熒光定量PCR技術(shù)與常見問題分析

定量PCR是如何工作的本文檔共107頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分熒光定量PCR是什么一種實(shí)時(shí)監(jiān)控目的基因PCR擴(kuò)增的技術(shù)本文檔共107頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分定量PCR是如何工作的?傳統(tǒng)PCR

具有以下基本要素dsDNA模版,primers引物,dNTPs核苷酸,PCRbuffer緩沖液,TaqpolymeraseDNA聚合酶等TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCAACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGTMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+TACGGAGCTGA本文檔共107頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分與傳統(tǒng)PCR一樣,反應(yīng)在溫度模塊里循環(huán)進(jìn)行:>雙鏈DNA模板變性>引物與模板退火>引物延伸

新的擴(kuò)增片段定量PCR是如何工作的?理論上每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)目的基因的數(shù)量都會增加一倍本文檔共107頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分在PCR混合液中含有熒光物質(zhì)。定量PCR是如何工作的?本文檔共107頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分無論哪個(gè)型號，所有的熒光定量PCR儀都有三個(gè)共同的組成部分定量PCR是如何工作的?本文檔共107頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分PCRPCRLotsofPCRPCRproduct隨著擴(kuò)增的進(jìn)行,熒光信號會隨著PCR產(chǎn)物的增加而增加定量PCR是如何工作的?本文檔共107頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分Real-timePCR儀會記錄每個(gè)循環(huán)經(jīng)過每個(gè)濾光片的熒光信號變化定量PCR是如何工作的?Cycle1FilterASample1Level:本文檔共107頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分為什么要用定量PCR？

重復(fù)性好

靈敏度高

動力學(xué)范圍寬一個(gè)好的定量PCR數(shù)據(jù)本文檔共107頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分1:重復(fù)性好本文檔共107頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分2:靈敏度高可以檢測到低拷貝的目的基因本文檔共107頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分3:動態(tài)范圍寬兼具重復(fù)性和準(zhǔn)確性的起始模版濃度范圍(越大越好)本文檔共107頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分為什么要用定量PCR？

快：節(jié)省時(shí)間和勞力（不用電泳檢測）。本文檔共107頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分為什么要用定量PCR？

安全：不用EB或放射性物質(zhì)本文檔共107頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分定量PCR的化學(xué)原理本文檔共107頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分支持的化學(xué)試劑SYBR?GreenITaqMan?本文檔共107頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分TaqMan?

中會使用到兩段短片段序列，稱為雙向特異引物TaqMan?

化學(xué)原理

本文檔共107頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分第三段短片段序列，又稱為探針,位于序列中間TaqMan?

化學(xué)原理

本文檔共107頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分報(bào)告染料Reporterdye淬滅染料Quencherdye探針標(biāo)記兩種

染料分子TaqMan?

化學(xué)原理

本文檔共107頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分Reporter沒有熒光信號（發(fā)射）能量光(激發(fā))完整的探針TaqMan?

化學(xué)原理

本文檔共107頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分光能然而，如果探針斷裂了……TaqMan?

化學(xué)原理

本文檔共107頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分Denaturation變性(95oC)TaqMan?

化學(xué)原理

本文檔共107頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分Annealing退火(60oC)TaqMan?

化學(xué)原理

本文檔共107頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分Taq酶登場……TaqMan?

化學(xué)原理

本文檔共107頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分找到引物序列……TaqMan?

化學(xué)原理

本文檔共107頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分開始延伸(60oC)TaqMan?

化學(xué)原理

本文檔共107頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分Extension延伸(60oC)TaqMan?

化學(xué)原理

本文檔共107頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分Extension延伸(60oC)TaqMan?

化學(xué)原理

本文檔共107頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分?Extension延伸(60oC)TaqMan?

化學(xué)原理

本文檔共107頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分Taq酶很特別……具有核酸外切酶活性，可以‘吃掉’結(jié)合到模板上的DNA片段TaqMan?

化學(xué)原理

本文檔共107頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分Taq酶降解探針TaqMan?

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本文檔共107頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分Taq酶降解探針TaqMan?

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本文檔共107頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分Taq酶降解探針TaqMan?

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本文檔共107頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分Taq酶降解探針TaqMan?

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本文檔共107頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分TaqMan?

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本文檔共107頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分TaqMan?

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本文檔共107頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分嗝!TaqMan?

化學(xué)原理

本文檔共107頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分SYBR?GreenI化學(xué)原理本文檔共107頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分SYBR?GreenI染料本文檔共107頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分SYBR?GreenI染料本文檔共107頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分SYBR?GreenI染料本文檔共107頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分SYBR?GreenI染料的缺點(diǎn)非特異結(jié)合任意

雙鏈DNA定量結(jié)果不準(zhǔn)確非特異性PCR產(chǎn)物信號本文檔共107頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分使用熔解曲線Meltcurve(DissociationCurve)檢查反應(yīng)特異性TemperatureFluorescence本文檔共107頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分Meltcurve:

導(dǎo)數(shù)圖譜一個(gè)干凈的峰=沒有無關(guān)的產(chǎn)物TemperatureFluorescence本文檔共107頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分Meltcurve的雜峰可能是引物二聚體本文檔共107頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分多余的峰是如何產(chǎn)生的?非特異擴(kuò)增1、轉(zhuǎn)錄組中錯(cuò)誤的目的基因。2、引物結(jié)合在正確的序列,但是既檢測基因組DNA又檢測cDNA(由于短的內(nèi)含子,基因組DNA有較高的Tm值)。解決方法：設(shè)計(jì)引物時(shí)至少有一條跨過外顯子的結(jié)合點(diǎn)

引物二聚體本文檔共107頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分到底用哪一種化學(xué)方法呢？TaqMan?,還是SYBR?Green?...本文檔共107頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分TaqMan?,還是...

SYBR?GreenI?優(yōu)點(diǎn)更高的特異性

不會有引物二聚體干擾支持多重?zé)晒鈱?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法易于優(yōu)化缺點(diǎn)價(jià)格稍貴優(yōu)點(diǎn)價(jià)格便宜大部分基因以及少量樣品均適用缺點(diǎn)特異性稍差必須要做Meltcurves不支持多重?zé)晒庠O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法通常需要優(yōu)化本文檔共107頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分定量PCR的數(shù)學(xué)原理本文檔共107頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分怎樣獲得結(jié)果首先讓我們定義擴(kuò)增曲線的各種參數(shù)。本文檔共107頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分PCR的動力學(xué)曲線和四個(gè)階段本文檔共107頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分指數(shù)擴(kuò)增期重復(fù)性準(zhǔn)確性動態(tài)范圍3個(gè)階段中最佳時(shí)期本文檔共107頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分只有一個(gè)擴(kuò)增期提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)指數(shù)擴(kuò)增期本文檔共107頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分基線基線（空白）信號的產(chǎn)生是由于背景引起的本文檔共107頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分閾值默認(rèn)閾值=基線（背景）信號標(biāo)準(zhǔn)偏差x10本文檔共107頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分怎么獲得結(jié)果第一步：確定Ct值本文檔共107頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分怎么獲得結(jié)果第二步：比較Ct值本文檔共107頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分定量PCR的應(yīng)用絕對定量相對定量陰陽性鑒定基因分型本文檔共107頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和流程

---絕對定量和相對定量本文檔共107頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分定量PCR的實(shí)驗(yàn)要素

目的基因樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品監(jiān)控系統(tǒng)故障陽性對照監(jiān)控污染陰性對照校準(zhǔn)生物學(xué)誤差內(nèi)參(管家基因)校準(zhǔn)物理誤差參比熒光降低隨機(jī)誤差重復(fù)實(shí)驗(yàn)本文檔共107頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分相對定量實(shí)驗(yàn)示例實(shí)驗(yàn)未處理樣本處理后樣本目的基因：Plat1實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簶颖咎幚砗?，Plat1基因的表達(dá)量有什么變化？本文檔共107頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分實(shí)驗(yàn)流程對照樣本本文檔共107頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分兩種相對定量的方法比較Ct（ΔΔCt）法相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法樣本間目的基因的倍數(shù)關(guān)系本文檔共107頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分兩種方法的區(qū)別

比較Ct(ΔΔCt)法

相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法*已知各個(gè)基因的擴(kuò)增效率*每個(gè)基因都要做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線*不需要每次都做標(biāo)準(zhǔn)曲線*準(zhǔn)確的擴(kuò)增效率計(jì)算*簡單,經(jīng)濟(jì),通量較高*工作量大,成本高,通量較低本文檔共107頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分如何選擇相對定量的方法本文檔共107頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分如何選擇相對定量的方法本文檔共107頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分如何選擇相對定量的方法在EXCEL中制作圖表本文檔共107頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分如何選擇相對定量的方法在EXCEL中制作圖表斜率<0.1斜率>0.1比較Ct(ΔΔCt)法相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法本文檔共107頁；當(dāng)前第81頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分ΔΔCt法必要條件：目的基因和內(nèi)參基因必須有相一致的擴(kuò)增效率，并盡可能接近100%。本文檔共107頁；當(dāng)前第82頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分ΔΔCt法如何確認(rèn)擴(kuò)增效率接近100%？每條引物一條標(biāo)準(zhǔn)曲線本文檔共107頁；當(dāng)前第83頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分ΔΔCt法標(biāo)準(zhǔn)曲線可以幫助判定擴(kuò)增效率例如：斜率-3.3說明擴(kuò)增效率接近100%；更小的負(fù)值（如-3.5）說明擴(kuò)增效率小于100%公式：E=10(-1/斜率)-1本文檔共107頁；當(dāng)前第84頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分ΔΔCt法結(jié)果計(jì)算步驟一：內(nèi)參基因均一化樣本差異Ct目的基因-Ct目的基因=

ΔCt步驟二：處理樣本和對照樣本作比較

ΔCt處理樣本-ΔCt對照樣本=

ΔΔCt步驟三：使用公式計(jì)算

倍數(shù)變化

=2

-ΔΔCt本文檔共107頁；當(dāng)前第85頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分公式含義2

-ΔΔCt2=循環(huán)間擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化（PCR擴(kuò)增產(chǎn)物倍增）ΔΔCt=處理樣本和對照樣本之間校正過大循環(huán)數(shù)的變化所以，這個(gè)公式告訴我們對照樣本和處理樣本之間目的基因的倍數(shù)變化。本文檔共107頁；當(dāng)前第86頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分ΔΔCt法計(jì)算示例本文檔共107頁；當(dāng)前第87頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分ΔΔCt法計(jì)算示例為了去除樣本間加樣量不同帶來的誤差，需要對數(shù)據(jù)均一化處理。本文檔共107頁；當(dāng)前第88頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分ΔΔCt法計(jì)算示例首先，選擇對照樣本；接著，均一化對照樣本；然后，所有樣本和對照樣本進(jìn)行比較。本文檔共107頁；當(dāng)前第89頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分ΔΔCt法計(jì)算示例最后，計(jì)算出倍數(shù)關(guān)系2

–ΔΔCt。本文檔共107頁；當(dāng)前第90頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法每對引物做一條相對標(biāo)準(zhǔn)曲線本文檔共107頁；當(dāng)前第91頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算示例表示倍數(shù)差異本文檔共107頁；當(dāng)前第92頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分絕對定量實(shí)驗(yàn)

目的：生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立Ct值與濃度之間的線性關(guān)系；

要求：

濃度已知

標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品的PCR效率一致，且接近100%

–儀器質(zhì)量一致

–試劑質(zhì)量一致：模板純度、引物和探針的Tm值、酶活性、緩

沖液成分

–反應(yīng)條件一致：循環(huán)參數(shù)相同、同一次實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備本文檔共107頁；當(dāng)前第93頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分絕對定量實(shí)驗(yàn)Don’t:?制備3個(gè)點(diǎn)的2倍標(biāo)準(zhǔn)曲線要求：Do:?制備至少5個(gè)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(4logs)?去除離散的重復(fù)孔，或者有必要時(shí)去除整個(gè)梯度數(shù)據(jù)如何制備標(biāo)準(zhǔn)曲線本文檔共107頁；當(dāng)前第94頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分絕對定量實(shí)驗(yàn)選擇目標(biāo)→提取/PCR→純化→測定濃度→調(diào)整濃度→梯度稀釋Ct值在17-30之間，覆蓋全部樣品濃度區(qū)間10倍連續(xù)梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i)+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v注：不可由標(biāo)準(zhǔn)品i分別加不同體積的稀釋緩沖液直接得到標(biāo)準(zhǔn)品ii、iii、iv、v標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋方法本文檔共107頁；當(dāng)前第95頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分絕對定量實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增效率：每個(gè)循環(huán)中靶分子被作為模板利用的百分比。PCR效率的測定本文檔共107頁；當(dāng)前第96頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分常見問題分析本文檔共107頁；當(dāng)前第97頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分1.擴(kuò)增效率為什么達(dá)不到100%主要原因：樣品不純擴(kuò)增產(chǎn)物太長沒有選擇合適的引物退火溫度引物的設(shè)計(jì)有錯(cuò)配模板的序列特殊（比如GC含量高）抑制物的存在本文檔共107頁；當(dāng)前第98頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分2.擴(kuò)增效率為什么會大于100%主要原因：背景污染非特異性擴(kuò)增本文檔共107頁；當(dāng)前第99頁；編輯于星期三\16點(diǎn)14分3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性不好對每個(gè)樣品我們都要做重復(fù)實(shí)驗(yàn)（通常至少為3個(gè)重復(fù)）目標(biāo)是所有復(fù)孔CT值都相近(通常SD值小于0.167