免疫組化PV二步法與SP三步法比較

免疫組化PV二步法與SP三步法比較【摘要】目的:用兩種不同的免疫組化方法二步法和三步法分別在胃癌組織中進(jìn)行ERα-36染色結(jié)果的比較，尋求不同免疫組化原理的染色試劑盒對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。方法：利用兩種不同的試劑盒研究相同的胃癌微陣列芯片，通過比較兩種免疫組化方法在相同組織上表達(dá)的不同做比較。結(jié)果：三步法制片結(jié)果比二步法背景低，陽性率低，非特異性著色小，結(jié)果明確易讀；而二步法較三步法操作簡單，檢查陽性率高，陽性強(qiáng)度高。結(jié)論：針對(duì)一抗為ERα-36的免疫組化染色，三步法雖然實(shí)驗(yàn)耗時(shí)比較長，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果較好，明確易讀，適合科學(xué)研究。二步法較易出結(jié)果，靈敏度較高，陽性強(qiáng)度高，較易出背景著色，假陽性率高，故不適于科學(xué)研究，但因?yàn)椴僮鞣奖悖瑱z出陽性率較三步法高，對(duì)于ERα-36弱表達(dá)的病例不容易漏診，且能較快出結(jié)果，故可考慮在臨床病理診斷中選擇應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】免疫組化技術(shù);二步法;三步法；組織芯片技術(shù)

免疫組織化學(xué)技術(shù)是利用已知的特異性抗體與抗原的特異性結(jié)合來檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)某種物質(zhì)的性質(zhì)，并利用酶作用于底物所產(chǎn)生的顏色反應(yīng)來顯示某種物質(zhì)的分布于細(xì)胞內(nèi)定位的一種技術(shù)，自建立免疫酶標(biāo)技術(shù)以來，這門技術(shù)得到了迅速發(fā)展，在科研和臨床診斷已被廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)部分胃癌為雌激素受體依賴性［1］。但一張好的免疫組化切片需要真陽性染色結(jié)果表達(dá)在預(yù)期對(duì)應(yīng)的組織細(xì)胞中，定位清晰準(zhǔn)確，間質(zhì)清楚,無或少背景著色［2］。影響免疫組化的結(jié)果有很多，如組織固定、脫水的過程、修復(fù)的好壞以及免疫組化的過程和免疫組化試劑盒的選取以及顯色步驟均對(duì)結(jié)果有影響［3］。目前研究影響免疫組化結(jié)果的因素多從免疫組化試劑盒以外幾方面分析，對(duì)不同原理的試劑盒對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響研究甚少。本研究擬以ERα-36為目的指標(biāo)，觀察免疫組化兩步法和三步法在ERα-36檢測(cè)中的異同，探討兩種方法在使用中的優(yōu)缺點(diǎn)。

1材料和方法

材料

由江漢大學(xué)腫瘤教研室構(gòu)建352點(diǎn)胃癌組織芯片，以正常肝組織作為定位標(biāo)記，芯片直徑㎜，片厚4ｕm。

ERα-36兔抗人多克隆抗體，由Creighton大學(xué)王兆一教授提供，以胞漿著色為陽性。三步法SP超敏試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，二步法PV-9000試劑盒購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

方法

選用已知陽性的正常乳腺組織為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。DAB顯色，染色步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。蘇木素復(fù)染核。

以三步法為例，具體操作

①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化，用PBS沖洗3次，每次3min；

②用EDTA緩沖液浸泡(pH),高壓修復(fù)2min，使抗原暴露；

③每張切片加150μl過氧化酶阻斷溶液，室溫下孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3min；

④除去PBS液，每張切片加150μl正常非免疫動(dòng)物血清，室溫下孵育10min；

⑤除去血清，每張切片加150μl的第一抗體，4℃過夜；

⑥PBS沖洗3次，每次3min，除去PBS液，每張切片加150μl生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫下孵育10min，PBS沖洗3次，每次3min；

⑦除去PBS液，每張切片加150μl鏈霉菌抗生物素-過氧化酶溶液，室溫下孵育10min，PBS沖洗3次，每次3min；

⑧除去PBS液，每張切片加600μl的新鮮配制的DAB，顯微鏡下觀察3～10min；

⑨自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗返藍(lán)或沖洗后用PBS快速返藍(lán)；

⑩梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

兩步法④至⑦步驟與三步法不同，不用正常血清封閉，直接滴加一抗過夜，然后直接滴加聚合了辣根過氧化物酶的特異性二抗，余步驟相同。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用卡方檢驗(yàn)，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)采用完成，P＜為差異有顯著意義。

2結(jié)果

采用免疫組化三步法對(duì)胃癌組織芯片ERα-36進(jìn)行處理后的染色結(jié)果均為漿著色，無核表達(dá)。染色結(jié)果為癌組織顯示棕黃色的顆粒，背景清晰。根據(jù)芯片上顯色結(jié)果的深淺我們對(duì)其進(jìn)行了4個(gè)等級(jí)的評(píng)定：癌細(xì)胞胞漿無著色-;癌細(xì)胞胞漿上出現(xiàn)淡黃色染色顆粒+;癌細(xì)胞的胞漿上出現(xiàn)深棕黃色的染色顆粒為+++；介于+與+++之間染色深度為++。ERα-36的陽性率為(52/111)%，其各個(gè)等級(jí)表達(dá)率見表1。

采用免疫組化二步法對(duì)胃癌組織芯片ERα-36分別進(jìn)行處理后，閱片標(biāo)準(zhǔn)同三步法。結(jié)果均為漿著色，無核表達(dá)。ERα-36的陽性率為(105/111)%，其各個(gè)等級(jí)表達(dá)率見表1。表1二步法與三步法陽性率的比較由表1可見，二步法與三步法各個(gè)等級(jí)免疫組化ERα-36的陽性率存在顯著差異，兩步法高于三步法。

此外，我們通過使用二步法和三步法對(duì)ERα-36進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)，三步法檢測(cè)結(jié)果的背景較二步法低，非特異性著色小，檢查出的陽性率低于二步法，且費(fèi)用相對(duì)較少；但二步法步驟少，耗時(shí)較少，且無內(nèi)源性生物素的干擾，檢出的陽性率高，染色強(qiáng)度高，見表2。表2二步法與三步法比較

3討論

關(guān)于胃癌的ER陽性率國外報(bào)道為23%(免疫組化法)［4］,國內(nèi)外多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)ERα-36在胃癌中表達(dá)。

二步法又稱非生物素酶法。該方法中的第二抗體是將特異性的抗體和辣根過氧化物酶通過一個(gè)多聚糖骨架聯(lián)接成一個(gè)多聚體。PV系列二步法免疫組化檢測(cè)試劑將二抗抗體分子和酶聚合在氨基酸骨架上，形成多聚體，替代傳統(tǒng)方法中的二抗和三抗，直接放大抗原抗體結(jié)合的信號(hào)，避免再使用生物素。然后通過DAB呈色反應(yīng)來觀察抗原表達(dá)部位。

三步法又稱生物素酶法。我實(shí)驗(yàn)室采用SP超敏試劑盒是根據(jù)鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶鏈接系統(tǒng)設(shè)計(jì)的。第二抗體采用生物素標(biāo)記；鏈霉菌抗生物素蛋白是從鏈霉菌中分離出的蛋白質(zhì)，分子量為60KD，它含有四個(gè)亞基，每個(gè)亞基都有與生物素連接的部位，且兩者之間有很強(qiáng)的親和力。SA與過氧化物酶形成SA-過氧化物酶復(fù)合體；生物素化的二抗與SA-過氧化物酶復(fù)合體，可通過DAB的呈色反應(yīng)來顯示抗原抗體結(jié)合部位。

我們對(duì)芯片的染色結(jié)果進(jìn)行比較和討論，發(fā)現(xiàn)用三步法進(jìn)行染色的芯片結(jié)果明確易讀，而二步法陽性率普遍較高，非特異性著色率高。

免疫組化三步法染色非特異性著色率比二步法低的原因可能是:①三步法加一抗前用血清封閉去掉內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾,而PV二步法省了這一步，因此SP三步法非特異性著色率低；②二步法靈敏度高，第一抗體4℃過夜容易導(dǎo)致背景著色。因此，三步法的假陽性率［5］低于二步法，故對(duì)于實(shí)驗(yàn)室研究檢測(cè)ERα-36的陽性表達(dá)率適合采用三步法以避免誤差。但是三步法耗時(shí)較長，步驟較多，對(duì)操作人員要求較高，且對(duì)于陽性表達(dá)率較低的病例不容易檢出，故在這方面二步法比較有優(yōu)勢(shì)，二步法法靈敏度較高，不容易漏診，且無內(nèi)源性生物素的干擾，DAB顯色較快，顧較適合臨床快速診斷使用。我實(shí)驗(yàn)室研究的是胃癌上一抗為雌激素受體ERα-36時(shí)的染色結(jié)果，對(duì)于檢測(cè)其它指標(biāo)二步法和三步法檢測(cè)結(jié)果是否也有顯著性差異還有待于進(jìn)一步研究。

【參考文獻(xiàn)】

1NicolsonGL.Cancermetastasis:tumorcellandhostorganpropertiesimportantinmetastasistospecificsecondaryBiophysActa,1988,948:175~224.

2張銘,司少艷,韓瑞剛，等.免疫組化SP法與PicTureTM兩步法的比較.診斷病理學(xué)雜志,2004,11(1):58~59.

3劉樺,趙靜.病理免疫組化染色方法質(zhì)量控制應(yīng)注意的基本問題.中國煤炭工業(yè)學(xué)雜志,2006,9(12):1246~1247.

4KojimaO,TakhashiT,KawakamiS,etal.localization