第四章抗體制藥演示文稿_第1頁(yè)
第四章抗體制藥演示文稿_第2頁(yè)
第四章抗體制藥演示文稿_第3頁(yè)
第四章抗體制藥演示文稿_第4頁(yè)
第四章抗體制藥演示文稿_第5頁(yè)
已閱讀5頁(yè),還剩111頁(yè)未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

第四章抗體制藥演示文稿本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第1頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分優(yōu)選第四章抗體制藥本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第2頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分第一節(jié)概述第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備第四節(jié)噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)第五節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)抗體第六節(jié)抗體治療藥物2023/6/203內(nèi)容本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第3頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分第一節(jié)概述一、基本概念抗體(antibody,Ab):指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig):具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白IgAb化學(xué)結(jié)構(gòu)上的概念生物學(xué)功能上的概念2023/6/204抗體工程制藥:利用基因工程、細(xì)胞工程和轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物技術(shù)生產(chǎn)抗體藥物的過(guò)程。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第4頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分2023/6/205本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第5頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分免疫球蛋白(抗體)的基本結(jié)構(gòu)1、重鏈和輕鏈重鏈可分為α、δ、ε、γ、μ鏈;輕鏈可分為κ、λ型。抗體的類型由重鏈類型決定,上述重鏈分別對(duì)應(yīng)了IgAIgDIgEIgGIgM2、可變區(qū)和恒定區(qū)

重鏈和輕鏈N端第一個(gè)結(jié)構(gòu)域?yàn)榭勺儏^(qū)(variableregion,V區(qū)),輕鏈其余的1個(gè)及重鏈的3-4個(gè)結(jié)構(gòu)域?yàn)楹愣▍^(qū);

V區(qū)存在3個(gè)高變區(qū)也稱互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity-determiningregion,CDR1~3)及4個(gè)骨架區(qū)(frameworkregion,FR1~4).三個(gè)高變區(qū)共同組成Ig的抗原識(shí)別部位,形成與抗原決定基互補(bǔ)的表位。

本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第6頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分2023/6/207本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第7頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分2023/6/208多克隆抗體:病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質(zhì),對(duì)其產(chǎn)生的抗體也是多種抗體的混合物,稱為多克隆抗體。單克隆抗體:針對(duì)一個(gè)抗原決定簇的抗體,又是單一的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的、高度特異、均一、來(lái)源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)的抗體。多抗與單抗本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第8頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾臟淋巴結(jié)B細(xì)胞多克隆抗體制備過(guò)程本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第9頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分1234mmmm12341234單抗細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+癌細(xì)胞各抗體分開單克隆抗體制備過(guò)程本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第10頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分疾病的診斷和治療:診斷:檢測(cè)與某些疾病相關(guān)的抗原,輔助臨床診斷。臨床治療:如針對(duì)T淋巴細(xì)胞共有的分化抗原CD3的單克隆抗體,對(duì)器官移植排斥反應(yīng)有顯著抑制作用,用作免疫抑制劑。作為載體制備導(dǎo)向藥物(Antibodydrugconjugates,ADC)治療腫瘤。2023/6/2011抗體的應(yīng)用本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第11頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分需解決的問(wèn)題:鼠源性單克隆抗體的免疫原性(HAMA);完整的抗體分子分子量過(guò)大,難以穿透實(shí)體腫瘤組織,達(dá)不到有效的治療濃度;延長(zhǎng)半衰期。其他2023/6/2012本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第12頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分基本消除了單克隆抗體的鼠源性(免疫原性),鼠源氨基酸只占完整抗體分子的1/80~1/3,只保留同抗原特異性結(jié)合的活性。制備出改形抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識(shí)別單位等很多類型的抗體或抗體單位。2023/6/2013基因工程技術(shù)為解決問(wèn)題提供了可能本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第13頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分二、抗體工程發(fā)展歷程及趨勢(shì)1890年,Behring和北里柴三郎發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素1937年,Tiselius等人用電泳法將血清蛋白分為白蛋白、甲種(α)球蛋白、乙種(β)球蛋白、丙種(γ)球蛋白,并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。1975年,K?hlerandMilstein等首次利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出McAb.在臨床上主要用于診斷和治療。1976年,SusumuTouegava(利根川進(jìn))揭示了抗體多樣性的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。1984年報(bào)道了人—鼠嵌合抗體多克隆抗體單克隆抗體基因工程抗體2023/6/2014本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第14頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分2023/6/2015整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù)

基因工程抗體生成技術(shù)多克隆抗體(抗血清)單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小型化抗體”(單鏈抗體)組合抗體庫(kù)技術(shù)

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達(dá)技術(shù)本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第15頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分商業(yè)化的抗體藥物2023/6/2016本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第16頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分2023/6/20FDA批準(zhǔn)的抗體藥物全抗體37個(gè)(至2014.10月)抗體片段3個(gè)ADC3個(gè)(1個(gè)已撤市)雙特異抗體2個(gè)Fc融合蛋白7個(gè)鼠源嵌合人源化人源ADC1986OKT31994ReoPro1997RituxanZenapax1998SimulectSynagisRemicadeHerceptinEnbrel2000Mylotarg2001Campath2002ZevalinHumira2003XolairBexxar2004AvastinErbitux2006LucentisVectibix2007Soliris2008Cimzia2009StelaraSinponi2010ActemraNumax2011BenlystaYervoyAdcetris2012PerjetaEylea2013KadcylaGazyva2014CyramzaSylvantEntyvioKeytruda本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第17頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分2014年全球生物藥品銷售額前10名NO.DrugCompanySale(billion$)IndicationTarget1Humira(adalimumab)AbbVie&Eisai12.54RATNF2RemicadeJ&J9.24RA、Crohn’sTNF3RituxanBiogen-IDEC8.678Non-Hopkin’sLymphomaCD204EnbrelAmgen8.538RA、牛皮癬TNF4Lantus(insulinglargine)Sanofi7.279I/II型糖尿病/6AvastinRoche/Genentech6.957結(jié)腸癌,NSCLCVEGF7HerceptinRoche/Genentech6.793乳腺癌,胃癌HER28NeulastaAmgen4.39白細(xì)胞減少癥/9LucentisRoche/Genentech,Novartis4.27AMDVEGF10EpogenAmgen3.35貧血及癌癥化療引起貧血/本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第18頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分2013年14個(gè)抗體藥物銷售過(guò)10億美元2023/6/2019110.265.687.7683.867567.51本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第19頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分生物藥物專利懸崖Pharmaceuticals2012,5,1393-1408生物技術(shù)藥物研發(fā)熱浪涌向中國(guó)本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第20頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分重磅化藥銷售Pharmaceuticals2012,5,1393-1408本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第21頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分第二節(jié)單克隆抗體及其制備2023/6/2022一、抗體分子的結(jié)構(gòu)與功能二、單克隆抗體的制備本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第22頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分

(1)Fab段2個(gè)抗原結(jié)合片段

fragmentwithantigenbinding

(2)Fc段1個(gè)可結(jié)晶片段

fragmentcrystallized

Porter木瓜蛋白酶

(1)F(ab’)2段1個(gè)

結(jié)合顆粒性抗原出現(xiàn)凝集反應(yīng)

(2)Fc’段1個(gè)

無(wú)生物學(xué)活性Nisonoff胃蛋白酶1、酶解片段一、抗體分子的結(jié)構(gòu)與功能本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第23頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分

(1)、輕鏈(lightchain,L鏈)

214個(gè)氨基酸殘基,24KD。分為:κ與λ

2個(gè)亞型。(2)、重鏈(heavychain,H鏈)

450-550個(gè)氨基酸殘基,55-75KD。分為5類,μ、γ、α、δ、ε鏈。

IgM,IgG,IgA,IgD,IgE。

2、重鏈和輕鏈本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第24頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分3、可變區(qū)和恒定區(qū)(1)可變區(qū)(Variableregion,V區(qū))

L鏈N端1/2處(VL)110個(gè)aa;

H鏈N端1/5-1/4處(VH)118個(gè)aa。HVR1,HVR2,HVR3又分別稱為CDR1,CDR2,CDR3

骨架區(qū)(frameworkregion,FR)高變區(qū)(hypervariableregion,HVR)

互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity-determiningregion,CDR),

(2)恒定區(qū)(constantregion,C區(qū))

L鏈C端1/2處,105個(gè)aa;H鏈C端3/4-4/5處,331-431個(gè)aa。

在同一種屬動(dòng)物中是比較恒定的,是制備第二抗體進(jìn)行標(biāo)記的重要基礎(chǔ)。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第25頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分4、功能區(qū)鏈內(nèi)二硫鍵折疊成球形區(qū)稱為功能區(qū),約由110個(gè)aa組成。(1)L鏈:2個(gè),VL,CL各1(2)H鏈:

IgG,IgA,IgD:4個(gè)(V區(qū)1個(gè),C區(qū)3個(gè))

IgM,IgE:5個(gè)(V區(qū)1個(gè),C區(qū)4個(gè))

(3)功能區(qū)的作用:(a)VL和VH:結(jié)合抗原決定簇(FV區(qū))(b)CL和CH:具有同種異型的遺傳標(biāo)記(c)CH2:結(jié)合補(bǔ)體(d)CH3:結(jié)合Fc受體

單核細(xì)胞,巨噬細(xì)胞,粒細(xì)胞,B細(xì)胞,

NK細(xì)胞

本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第26頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分5、抗體基因結(jié)構(gòu)2023/6/2027人類編碼Ig的基因分別位于不同的染色體重鏈(Heavychain)基因:位于14號(hào)染色體;輕鏈基因:κ鏈基因位于2號(hào)染色體;λ鏈基因位于22號(hào)染色體。每條肽鏈的編碼基因可分為V區(qū)和C區(qū)兩大部分。V區(qū)的基因是由不同的基因片段拼接而成的重鏈V區(qū):由V、D、J片段拼接;輕鏈V區(qū):由V、J拼接。C區(qū)拼接決定了抗體的類別(

μ、γ、α、δ、ε)本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第27頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分胚系重鏈的基因結(jié)構(gòu):(a)鼠(b)人本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第28頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分重鏈的VDJ重組2023/6/2029本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第29頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分輕鏈基因胚系及重排后結(jié)構(gòu)本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第30頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分抗體類別轉(zhuǎn)換2023/6/2031本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第31頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分V區(qū)功能:識(shí)別并特異性結(jié)合抗原C區(qū)功能:激活補(bǔ)體系統(tǒng):抗體與抗原結(jié)合形成復(fù)合物可通過(guò)啟動(dòng)C1q激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑及補(bǔ)體旁路途徑;介導(dǎo)免疫細(xì)胞活性:抗體的調(diào)理作用;ADCC作用;介導(dǎo)超敏反應(yīng)。穿過(guò)胎盤和黏膜:IgG是唯一能從母體通過(guò)胎盤屏障轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒體內(nèi)的抗體;IgA合成的主要作用部位在黏膜,是黏膜局部抗感染的主要物質(zhì)。2023/6/20325、抗體的功能本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第32頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分2023/6/2033本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第33頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分抗體功能(C區(qū))-ADCC2023/6/2034本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第34頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分抗體功能(C區(qū))-CDC2023/6/2035IgG4、IgA、IgE本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第35頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分二、單克隆抗體及其制備2023/6/2036抗原與動(dòng)物免疫細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)篩選陽(yáng)性克隆與克隆化雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的純化本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第36頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分單克隆抗體制備原理37本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第37頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分單克隆抗體制備的基本技術(shù)1、抗原與動(dòng)物免疫抗原:顆粒性抗原和可溶性抗原;制備特定抗原的單克隆抗體,要制備用于免疫的適當(dāng)抗原,再用抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫??梢杂没瘜W(xué)合成:地高辛多數(shù)抗原物為混合物用整個(gè)腫瘤細(xì)胞做為免疫原,經(jīng)過(guò)篩選、克隆化,制備出僅存在于腫瘤細(xì)胞而不存在于正常細(xì)胞上的表面標(biāo)志分子的單克隆抗體。免疫動(dòng)物:BALB/c小鼠或Lou大鼠;目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系多來(lái)自BALB/c小鼠和LOU大鼠。免疫方法:體內(nèi)免疫和體外免疫(體外致敏淋巴細(xì)胞)。

本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第38頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分體內(nèi)免疫法:

適用于免疫原性強(qiáng)、抗原量較多時(shí)應(yīng)用,一般用8~12周齡雌性鼠。

顆粒性抗原(細(xì)胞抗原)的免疫原性強(qiáng),可不加佐劑,直接注入腹腔107個(gè)細(xì)胞進(jìn)行初次免疫,間隔1~3周,追加免疫1~2次??扇苄钥乖喊?0~100μg抗原/小鼠與福氏完全佐劑和滅活的分枝桿菌等量混合后注入腹腔內(nèi),進(jìn)行初次免疫,間隔2~4周,再用不加佐劑原抗原追加免疫1~2次。一般再采脾細(xì)胞前3日由靜脈注射最后一次抗原。刺激B細(xì)胞分裂。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第39頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)

基本方法:脾細(xì)胞(1*108)與骨髓瘤細(xì)胞(2*107~3*107)混合,在PEG作用下誘導(dǎo)融合(2min),用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋。骨髓瘤細(xì)胞:SP2/0、P3.653,為缺陷性。PEG:分子量4000的PEG是最常用的細(xì)胞融合劑;常用濃度為40%~50%,相對(duì)分子質(zhì)量4000為佳。為了提高融合率,在PEG溶液中加入DMSO,以提高細(xì)胞接觸的緊密性,增加融合率。但必須嚴(yán)格限制接觸時(shí)間。作用機(jī)理:誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排,使細(xì)胞膜易打開而有助于細(xì)胞融合本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第40頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分細(xì)胞融合的步驟:將免疫脾細(xì)胞和小鼠骨髓細(xì)胞以2:1~10:1的比例混勻于50ml錐形離心管內(nèi)200rpm離心7—10分鐘,盡量吸凈上清液,用手指輕擊管壁,使管底沉淀的細(xì)胞鋪展成薄層在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在60秒鐘內(nèi)逐滴加入50%的PEG0.5ml,隨后靜置60秒再于5分鐘內(nèi)邊振搖邊逐滴加入5-10ml不含血清的培液或鹽水緩沖液,以終止PEG的作用再靜置10分鐘。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第41頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分可生產(chǎn)有用抗體的

淋巴細(xì)胞

若與

癌細(xì)胞融合,則形成穩(wěn)定而可培養(yǎng)的細(xì)胞株。癌細(xì)胞可培養(yǎng)生長(zhǎng)漿細(xì)胞Bcell可分泌抗體融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY細(xì)胞融合兩組染色體混在一起也可以培養(yǎng)生長(zhǎng)產(chǎn)生專一性抗體一個(gè)Bcell只產(chǎn)生一種抗體本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第42頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分細(xì)胞融合液中如何去除脾-瘤以外的融和細(xì)胞?

解決方法:選擇性培養(yǎng)基(HAT)

本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第43頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞HAT是含一定濃度次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)及胸腺嘧啶核苷(T)的一種選擇性培養(yǎng)基,其中三種成分與細(xì)胞DNA合成有關(guān)。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第44頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分m核酸補(bǔ)救合成m核酸從頭合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黃嘌呤(H)\胸苷(T)TKHGPRT

TK-HGPRT-次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶胸腺嘧啶核苷激酶葉酸拮抗物本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第45頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分2023/6/2046本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第46頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分選擇性培養(yǎng)方法:將融合的細(xì)胞懸浮于HAT的培養(yǎng)液,加入到96孔板內(nèi)每2~3天換液一次。換液時(shí)吸去1/2~2/3培養(yǎng)液,加入等量的新鮮培養(yǎng)液。7天內(nèi):用HAT培養(yǎng)液,殺死瘤-瘤融合細(xì)胞后,第7~14天:改用HT培養(yǎng)液,14天以后:用普通的RPMI1640完全培養(yǎng)液。從融合后8~9天就可對(duì)所有克隆生長(zhǎng)孔的培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體檢測(cè),篩選出產(chǎn)生抗體的陽(yáng)性克隆。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第47頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分大量細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中死亡,單個(gè)或少數(shù)雜交瘤細(xì)胞不易存活?解決辦法:飼養(yǎng)細(xì)胞小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞最適的條件下,105個(gè)脾細(xì)胞形成1個(gè)雜交瘤細(xì)胞,大量瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)液中相繼死亡,單個(gè)或少數(shù)的雜交瘤細(xì)胞多半不能存活,加入飼養(yǎng)細(xì)胞才能使其繁殖。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第48頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分原因:飼養(yǎng)細(xì)胞能釋放某些生長(zhǎng)刺激因子能滿足雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的依賴性小鼠腹腔巨噬細(xì)胞還能清除死亡細(xì)胞,故應(yīng)用較多。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第49頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分三、篩選陽(yáng)性克隆與克隆化(1)篩選陽(yáng)性克?。寒a(chǎn)生特定抗原的抗體產(chǎn)生細(xì)胞:占所有脾細(xì)胞的5%微量、快速、特異、敏感、簡(jiǎn)便,并一次能檢測(cè)大批標(biāo)本的方法。檢測(cè)方法:免疫酶技術(shù);免疫熒光技術(shù);放射免疫技術(shù);FACS2023/6/2050本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第50頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分ELISA本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第51頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分1、精制破傷風(fēng)毒素抗原()吸附(約10g/ml,4℃,3h)洗滌2、加雜交瘤培養(yǎng)上清液()(4℃,1h)3、加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體()(4℃,1h)洗滌洗滌4、加酶作用底物,呈色孔為陽(yáng)性克隆孔ELISA用于破傷風(fēng)抗體的篩選2023/6/2052本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第52頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分(2)克隆化——有限稀釋法和軟瓊脂法應(yīng)盡早克隆化:含不分泌細(xì)胞,多株分泌細(xì)胞,染色體易丟失克隆化:?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞通過(guò)無(wú)性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程。其中每個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)特征和功能完全相同。一般3次克隆化,才能達(dá)到100%孔內(nèi)均為抗體陽(yáng)性細(xì)胞克隆。常用的克隆化方法有:有限稀釋法、軟瓊脂法、流式細(xì)胞法。2023/6/2053本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第53頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分有限稀釋法:通過(guò)適當(dāng)?shù)南♂屵_(dá)到分離單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的目的:雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋,加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,使每個(gè)孔中在理論上只含有一個(gè)細(xì)胞。例:取出陽(yáng)性孔內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù);用培液將其稀釋到例如每毫升內(nèi)10個(gè)細(xì)胞;如果在96孔板內(nèi)每孔加0.1ml,其機(jī)率將為每孔內(nèi)落入一個(gè)細(xì)胞;加入一定數(shù)量的飼養(yǎng)細(xì)胞,經(jīng)過(guò)8~12天后,可觀察到有集落生長(zhǎng)的孔;據(jù)檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果再次進(jìn)行克隆化。2023/6/2054本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第54頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分軟瓊脂法:培養(yǎng)液中加入0.5%左右的瓊脂糖凝膠細(xì)胞分裂后形成小球樣團(tuán)塊,用毛細(xì)吸管將小球吸出團(tuán)塊打碎后移入96孔板繼續(xù)培養(yǎng)可吸出大量克隆細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),因初代細(xì)胞很不易增殖,所以該法容易成功。2023/6/2055本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第55頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分

四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定(一)雜交瘤細(xì)胞鑒定:鼠脾細(xì)胞染色體數(shù):40,端著絲粒;小鼠骨髓瘤細(xì)胞染色體:SP2/0細(xì)胞為62~68,NS-1為54~64,中部和亞中部著絲點(diǎn);雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目:親本細(xì)胞數(shù)目總和,多數(shù)為端著絲粒,少數(shù)標(biāo)志染色體;染色體數(shù)目多且較集中的雜交瘤細(xì)胞分泌高效價(jià)的抗體;

本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第56頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分Ig類型、亞類測(cè)定:雙擴(kuò)法或ELISA法特異性測(cè)定:抗原類似物的交叉反應(yīng)效價(jià)測(cè)定:用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示

表位測(cè)定:競(jìng)爭(zhēng)抑制法親和性測(cè)定:測(cè)定親和常數(shù)K雜交瘤細(xì)胞染色體:秋水仙素裂解法McAb靶抗原分子量:常用westernblot(二)抗體性狀鑒定本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第57頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分五、單克隆抗體的制備(1)體外培養(yǎng)法:可獲得10g/ml的抗體;多采用RPMI1640培養(yǎng)液,添加10%~20%胎?;蛐∨Q?。(2)動(dòng)物體內(nèi)誘生法:可獲得5~20mg/ml的抗體。目前多采用2023/6/2058本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第58頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分體內(nèi)誘生法:因?yàn)殡s交瘤細(xì)胞的兩種親本細(xì)胞均來(lái)自BALB/c小鼠,所以應(yīng)選用BALB/c小鼠來(lái)制備單克隆抗體??捎谧⑷爰?xì)胞的幾周前,預(yù)先將具有刺激性的有機(jī)溶劑降植烷(pristane)注入腹腔內(nèi),以破壞腹腔內(nèi)膜,建立雜交瘤易于增殖的環(huán)境。優(yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)便,經(jīng)濟(jì),所得單克隆抗體量較多且效價(jià)亦高,還可有效地保存雜交瘤細(xì)胞株和分離已污染雜菌的雜交瘤細(xì)胞株2023/6/2059本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第59頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分小結(jié)本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第60頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第61頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分六、單克隆抗體的純化動(dòng)物體內(nèi)誘生法制備單克隆抗體具體純化方法及過(guò)程1、澄清和沉淀處理離心1000g×5min:去除殘留的小顆粒物質(zhì)(小鼠腹水中含有紅細(xì)胞、細(xì)胞碎塊、纖維蛋白凝塊及脂質(zhì)等);0.2m的微孔濾膜過(guò)濾:除掉污染的細(xì)菌、支原體和脂質(zhì);用飽和硫酸銨沉淀抗體:50%飽和硫酸銨能回收90%以上的單克隆抗體。2023/6/2062本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第62頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分1.名詞解釋:抗體;免疫球蛋白;多克隆抗體;單克隆抗體2.單克隆抗體有哪些不足?如何改造?3.大量制備單克隆抗體的方法主要有哪些?4.制備單克隆抗體的一般流程是什么?(如何制備雜交瘤細(xì)胞?)思考題2023/6/2063本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第63頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分第三節(jié)基因工程抗體基因工程抗體(Geneticengineeringantibody)

根據(jù)研究者的意圖,采用基因工程方法,在基因水平,對(duì)免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá),產(chǎn)生新型抗體。目的:保留天然抗體的特異性和主要生物活性,去除或減少無(wú)關(guān)結(jié)構(gòu)及鼠源單抗不足;賦予抗體分子新的生物活性。原理:抗體同抗原結(jié)合的功能決定于抗體分子的可變區(qū)(V),同種性免疫源性則決定于抗體分子的穩(wěn)定區(qū)(C)。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第64頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分內(nèi)容1、人-鼠嵌合抗體(ChimericAntibody)2、人源化改型抗體(HumanizedAntibody)3、單鏈抗體4、單域抗體與分子識(shí)別單位5、雙功能抗體6、抗體融合蛋白2023/6/2065本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第65頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分基因工程抗體的類型人-鼠嵌合抗體改型抗體(人源化抗體)FabFv單鏈抗體單域抗體最小識(shí)別單位抗體融合蛋白2023/6/2066單域抗體最小識(shí)別單位單鏈抗體小分子抗體本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第66頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分1人一鼠嵌合抗體(ChimericAntibodies)

人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第67頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建H鏈嵌合載體L鏈嵌合載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞啟動(dòng)子人-鼠嵌合抗體基因工程改造策略構(gòu)建嵌合抗體過(guò)程:鼠源單抗的可變區(qū)基因連到包含有人抗體恒定區(qū)基因并構(gòu)建到表達(dá)所需的其它元件(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記等)的表達(dá)載體上,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞、CHO細(xì)胞)中表達(dá)。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第68頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分鼠VH鼠VL人CL人CH抗體分泌細(xì)胞人-鼠嵌合基因工程抗體本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第69頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分2人源化改型抗體(Reshapingantibody)鼠單克隆抗體V區(qū)的人源化

盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多,但有時(shí)它仍可能引發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。為了進(jìn)一步降低抗體的鼠源成分,發(fā)展出CDR移植技術(shù)。

CDR移植:即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi),所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體,也就是人源化抗體(humanizedantibody)。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第70頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分

經(jīng)過(guò)CDR移植,抗體的免疫原性極低,而其抗原結(jié)合能力保持不變

結(jié)合半抗原及全抗原(如細(xì)胞表面受體、病毒等)的改形抗體都已有報(bào)道,到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體。(美國(guó)正式上市的28種治療性單抗中多數(shù)是人源化抗體)本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第71頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分

人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點(diǎn)突變法。全合成法是以人抗體序列為骨架,以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR,將整個(gè)可變區(qū)序列的兩條鏈分解成若干片段,并使相鄰的片段具有彼此互補(bǔ)的粘性末端。合成所有DNA片段,每組片段分別退火,然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因,插入質(zhì)粒中,進(jìn)一步即可用于構(gòu)建和表達(dá)改形抗體。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第72頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分

定點(diǎn)突變法是將人的可變區(qū)基因克隆,根據(jù)鼠抗體的CDR序列合成幾種突變引物,用定點(diǎn)突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列,然后表達(dá)出改型抗體。研究表明,在構(gòu)建改形抗體時(shí),簡(jiǎn)單地進(jìn)行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力,因此在構(gòu)建時(shí)還必需包括對(duì)影響抗原結(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)的框架序列(FR)進(jìn)行操作。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第73頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分單鏈抗體(singlechainFv,scFv)P154:由一段彈性連接肽(linker)把可變區(qū)重鏈(VH)與輕鏈(VL)相連而成,具有親代抗體全部抗原結(jié)合特異性的最小功能結(jié)構(gòu)單位。連接肽的長(zhǎng)度在10-15個(gè)氨基酸左右,具有一定彈性和蛋白酶抗性,常用的連接肽是(GGGGS)3它應(yīng)具有柔軟性,側(cè)鏈少,抗原性弱等特點(diǎn)。

3單鏈抗體(ScFv)Fv由于其結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合,故Fv不穩(wěn)定,在VH與VL之間加上一段連接肽,把VH與VL連成一條單鏈,得到單鏈抗體。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第74頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分分子小,保持完整抗原結(jié)合位點(diǎn),易進(jìn)入組織;易于進(jìn)行分子改造,融合毒素、酶、藥物等構(gòu)成雙功能抗體。免疫原性低;可在大腸桿菌中表達(dá);缺乏Fc段,不與非靶細(xì)胞(Fc受體陽(yáng)性細(xì)胞)結(jié)合,易進(jìn)入組織,偶聯(lián)成像可用于診斷;體內(nèi)半衰期短易從血循環(huán)中清除;親和力和穩(wěn)定性較完成抗體低;因只能與抗原結(jié)合,不能激活補(bǔ)體激活細(xì)胞免疫(CDC)及抗體依賴細(xì)胞毒效應(yīng)(ADCC)。2023/6/2075單鏈抗體(ScFv)特點(diǎn)本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第75頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分

單鏈抗體的構(gòu)建在已知親本DNA序列時(shí)可用完全人工合成法;

從雜交瘤細(xì)胞系構(gòu)建單鏈抗體,可用PCR方法擴(kuò)增可變區(qū)基因VH,VL,將二者連接成ScFv基因,再組裝到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體上。ScFv的基因構(gòu)建本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第76頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分

單鏈抗體最常用的表達(dá)體系是大腸桿菌,有2種方式:

一是表達(dá)為包涵或非包涵體的不溶蛋白。但需進(jìn)行變性復(fù)性,使其形成正確的立體結(jié)構(gòu),恢復(fù)抗體活性;

二是分泌型表達(dá),將細(xì)菌的信號(hào)肽序列與單鏈抗體的氨基端相連,單鏈抗體分子就可分泌到質(zhì)周腔和細(xì)菌體外,進(jìn)行折疊后成為有活性的分子。重組ScFv的表達(dá)本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第77頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分雙價(jià)及多價(jià)ScFv2023/6/2078連接肽(linker)較短時(shí),同一ScFv分子內(nèi)VH與VL不能相互配對(duì),分子間的VH,VL功能區(qū)配對(duì)成一個(gè)二價(jià)的二聚體,也可構(gòu)成三聚體或多聚體。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第78頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分

抗體的VH、VL約為完整分子的1/12,只由一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低,但仍保持著原單抗的特異性。

4、單域抗體和分子識(shí)別單位VH分子識(shí)別單位:約為完整分子的1/80-1/70大小,一般由一個(gè)CDR構(gòu)成,它也保持著抗體的特異性。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第79頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分即雙特異性抗體(bispecificantibody,BSAb)是指能同時(shí)識(shí)別2種抗原的抗體。5、雙(多)功能抗體本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第80頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分

Hollinger等將A抗原抗體的輕鏈可變區(qū)基因(VLA)與抗B抗原抗體的重鏈可變區(qū)(VHB)通過(guò)短肽連接子連接;同樣地,將VHA與VLB連接,將兩組嵌合基因置于雙順?lè)醋拥谋磉_(dá)質(zhì)粒中,構(gòu)建成雙鏈抗體的表達(dá)質(zhì)粒,目前報(bào)道的表達(dá)質(zhì)粒均為雙順?lè)醋印1磉_(dá)后,VLAVHB與VHAVLB交叉連結(jié),形成雙特異性抗體。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第81頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分雙功能抗體實(shí)例

能結(jié)合靶腫瘤細(xì)胞又能結(jié)合高細(xì)胞毒性的效應(yīng)細(xì)胞,將效應(yīng)細(xì)胞富集在腫瘤周圍,而且可以模擬天然配體的作用,與細(xì)胞表面引發(fā)分子結(jié)合,激活效應(yīng)細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷和裂解。與既往腫瘤免疫治療相比,除了能特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞外,還能將循環(huán)血液中的免疫效應(yīng)細(xì)胞再導(dǎo)向至腫瘤細(xì)胞處,從而使效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤活性增強(qiáng),發(fā)揮免疫導(dǎo)向作用,這是腫瘤治療的新突破。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第82頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分Catumaxomab2023/6/2083本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第83頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分多功能抗體

本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第84頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分6、抗體融合蛋白將抗體片段(V區(qū)或C區(qū))連接到與抗體無(wú)關(guān)的其他蛋白上,創(chuàng)造出抗體相關(guān)分子,稱為抗體融合蛋白(antibodyfusionprotein)。分類:Fv抗體融合蛋白:抗體的Fv與其他生物活性蛋白結(jié)合,主要用于導(dǎo)向治療領(lǐng)域。Fc抗體融合蛋白:抗體Fc段與某些有黏附或結(jié)合功能的蛋白質(zhì)融合而獲得的融合蛋白。2023/6/2085本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第85頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分Fv-抗體融合蛋白抗體與毒素、酶、細(xì)胞因子等生物活性分子融合達(dá)到特異殺傷腫瘤細(xì)胞目的??贵w與毒素偶聯(lián):綠膿桿菌外毒素、蓖麻毒素(II期);抗體與酶蛋白融合:也稱為抗體酶(abenzyme),前體藥物療法(ADEPT);抗體與細(xì)胞因子融合:IL-2,免疫介導(dǎo)療法;2023/6/2086本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第86頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分Fc-抗體融合蛋白具有與特定蛋白(ProteinA,ProteinG)結(jié)合的特點(diǎn),便于檢測(cè)與純化;Fc介導(dǎo)的抗體效應(yīng)功能,如:ADCC、CDC及免疫調(diào)理作用;延長(zhǎng)蛋白在血液中的半衰期;實(shí)例:CD4-Fc;CTLA4-Fc;TNFaR-Fc;VEGFR-Fc(VEGF-TRAP)2023/6/2087本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第87頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分2023/6/2088本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第88頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分思考題一、名詞解釋1、可變區(qū)2、恒定區(qū)3、互補(bǔ)決定區(qū)4、功能區(qū)5、人—鼠嵌合抗體6、改形抗體7、Fab抗體8、Fv抗體9、單鏈抗體(scFv)10、單域抗體11、雙特異單鏈抗體(bisFvs)二、簡(jiǎn)答1、簡(jiǎn)述抗體的結(jié)構(gòu)與功能、抗體多樣性的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。2、基因工程抗體有哪些類型?其特性有何不同?3、抗體融合蛋白有哪些類型,特征和設(shè)計(jì)策略是什么?試舉例說(shuō)明。4、多價(jià)抗體特點(diǎn)?2023/6/2089本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第89頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分

第四節(jié)噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)抗體研究的三個(gè)階段:①以1890年Behring發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素為代表,其特點(diǎn)是用抗原免疫動(dòng)物來(lái)獲得多克隆抗體;②以1975年K?hler創(chuàng)建雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體為代表;③以1994年Winter以基因工程方法制備抗體為代表??贵w研究領(lǐng)域的一次技術(shù)革命,完全用基因工程技術(shù)制備人源化抗體,還能利用基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)技術(shù),通過(guò)細(xì)菌發(fā)酵或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物大規(guī)模生產(chǎn)抗體。在此基礎(chǔ)上發(fā)展成抗體工程。Winter創(chuàng)建了噬菌體抗體庫(kù)(Repertoireofantibodiesdisplayedonphages)技術(shù),克服了人體不能隨意免疫的缺點(diǎn),用人外周血制備抗體文庫(kù),從而獲得人源性基因工程抗體。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第90頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分將蛋白分子或多肽基因克隆到絲狀噬菌體的基因組DNA中,使噬菌體表面表達(dá)該異源分子,稱為噬菌體展示。將B細(xì)胞全套可變區(qū)基因克隆,插入絲狀噬菌體表達(dá)載體轉(zhuǎn)化工程菌進(jìn)行表達(dá),在噬菌體表面形成噬菌體抗體的群體,即為噬菌體抗體庫(kù)(surfacedisplayantibodylibrary)。噬菌體展示抗體庫(kù)技術(shù)本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第91頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分用PCR擴(kuò)增人抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因(獲取目的基因)克隆到噬菌體載體并以融合蛋白的形式表達(dá)在其外殼表面(載體構(gòu)建)用抗原抗體反應(yīng)篩選出表達(dá)所需要抗體的克隆并擴(kuò)增。(淘篩和鑒定)使抗體基因以分泌的方式表達(dá),篩選可溶性的抗體片段??贵w庫(kù):組合抗體文庫(kù):在建庫(kù)過(guò)程中如果將VH和VL隨機(jī)組合人天然抗體庫(kù):抗體mRNA來(lái)源于未經(jīng)免疫的正常人一、基本原理和程序本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第92頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分噬菌體抗體庫(kù)本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第93頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分絲狀噬菌體基因基因編碼產(chǎn)物功能gIpI噬菌體裝配gIIpII噬菌體基因組復(fù)制gIIpIII尾端外殼蛋白,與F因子結(jié)合gIVpIV噬菌體裝配gVpV噬菌體基因組復(fù)制gVIpVI外殼蛋白,末端“塞子”gVIIpViI外殼蛋白,高度疏水,組裝起始信號(hào)gVIIIpVIII主要外殼蛋白gIXpIX外殼蛋白,高度疏水,末端“塞子”gXpXgIII啟動(dòng)子激活蛋白本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第94頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第95頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第96頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分噬菌體表面展示文庫(kù)技術(shù)的要點(diǎn)外源基因表達(dá)多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端將基因組合文庫(kù)插入噬菌體編碼膜蛋白的基因g3或g8的先導(dǎo)系列的緊靠下游隨機(jī)克隆入相應(yīng)載體形成組合文庫(kù)從免疫或未被免疫的B細(xì)胞中PCR擴(kuò)增抗體全套基因片段本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第97頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴(kuò)增”數(shù)個(gè)循環(huán)直接、方便、簡(jiǎn)捷、高效地篩選出表達(dá)特異性好、親和力強(qiáng)的抗體噬菌體庫(kù)。使翻譯出的抗體分泌到細(xì)菌的質(zhì)周腔內(nèi),形成游離的抗體片段,經(jīng)過(guò)純化即可獲得目的抗體。篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后,轉(zhuǎn)入大腸桿菌,本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第98頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分1、獲取目的基因:提取RNA,經(jīng)RT-PCR獲取抗體某一特定基因區(qū)段。

2、抗體庫(kù)技術(shù)的載體:普遍使用噬菌粒(phagemid)載體。

3、淘篩(panning):用固相化抗原對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的載體進(jìn)行淘篩,淘汰非目的克隆,使目的克隆大量擴(kuò)增。

4、表達(dá)與鑒定:目的克隆經(jīng)過(guò)鑒定后,再導(dǎo)入感受態(tài)菌珠,進(jìn)行可溶性表達(dá),其產(chǎn)物用Westernblot分析確定后,就完成了全過(guò)程。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的基本方法小結(jié)本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第99頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分二、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的特點(diǎn)1、模擬天然全套抗體庫(kù)抗體文庫(kù)可以達(dá)到或超過(guò)1011庫(kù)容,所以能包含B細(xì)胞全部克隆。建庫(kù)的外源基因來(lái)自人體外周血、骨髓或脾臟的淋巴細(xì)胞提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA擴(kuò)增,這是人體多克隆細(xì)胞的總mRNA。使用的通用引物采自多個(gè)人體,具有人的種屬普遍性。抗體的VH和VL基因的隨機(jī)重組也增加了抗體的多樣性。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第100頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分2、避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù)由于抗體庫(kù)的大容量和極高的篩選效率,使得可以調(diào)出任意抗體基因,用基因工程方法制備抗體,因而能避免使用人工免疫動(dòng)物和細(xì)胞融合技術(shù)。3、可獲得高親和力的人源抗體在噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)中,VH和VL基因的隨機(jī)重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過(guò)程,所用的抗體基因又來(lái)自人體,因此,所產(chǎn)生的抗體必然都是高親和力的人源化抗體。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第101頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分將抗體的基因型和表型緊密聯(lián)系起來(lái);可繞過(guò)雜交瘤技術(shù),不需要復(fù)雜的基因工程技術(shù);抗體基因篩選的范圍廣;技術(shù)穩(wěn)定、可靠、生產(chǎn)周期短;可規(guī)?;a(chǎn);適用范圍廣,既可用于抗體制備,也適用于其它蛋白如激素、酶、藥物、隨機(jī)多肽等的生產(chǎn)。該項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn):本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第102頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的發(fā)展具有很大優(yōu)越性。它簡(jiǎn)單易行,篩選容量大,效率高,繞過(guò)了細(xì)胞融合及免疫等步驟,而且在表型一基因型的統(tǒng)一和識(shí)別一增殖過(guò)程上模擬了B細(xì)胞的成熟過(guò)程,從而在實(shí)際應(yīng)用上具有很大意義。使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面,利用親和層析,兩輪富集達(dá)106倍。該技術(shù)的成功給抗體基因的篩選工作帶來(lái)了革命性的變革。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第103頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分

第六節(jié)抗體治療藥物

自第一個(gè)抗體藥物批準(zhǔn)上市以來(lái),已被成功用于治療腫瘤、自身免疫疾病等多種“疑難雜癥”,截止2012年6月,美國(guó)FDA批準(zhǔn)28種抗體藥物,抗腫瘤占53.8%,免疫性疾?。?9.2%、器官移植11.5%、感染性疾病7.7%、心血管疾病3.8%、其他3.8%。本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第104頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分商業(yè)化的抗體藥物2023/6/201055個(gè)靶標(biāo)的抗體仿制藥開發(fā)是熱點(diǎn):CD20,HER2,EGFR,VEGF,TNF-alpha本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第105頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分2023/6/20106VEGFTargetAnti-VEGFStrategy本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第106頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分HER2signalingpathwayandAnti-HER2Strategy本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第107頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分108CombinationstrategiestopotentiatecellularresponseandovercomeresistanceNancyE.Hynes

andHeidiA.Lane.ERBBreceptorsandcancer:thecomplexityoftargetedinhibitors.NatRevCancer.2005;5:341-354.本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第108頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分2013年全球生物藥品銷售額前10名NO.DrugCompanySale(billion$)IndicationTarget1Humira(adalimumab)AbbVie&Eisai11.00RATNF2EnbrelAmgen8.76RA、牛皮癬TNF3RemicadeJ&J8.37RA、Crohn’sTNF4Lantus(insulinglargine)Sanofi7.95I/II型糖尿病/5RituxanBiogen-IDEC7.91Non-Hopkin’sLymphomaCD206AvastinRoche/Genentech6.97結(jié)腸癌,NSCLCVEGF7HerceptinRoche/Genentech6.91乳腺癌,胃癌HER28NeulastaAmgen4.39白細(xì)胞減少癥/9LucentisRoche/Genentech,Novartis4.27AMDVEGF10EpogenAmgen3.35貧血及癌癥化療引起貧血/本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第109頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分2013年14個(gè)抗體藥物銷售過(guò)10億美元2023/6/20110110.265.687.7683.867567.51本文檔共116頁(yè);當(dāng)前第110頁(yè);編輯于星期二\21點(diǎn)17分抗體藥物分類抗體或抗體片段(小分子抗體藥物)抗體融合蛋白抗體偶聯(lián)物或免疫偶聯(lián)物2023/6/20111抗體與放射

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫(kù)網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論