫中進行抗體滴定以篩選來自免疫供體的血漿樣品，用以制備治療用人狂犬病免疫球蛋白（HRIG）。特異狂犬病抗體的檢測也有利于不明原因病毒性腦炎病人的病原學診斷。第六十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一1973年第七屆WHO狂犬病專家委員會推薦的標準檢測方法有小鼠中和試驗（MNT）空斑減少試驗亦即隨后發(fā)展成的快速熒光灶抑制試驗（RFFIT）。RFFIT為現(xiàn)代試驗室的首選方法，其敏感度至少與MNT一致。第六十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一小鼠中和試驗

三倍系列稀釋待測血清預先滴定過的中和用狂犬病毒（設已知國際單位的標準血清對照）CVS鼠腦懸液（稀釋成30-300LD50））

等量混合37℃保溫1小時后

37℃中和1小時復滴定LD50

顱內接種10-12克小白鼠

觀察并記錄小鼠發(fā)病及死亡情況

根據(jù)試驗結果計算中和指數(shù)及中和抗體含量第六十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一特點：可定量檢測狂犬病毒中和抗體效價；需專門技術培訓，操作較繁瑣；實驗周期需14天，耗時長，不利于快速診斷；需較多試驗小鼠，成本高；動物間的個體差會影響試驗結果，我國藥典收錄的狂犬病中和抗體滴定法即用此法。

第六十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一2.快速熒光灶抑制試驗（RFFIT）：原理：將預先滴定致細胞80％感染的攻擊毒株CVS與3倍系列稀釋的待滴定血清37oC孵育1小時，試驗中設包括已知中和抗體國際單位含量的參照血清，再將血清/病毒混和液加入BSR細胞懸液。37oC5％CO2孵育24小時后，細胞單層用80％冷丙酮固定，加熒光標記的抗核衣殼抗體進行染色，檢測未被中和的病毒的存在（熒光灶），通過Reed-Muench法計算待滴定血清中狂犬病毒中和抗體單位。第六十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一快速熒光灶抑制試驗三倍系列稀釋待測血清預先滴定過的中和用狂犬病毒（設已知國際單位的標準血清對照）CVS病毒懸液（致80％細胞感染的病毒量）

等量混合37℃保溫1小時后

37℃中和1小時復滴定FFU

接種BSR細胞

CO2孵箱37℃培養(yǎng)24小時

固定并用熒光抗體染色，熒光鏡觀察，記錄每孔熒光灶數(shù)量，計算血清抗體效價第七十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一特點：可定量檢測狂犬病毒中和抗體效價；耗時較短，可用于精確定量的快速診斷；重復性好；需專門技術培訓