臨床樣本的采集運(yùn)輸和保存及核酸提取演示文稿

臨床樣本的采集運(yùn)輸和保存及核酸提取演示文稿本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第1頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分臨床樣本的采集運(yùn)輸和保存及核酸提取本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第2頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分研究背景一、樣本的采集、處理、保存及運(yùn)輸本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第3頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分臨床標(biāo)本的正確采集、運(yùn)送、保存

的重要性臨床檢驗(yàn)的質(zhì)量保證關(guān)鍵性環(huán)節(jié)解決涉及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的醫(yī)患糾紛的方法之一本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第4頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分（一）、樣本的采集地貧檢測(cè)樣品采集：外周血:≥5mL

臍帶血:0.5~1mL

羊水：20～30mL

絨毛：≥15mg

唾液組織本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第5頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分標(biāo)本采集的注意事項(xiàng)所有標(biāo)本的采集、運(yùn)送和處理應(yīng)在無(wú)菌操作，防止污染的原則下進(jìn)行已采集標(biāo)本都應(yīng)置于防漏、密封的無(wú)菌容器中運(yùn)送采集足夠量標(biāo)本每份標(biāo)本都應(yīng)標(biāo)記患者姓名、送檢號(hào)碼、標(biāo)本來(lái)源、具體部位、日期、時(shí)間及相關(guān)臨床信息本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第6頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分全血以全血作為待測(cè)標(biāo)本時(shí)，必須注意抗凝劑的選擇，一般使用EDTA-Na2或枸椽酸鈉，不可使用肝素全血樣本如用于DNA提取檢測(cè)，可4℃下短期保存,如用于RNA檢測(cè)，則應(yīng)在取血后，盡快提取RNA本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第7頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分血清（漿）DNA測(cè)定，可按照一般的血清標(biāo)本處理程序，對(duì)測(cè)定影響不大RNA測(cè)定，標(biāo)本的獲取和保存方式對(duì)測(cè)定結(jié)果，可能有決定性影響。最好是使用EDTA抗凝(嚴(yán)禁使用肝素)全血標(biāo)本，抗凝后6小時(shí)內(nèi)分離血漿，如使用血清標(biāo)本，則需盡快(2小時(shí)內(nèi))分離血清，標(biāo)本的短期（1～2周）保存可在-20℃下，較長(zhǎng)期保存應(yīng)在-70℃下

本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第8頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分肝素的作用機(jī)理

肝素對(duì)MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和TAQDNA聚合酶均很強(qiáng)的抑制作用，如果臨床標(biāo)本為肝素抗凝，則在核酸純化過(guò)程中，標(biāo)本中的肝素可結(jié)合于DNA和RNA上對(duì)標(biāo)本進(jìn)行煮沸、凝膠過(guò)濾、酸堿處理后凝膠過(guò)濾、反復(fù)乙醇沉淀等均不能去除肝素的這種干擾作用每μg核酸標(biāo)本中加入0.1U的肝素，即可100%的抑制酶活性在標(biāo)本中加入肝素酶I或Ⅱ1~3U/μg核酸在于5mMTrispH7.5,1mMCaCl2,40URNasin25℃下作用2小時(shí)可去除肝素的抑制作用本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第9頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分（二）、樣本的運(yùn)送

樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室樣本中如加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑，如用于DNA測(cè)定的EDTA抗凝血等，則可在室溫下運(yùn)送或郵寄建議：將全血標(biāo)本或DNA樣本用冰袋加泡沫盒快遞運(yùn)送。如需提取RNA的樣本需預(yù)處理后加lmlTrizol在低溫運(yùn)送本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第10頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分（三）、樣本的保存常規(guī)外周血標(biāo)本，采集后做血常規(guī)，常溫24小時(shí)內(nèi)，4℃可保存1周；做血紅蛋白電泳常溫1周，電泳4℃可保存15天；DNA提取樣本常溫24小時(shí)，4℃保存1個(gè)星期，－20℃保存3個(gè)月，－70℃保存半年～3年；RNA提取樣本常溫6小時(shí)，4℃保存12小時(shí)，－70℃保存3個(gè)月，羊水在12小時(shí)內(nèi)離心可保存同上。本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第11頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分研究背景

二、核酸的提取本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第12頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分核酸提取的重要性核酸提取是臨床PCR檢驗(yàn)最為關(guān)鍵的部分，亦是手式操作的主要部分核酸提取的成敗關(guān)系到臨床PCR檢驗(yàn)的正確與否臨床PCR檢驗(yàn)操作中最易出問(wèn)題的環(huán)節(jié)本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第13頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分（一）、提取核酸總的原則

保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類(lèi)分子的污染應(yīng)降低到最低程度；核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子；其他核酸分子，如提取DNA中的RNA，也應(yīng)盡量去除。本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第14頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分（二）、核酸提取的基本步驟1、核酸的釋放：

破裂細(xì)胞釋放核酸機(jī)械法與非機(jī)械法（非機(jī)械法中溶胞法是應(yīng)最廣泛的方法）本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第15頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分各種組織細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法

應(yīng)用

Ⅰ機(jī)械法1.勻漿法機(jī)體軟組織2.搗碎法動(dòng)物韌性組織3.研磨法細(xì)菌、酵母

Ⅱ物理法1.超聲法細(xì)胞混懸液2.反復(fù)凍融法培養(yǎng)細(xì)胞3.冷熱交替法細(xì)菌、病毒4.低滲裂解紅細(xì)胞

Ⅲ化學(xué)法1.有機(jī)溶劑細(xì)菌、酵母、血液2.去垢劑組織、培養(yǎng)細(xì)胞、血液3.酶解法細(xì)菌、酵母、血液本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第16頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分2、核酸的分離與純化：

將含有核酸分子復(fù)雜復(fù)合物中，將核酸與其他物質(zhì)分離非核酸的大分子污染物（蛋白質(zhì)、多糖和脂類(lèi)分子）、非需要的核酸分子、試劑和溶液本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第17頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分3、核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀可去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子加入一定的鹽類(lèi)（醋酸鈉、氯化鈉等）后使用有機(jī)溶劑（如乙醇、異丙醇等）少數(shù)鹽類(lèi)可使用70-75%的乙醇洗滌本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第18頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分

4.核酸的鑒定濃度鑒定純度鑒定完整性鑒定本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第19頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分濃度鑒定DNA：1）紫外分光光度法：測(cè)定DNA在A260nm的光吸收值。如計(jì)算DNA濃度

A260×稀釋倍數(shù)×50＝μg/ml紫外分光光度法只用于測(cè)定濃度大于0.25ug/ml的核酸溶液。(A值等于1時(shí)，相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA，40μg/ml單鏈DNA或RNA，20μg/ml單鏈寡核苷酸）本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第20頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分RNA：紫外吸光光度法:A260×稀釋倍數(shù)×40＝μg/ml(OD260-OD320)×稀釋倍數(shù)×40＝μg/ml

本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第21頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分2）熒光光度法熒光染料溴化乙錠，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強(qiáng)度與核酸含量呈正比。適用于低濃度核酸溶液的定量分析（1-5ng）本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第22頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分EB與DNA的結(jié)合本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第23頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分純度鑒定紫外分光光度法：在260nm和280nm處測(cè)定DAN溶液的光吸收，純的DNAA260與A280之比應(yīng)在1.80(1.60~1.80)，低于此值表明制備物中留有蛋白質(zhì)成份。高于此值表明有RNA的殘留量純的RNAA260與A280之比應(yīng)在2.0(1.80~2.00),Ratio<1.8:蛋白質(zhì)污染;Ratio>2.2:RNA可能已經(jīng)水解成單核苷酸A260/A280比值是純度檢測(cè)的重要指標(biāo)！注：測(cè)定吸光值，稀釋液應(yīng)使用ＴＥ本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第24頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分完整性鑒定凝膠電泳法：基因組DNA電泳，在電場(chǎng)中泳動(dòng)慢，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象；總RNA電泳，觀測(cè)各條帶的含量，提示是否存在RNA降解；如加樣槽中存在條帶，可能是DNA污染。本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第25頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分DNA完整性鑒定：本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第26頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分

正常時(shí)，28SRNA的熒光強(qiáng)度約為18SRNA的2倍，否則提示RNA的降解RNA完整性鑒定：本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第27頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分5、核酸的貯存——DNA保存

1）短期貯存：

4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）緩沖液中。

TE緩沖液的PH與DNA貯存有關(guān)，PH為8時(shí)，可減少DNA脫氨反應(yīng)，PH低于7.0時(shí)DNA容易變性。2）長(zhǎng)期貯存：

TE緩沖液中-70℃保存數(shù)年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止細(xì)菌和核酸的污染。本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第28頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分核酸的貯存——RNA保存：RNA可溶于0.3mol/L的醋酸鈉溶液或雙蒸水，在-70℃保存。RNA可溶于70%的乙醇溶液或去離子的甲酰胺溶液中，可在-20℃保存。RNA如果以DEPC（焦碳酸二乙酯）可以抑制RNA酶對(duì)RNA的降解本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第29頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分三、基因組DNA的分離與純化本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第30頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分（一）、DNA樣品準(zhǔn)備

常見(jiàn)的標(biāo)本：血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)細(xì)胞等生物組織：最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存－70℃或液氮本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第31頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分DNA提取前樣本采集、預(yù)處理和保存：全血抗凝劑：

EDTA-Na2

或枸櫞酸鈉作為抗凝劑不宜使用肝素

抗凝劑處理血肝素檸檬酸*EDTA*-80℃保存2個(gè)月，第10天收率90%4℃第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室溫提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第32頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分（二）、DNA提?。ㄒ唬┓映樘岱ǎ合扔肊DTA、SDS、蛋白酶K破碎細(xì)胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris飽和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或異丙醇進(jìn)行沉淀。獲DNA大小為100－150kb。本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第33頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分酚抽提法提取步驟：本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第34頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分DNA酚抽提法示意圖本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第35頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分主要試劑的作用：

EDTA：1.二價(jià)金屬螯合劑，抑制核酸酶；

2.降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第36頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分SDS的作用：1.溶解膜蛋白和脂肪，從而使細(xì)胞膜破裂2.溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來(lái)3.對(duì)RNA、DNA酶有抑制作用4.與蛋白質(zhì)形成R-O-SO3….R蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第37頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分蛋白酶K：水解蛋白質(zhì)的作用，消化DNA酶和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)蛋白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強(qiáng)的水解能力，而且在SDS、EDTA存在時(shí)仍保持較高活性，可同時(shí)使用本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第38頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分苯酚：蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑、抑制DNA酶活性苯酚溶于有機(jī)溶劑，微溶于水提取DNA前苯酚用Tris-Hcl飽和，防止吸收過(guò)多DNA，降低DNA的損失率氧化苯酚會(huì)破壞DNA本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第39頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分DNA的沉淀：1）無(wú)水乙醇沉淀沉淀前往往加入NaCl等鹽離子，作用是中和核酸分子表面的負(fù)電荷，有助于分子之間的聚集。無(wú)水乙醇可以吸收分子之間的水，使DNA沉淀析出，無(wú)水乙醇使用前冰凍，可以減少DNA沉淀析出過(guò)程釋放熱量對(duì)DNA的損傷。2）異丙醇沉淀除了使DNA沉淀外，還可以溶解少量的小的RNA分子本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第40頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分（二）甲酰胺解聚法：破碎細(xì)胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA。高濃度甲酰胺可以裂解蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物，可以使蛋白質(zhì)變性。減少了酚多次抽提的步驟甲酰胺解聚法適用于從標(biāo)本中制備高分子量的DNA樣品?？傻肈NA200kb左右。本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第41頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分（三）磁珠法：磁珠在高鹽低pH值下吸附核酸，在低鹽高pH值下與核酸分離，再通過(guò)移動(dòng)磁珠來(lái)獲取DNA本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第42頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分（四）微柱法：利用DNA在高鹽、低pH的特定溶液環(huán)境下可吸附在固相介質(zhì)（如硅膠膜）上，洗滌去除雜質(zhì)后，再改變?nèi)芤涵h(huán)境使DNA溶解到純水或TE中本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第43頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分（三）、DNA的濃縮

固體聚乙二醇（PEG）濃縮：用透析袋外敷PEG至合適量丁醇抽提濃縮：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不會(huì)。因此重復(fù)幾次可顯著減少DNA體積本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第44頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分（四）、DNA回收

主要是從電泳中分離回收DNA片段回收原則：盡量提高回收率去除回收DNA樣品中的污染物本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第45頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分DNA降解的原因樣本不夠新鮮，采集材料過(guò)陳舊樣本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的原因？提取的基因組DNA鹽濃度過(guò)高基因組DNA中乙醇未清除凈基因組DNA中可能存在其他抑制因素提取基因組DNA，有時(shí)加入蔗糖的原因加入多糖，保護(hù)DNA長(zhǎng)度影響DNA質(zhì)量的因素本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第46頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分四、RNA的分離與純化

本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第47頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分（一）、樣本來(lái)源理論上所有有核真核細(xì)胞、細(xì)菌、病毒都可以提取RNA樣本選擇取決于試驗(yàn)?zāi)康娜腔蚪M提取RNA最常見(jiàn)的樣本本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第48頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分每個(gè)細(xì)胞的RNA量約為10-5

μg80%-85%rRNA10%-15%tRNA1%-5%mRNA

其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA…本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第49頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分組織材料起始樣品量TotalRNA提取量blood1ml15~20μgleukocytes1×107個(gè)約100μgLivertissue1g約5000μgCulturecells1×107個(gè)約100μgRenaltissue1g約3000μgSkeletontissue1g約1500μgCerebraltissue1g約1500μg本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第50頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分（二）、

RNA提取的獨(dú)特性

—關(guān)于RNase酶臨床標(biāo)本及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中,存在大量對(duì)RNA具有強(qiáng)烈降解作用的RNase，而RNase較耐高溫,不易失活如何避免RNase對(duì)標(biāo)本的污染及防止RNase對(duì)提取的RNA的降解,是保證RNA成功提取的關(guān)鍵之所在本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第51頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分RNase酶RNA易被RNase水解，RNase除胞內(nèi)還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周?chē)沫h(huán)境中RNase具有水解核糖殘基和磷酸二酯鍵RNase分子結(jié)構(gòu)中的二硫鍵使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定，去除變性劑后，RNase的活性又可恢復(fù)本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第52頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分去除RNase的污染及強(qiáng)有力地抑制其活性是RNA制備成功與否的關(guān)鍵必須在總RNA提取分離的最初階段，盡可能地滅活胞內(nèi)RNase的活性1.內(nèi)源性RNA酶（intrinsicRNase）本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第53頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分2.外源性RNA酶(extrinsicRNase)主要來(lái)源：

被污染的緩沖液細(xì)菌或微生物污染，高壓不能去除RNA酶自動(dòng)移液裝置本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第54頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分3.實(shí)驗(yàn)室采取避免RNA酶污染的措施設(shè)置專(zhuān)門(mén)RNA移液裝置小份保存緩沖液設(shè)置專(zhuān)門(mén)的RNA電泳裝置準(zhǔn)備溶液或緩沖液時(shí)，使用無(wú)RNA酶的器皿、

DEPC處理水等分離RNA過(guò)程中使用RNA酶抑制劑本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第55頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分4.RNA酶的去除DEPC（焦碳酸二乙酯）高度活化的烷基化試劑，破壞RNA酶活性。用來(lái)滅活緩沖液或器皿中的RNA酶。

OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O==DEPC水制備：0.1%DEPC在37°C處理1h，并高壓滅菌15min。玻璃制品和塑料制品應(yīng)浸泡在0.1%的DEPC水溶液中，37°C處理1h或室溫下過(guò)夜。DEPC非選擇性的修飾蛋白質(zhì)和RNA，且與一些緩沖液不相容，故在分離和純化RNA的過(guò)程中不使用DEPC本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第56頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分5.RNA提取所用器皿的處理經(jīng)高壓滅菌的一次性使用的塑料制品如試管,離心管等基本上無(wú)RNase,可以不經(jīng)預(yù)處理直接用于制備和貯存RNA實(shí)驗(yàn)室用的普通玻璃器皿經(jīng)常有RNase污染,使用前必須于180℃干烤8小時(shí)以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯,試管和其它用品DEPC是RNase的強(qiáng)烈抑制劑。灌滿(mǎn)DEPC的器皿于37℃下放置2小時(shí)，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于100℃干烤15分鐘，最后高壓蒸汽下15分鐘。上述處理可除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通過(guò)羧甲基化作用對(duì)RNA的嘌呤堿基進(jìn)行修飾本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第57頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分6.RNA提取所用溶液的準(zhǔn)備

對(duì)于RNA提取所需溶液的配制,必須用高壓滅菌的水和RNA研究專(zhuān)用的化學(xué)試劑配制溶液,用干烤過(guò)的藥匙稱(chēng)取試劑,將溶液裝入無(wú)RNase的玻璃器皿?？赡艿脑?huà),溶液均應(yīng)用0.1%DEPC于37℃至少處理12小時(shí),然后于100℃加熱15分鐘或高壓蒸汽滅菌15分鐘須注意的是,DEPC可與胺類(lèi)迅速發(fā)生化學(xué)反應(yīng),因此不能用來(lái)處理含有Tris一類(lèi)的緩沖液,因此可存幾瓶新的,未開(kāi)封的Tris試劑以制備無(wú)RNase的溶液本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第58頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分7.RNA提取中RNase污染的控制實(shí)驗(yàn)操作人員的手是RNase污染最主要的潛在來(lái)源。策略是：在準(zhǔn)備用于RNA純化的實(shí)驗(yàn)材料和溶液時(shí),以及在涉及RNA的整個(gè)提取操作過(guò)程中,都應(yīng)戴一次性手套在RNA提取實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)勤換手套本文檔共65頁(yè)；當(dāng)前第59頁(yè)；編輯于星期日\(chéng)8點(diǎn)32分（三）、用于提取RNA的血樣的處理取新鮮抗凝血2－3ml入15ml無(wú)菌塑料管，600g離心5分鐘，棄上清。加入6倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液（約12ml），輕輕吹打混勻，本步驟在室溫或4度操作均可。裂解時(shí)間至4-5分鐘，并且裂解過(guò)程中宜適當(dāng)偶爾搖動(dòng)以促進(jìn)紅細(xì)胞裂解。600g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。一般情況下，裂解1次紅細(xì)胞應(yīng)該裂解的差不多，如果有較多紅細(xì)胞沒(méi)有裂解的話(huà)，可以再加點(diǎn)紅細(xì)胞裂解液約5ml裂解1次。步驟同3。向得到的細(xì)胞團(tuán)中加T