第九章 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

第九章酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第一頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四酶促反應(yīng)速度受各種因素影響：底物濃度、酶濃度、溫度、pH值、激活劑、抑制劑等。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速度以及影響酶反應(yīng)速度的各種因素的科學(xué)。Thestudyofenzymekineticsaddressesthebiologicalrolesofenzymaticcatalystsandhowtheyaccomplishtheirremarkablefeats.意義？第二頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四第一節(jié)概念一、反應(yīng)速率：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)反應(yīng)物或生成物的濃度變化，通常用瞬時(shí)速率表示反應(yīng)速率。V=-dc/dt，負(fù)號(hào)表示反應(yīng)物濃度的減?。换騰=+dc/dt二、反應(yīng)分子數(shù)：是在反應(yīng)中真正相互作用的分子數(shù)目。一般為單分子反應(yīng)，2分子反應(yīng)，3分子少見，大于3分子未發(fā)現(xiàn)。第三頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四元素衰變，分子重排，異構(gòu)體互變是單分子反應(yīng)，符合：v=dc/dt=kc,其中c為mol/l,k是比例常數(shù)，謂之反應(yīng)速率常數(shù)。單位：s-1雙分子反應(yīng)很多，符合v=dc/dt=kc1c2,c1,c2分別代表兩種反應(yīng)物的濃度。即與A、B成正比第四頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四三、反應(yīng)級(jí)數(shù)：根據(jù)整個(gè)化學(xué)反應(yīng)的速率服從哪種分子反應(yīng)速率方程式，則這個(gè)反應(yīng)即為幾級(jí)反應(yīng)。如果反應(yīng)速率能用單分子反應(yīng)的速率方程式表示，該反應(yīng)即為一級(jí)反應(yīng)；反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度無(wú)關(guān)的反應(yīng)謂之零級(jí)反應(yīng)。凡是反應(yīng)速率能用雙分子速率方程描述，則為二級(jí)反應(yīng)。第五頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四但還需要區(qū)別對(duì)待，如蔗糖水解：蔗糖+H2O葡萄糖+果糖，由于稀溶液水比蔗糖多的多，故可以視為一級(jí)反應(yīng)。故反應(yīng)速率只決定于蔗糖濃度：v=kcsucrose。四、各級(jí)反應(yīng)的特征:一級(jí)反應(yīng)：反應(yīng)速率只與反應(yīng)物濃度一次方成正比的反應(yīng)。t1/2為一般反應(yīng)物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物所需要的時(shí)間，謂之半衰期一級(jí)反應(yīng)半衰期與初始濃度無(wú)關(guān)，與速率常數(shù)成反比。第六頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四第七頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四二級(jí)反應(yīng)：反應(yīng)物濃度二次方或兩個(gè)反應(yīng)物濃度乘積成正比的反應(yīng)。最常見的反應(yīng)。二級(jí)反應(yīng)半衰期與初始濃度成反比，即初始濃度越大則半衰期越短，這是二級(jí)反應(yīng)的重要特征。零級(jí)反應(yīng)速率與初始濃度無(wú)關(guān)，半衰期與初始濃度成正比，即初始濃度越高，則半衰期越長(zhǎng)。第八頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四第二節(jié)底物濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響一、中間復(fù)合物學(xué)說(shuō)Henri1903年蔗糖酶水解實(shí)驗(yàn)：酶濃度不變，改變底物濃度，開始為一級(jí)反應(yīng)，中間為混合級(jí)反應(yīng)，最后，底物濃度無(wú)論如何增加，反應(yīng)速率不再增加，為零級(jí)反應(yīng)。表明酶可以被飽和，形成中間產(chǎn)物：S+EESP+E。正比關(guān)系非正比不再增加速率第九頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四底物對(duì)酶促反應(yīng)的飽和現(xiàn)象第十頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四證據(jù)：EM和X-raydiffractionobservation，如DNApolymeraseI；熒光光譜的變化p356；物理性質(zhì)如溶解度在形成復(fù)合物后產(chǎn)生變化；分離得到胰凝乳蛋白酶和底物復(fù)合物的結(jié)晶；透析和超速離心證據(jù)第十一頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四二、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式1913年，德國(guó)化學(xué)家Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)對(duì)酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，推導(dǎo)出了表示整個(gè)反應(yīng)中底物濃度和反應(yīng)速度關(guān)系的著名公式，稱為米氏方程。

1925,BriggsandHaldane修正：根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)，酶促反應(yīng)分兩步進(jìn)行:第十二頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四第十三頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四第十四頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四總的酶量第十五頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四當(dāng)反應(yīng)速度等于最大速度一半時(shí),即V=1/2Vmax,

Km=[S]上式表示,米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為最大值的一半時(shí)的底物濃度。單位是mol/L第十六頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四第十七頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四2.動(dòng)力學(xué)參數(shù)的意義米氏常數(shù)的意義：1）它是酶的一個(gè)重要的特征物理常數(shù)，其大小與酶的性質(zhì)有關(guān)而與酶濃度無(wú)關(guān)。Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測(cè)定的，不同條件下具有不同的Km值。不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個(gè)重要的特征物理常數(shù)。2)Km可以判斷酶的專一性和天然底物。一個(gè)酶有幾個(gè)底物，就由幾個(gè)Km，其中Km最小的底物為其最適底物，即天然底物。第十八頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四3）根據(jù)Km=(k2+k3)/k1,若k3<<k2時(shí)，Km=Ks，則ES分解即為反應(yīng)的限速步驟，此時(shí)，Km值表示酶與底物之間的親和程度：成反比關(guān)系，Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。4）如果已知Km，可以計(jì)算某一底物濃度下，反應(yīng)速率相當(dāng)于Vmax的百分率，生產(chǎn)上，底物濃度太小，不經(jīng)濟(jì)，太大浪費(fèi)底物。當(dāng)v=Vmax時(shí)，反應(yīng)速率與[E0]成正比，如果某一酶Km已知，則任何底物下，酶被底物飽和百分?jǐn)?shù)為：fES=v/Vmax=[S]/(Km+[S])第十九頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四5)根據(jù)Km大小，可以判斷某一代謝途徑的方向和途徑。GDH之NAD+Km=2.5x10-5；NADH為1.8x10-5對(duì)于一系列反應(yīng)來(lái)說(shuō)，Km大小可以判斷反應(yīng)的限速步驟。6)可用于判斷反應(yīng)級(jí)數(shù)：當(dāng)[S]<0.01Km時(shí)，反應(yīng)為一級(jí)反應(yīng)；當(dāng)[S]>100Km時(shí)，ν=Vmax，反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)；當(dāng)0.01Km<[S]<100Km時(shí)，為混合級(jí)反應(yīng)。Vmax的意義：同一種酶，但底物不同，則Vmax也不同，并且受pH，溫度，離子強(qiáng)度的影響。第二十頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四當(dāng)S很大時(shí)，Vmax=k3[E]，此時(shí)，酶被底物飽和，k3表示酶被底物飽和時(shí)，每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)，又謂之轉(zhuǎn)換數(shù)（TN），又常常被稱為催化常數(shù)kcat.kcat數(shù)值越大，則酶的催化效率越高。生理?xiàng)l件下，大多數(shù)酶不會(huì)被底物所飽和，[S]/Km一般介于0.01-0.1之間，根據(jù)Vmax=k3[ET]=kcat[ET],當(dāng)[S]<<Km,則有：顯然kcat/Km是E和S反應(yīng)形成產(chǎn)物的二級(jí)速率常數(shù)。第二十一頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四3.Km和Vmax的求法，米氏方程的作圖：基本原則：將米氏方程變化成相當(dāng)于y=ax+b的直線方程，再用作圖法求出Km。ByrearrangementsoftheM-Meq,thehyperbolicCurvecanbetransformedintoastraight-lineequation.Thesetransformationinclude(1)theLineweaver-Burkdouble-reciprocalplot,thebestknowtransformation1v=KmVmax1[S]Vmax1+第二十二頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四第二十三頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四(2)AnotherrearrangementoftheM-MequationistheHanes-Woolfplotbymultiplyingtheequationby[S]givesGraphing[s]/vvs[S]yieldsastraightlinewheretheslopeis1/Vmax,they-interceptis

Km/Vmax,andthex-interceptis–Km.第二十四頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四第二十五頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四酶的Km在實(shí)際應(yīng)用中的意義鑒定酶：通過(guò)測(cè)定Km，可鑒別不同來(lái)源或相同來(lái)源但在不同發(fā)育階段，不同生理狀態(tài)下催化相同反應(yīng)的酶是否是屬于同一種酶。判斷酶的最適底物（天然底物）。計(jì)算一定速度下底物濃度。了解酶的底物在體內(nèi)具有的濃度水平。判斷反應(yīng)方向或趨勢(shì)。判斷抑制類型三、多底物反應(yīng)酶促動(dòng)力學(xué)酶促反應(yīng)有單底物，雙底物和三底物三種類型p364如果是：A+BP+Q，是最重要的類型按照反應(yīng)機(jī)制，多底物反應(yīng)分為：1.序列反應(yīng)(sequentialreaction)，即底物的結(jié)合和產(chǎn)物的釋放有一定的順序：第二十六頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四有序反應(yīng)orderedreactions,OrderedBiBi隨機(jī)反應(yīng)：randomreactions,Random,BiBi乙醇脫氫酶肌酸激酶第二十七頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四2.乒乓反應(yīng)PingPangreactions特點(diǎn)是在酶同A的反應(yīng)產(chǎn)物P是在酶同第二個(gè)底物B反應(yīng)前釋放出來(lái)，酶變?yōu)樾揎椕窫’，再同底物B反應(yīng)生成產(chǎn)物Q，酶恢復(fù)原狀。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶第二十八頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四第三節(jié)酶的抑制作用1.酶的失活作用：指使酶蛋白變性二導(dǎo)致的酶活性喪失作用。定義：在一定的物理化學(xué)或生物因素作用下，使酶的活性降低或喪失的現(xiàn)象，稱為酶的抑制作用。能夠引起酶的抑制作用的化合物則稱為抑制劑。抑制劑并非變性劑，抑制劑具有不同程度的選擇性。酶的抑制劑一般具備兩個(gè)方面的特點(diǎn)：

a.在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與被抑制的底物分子或底物的過(guò)渡狀態(tài)相似。

b.能夠與酶以非共價(jià)或共價(jià)的方式形成比較穩(wěn)定的復(fù)合體或結(jié)合物。第二十九頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四一、抑制作用的類型

非專一性不可逆抑制劑專一性不可逆抑制劑定義：酶必需基團(tuán)與抑制劑共價(jià)結(jié)合不能以透析、超濾等物理方法使酶活性恢復(fù)[E]不可逆抑制劑第三十頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑可逆抑制劑非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑可逆抑制劑和不可逆抑制劑的區(qū)別：非共價(jià)；動(dòng)力學(xué)：以v對(duì)[E]作圖，不可逆抑制劑曲線整體向右移動(dòng)，可逆抑制劑速率降低。其特點(diǎn)是抑制劑與酶活性基團(tuán)非共價(jià)結(jié)合，可以使用透析或超濾的方法使酶活性恢復(fù)，是可逆的Doseeffect第三十一頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四四、可逆抑制作用動(dòng)力學(xué)1.競(jìng)爭(zhēng)性抑制：抑制劑與底物競(jìng)爭(zhēng)與酶的同一活性中心結(jié)合，從而干擾了酶與底物的結(jié)合，使酶的催化活性降低，稱為競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。

Km變大，Vmax不變第三十二頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四第三十三頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四特點(diǎn)：⑴競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑往往是酶的底物類似物或反應(yīng)產(chǎn)物；⑵抑制劑與酶的結(jié)合部位與底物與酶的結(jié)合部位相同；⑶抑制劑濃度越大，則抑制作用越大；但增加底物濃度可使抑制程度減??；⑷動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Km值增大，Vmax值不變。例子：磺胺類藥物等對(duì)氨基苯甲酸對(duì)氨基苯磺酰胺第三十四頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四第三十五頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四2.非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑noncompetitiveinhibition,抑制劑既可以與游離酶結(jié)合，也可以與ES復(fù)合物結(jié)合，使酶的催化活性降低，稱為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。Vm[S]·v=(Km+[S])(1+[I]Ki）Km不變，Vmax降低Non-subtractbindingsite第三十六頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四第三十七頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四mixedinhibition,thebindingofIinfluencethebindingofS,whichproduce:第三十八頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四特點(diǎn)：⑴非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)不一定與底物的分子結(jié)構(gòu)類似；⑵底物和抑制劑分別獨(dú)立地與酶的不同部位相結(jié)合；⑶抑制劑對(duì)酶與底物的結(jié)合無(wú)影響，故底物濃度的改變對(duì)抑制程度無(wú)影響；⑷動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Km值不變，Vmax值降低。例子：Leu是Arg合成酶的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，某些重金屬離子對(duì)酶的抑制作用如：Ag+,Cu2+,Pb2+,Hg2+3.反競(jìng)爭(zhēng)性抑制uncompetitiveinhibition抑制劑不能與游離酶結(jié)合，但可與ES復(fù)合物結(jié)合并阻止產(chǎn)物生成，使酶的催化活性降低，稱酶的反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。第三十九頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四Km變小，Vmax變小第四十頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四特點(diǎn)：⑴反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)不一定與底物的分子結(jié)構(gòu)類似；⑵抑制劑與底物可同時(shí)與酶的不同部位結(jié)合；⑶必須有底物存在，抑制劑才能對(duì)酶產(chǎn)生抑制作用；抑制程度隨底物濃度的增加而增加；⑷動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Km減小，Vmax降低。例子：肼類化合物抑制胃蛋白酶，氰化物抑制芳香硫酸酯酶。KIandKI’Alsofinditinp373第四十一頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四五、重要的抑制劑1.不可逆抑制作用：（1)非專一性不可逆抑制劑：有機(jī)磷-與酶活性中心Ser羥基結(jié)合。膽堿酯酶；有機(jī)汞、砷-作用與Cys之巰基，如路易斯毒氣；重金屬：蛋白變性失活；烷化試劑，多種基團(tuán)；氰化物、硫化物和CO與酶的金屬離子作用；青霉素：與糖肽轉(zhuǎn)肽酶活性中心ser殘基結(jié)合第四十二頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四第四十三頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四(2)專一性不可逆抑制劑：Ks型不可逆抑制劑，具有底物類似結(jié)構(gòu)，與酶專一性結(jié)合，其含有的活潑化學(xué)基團(tuán)，可以對(duì)酶活性中心進(jìn)行化學(xué)修飾，產(chǎn)生抑制效應(yīng)。由于抑制是通過(guò)對(duì)酶的親和力來(lái)對(duì)酶進(jìn)行修飾標(biāo)記的，故稱之為親和標(biāo)記試劑affinitylabelingreagent.第四十四頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四Kcat型不可逆抑制劑:抑制劑不但具有天然底物的類似結(jié)構(gòu)，本身也是酶的底物，酶與之結(jié)合后，導(dǎo)致抑制劑潛伏反應(yīng)基團(tuán)暴露或活化，并與酶活性中心必需基團(tuán)作用，產(chǎn)生抑制效應(yīng)。專一性極高，謂之自殺性底物。第四十五頁(yè)，共五十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四2.可逆抑制劑5FU抑制胸腺嘧啶合成酶；磺胺類藥物二氫葉酸合成酶過(guò)渡態(tài)類似物：烯醇式丙酮酸是LDH，ODH，PC催化過(guò)程的過(guò)渡態(tài)，草酸是烯醇式丙酮酸的類似物，可強(qiáng)烈